тварин. Наприклад, одним з головних об’єктів генетичних досліджень на молекулярному

рівні є кишкова паличка (Exherichia coli), котра входить до складу мікрофлори кишечника

людини. В генно-інженерних експериментальних дослідженнях над геномом палички вона

може набути неочікуваних патогенних властивостей. В процесі еволюції ця паличка

глибоко пристосувалася до активної життєдіяльності в кишечнику людини і зрозуміло

буде добре почуватися в ньому, коли випадково потрапить туди з якихось причин

(наприклад, через елементарну необачність), але вже з набутими патогенними

властивостями. Якщо така паличка виявиться не чутливою до антибіотиків, організм

людини не зможе протистояти цьому штучно створеному, новому збуднику хвороби,

котрий розповсюджуватиметься у відповідній популяції людей із закономірністю

ланцюгової реакції. Такі побоювання примусили провідних учених у галузі молекулярної

біології та генетики зібратись у 1974 році у США на міжнародну конференцію, і

розробити правила виконання дослідних робіт з генної інженерії, які включають

можливість потрапляння піддослідних мікроорганізмів в організм працюючих з ними

людей, а також у зовнішнє середовище.

6

2. Методи генетичної інженерії

2.1. Явище генетичної трансформації

Методи генетичної інженерії забезпечують неконтрольоване перенесення генів у

процесі створення нових генетичних програм у науково-дослідній чи виробничій

діяльності людини, їх можна застосовувати на різних рівнях функціонування живих

систем.

Перенесення генів за допомогою сумарних ДНК. Під сумарними ДНК розуміють

сукупність генів, локалізованих у молекулах або окремих ділянках молекул ДНК.

Класичним прикладом перенесення сумарних ДНК із клітин одних організмів у клітини

інших – явище генетичної трансформації.

Вивчаючи вплив стрептококів (Streptococcus pneumoniae) на здоров’я мишей Ф.

Гриффінс у 1928 році опублікував працю, в якій обговорювались результати проведених

ним дослідів. Було встановлено, що S pneumoniae, котрі є збудниками пневмонії у людей,

патогенні й для мишей.

Якщо пневмококу інфекцію ввести в організм миші, то протягом доби тварина

гине, а в її крові виявляється величезна кількість цих бактерій. Вирощені на

спаризованому поживному середовищі їхні колонії утворювали нормальні, гладенькі

плями. Тому даний штам пневмококів позначили символом S (від англ. smooth –

гладенький).

Розмноження S-пневмококів показало, що серед них спонтанно виникають

мутантні клітини, які започатковують утворення нерівних, кострубатих колоній. Тому

виділений мутантний штам позначили символом R (від англ. rough – шорсткий,

кострубатий). Ін’єкції R-пневмококів в організм мишей не спричинювали в них

захворювання.

Цитологічне вивчення морфології клітин пневмококів показало, що клітини S-

штаму мають полісахаридну капсулу, яка захищає їх від згубної дії антитіл, ферментів та

інших захисних систем інфікованих мишей. Клітини ж R-мутантів __________не мають такої

капсули, тому потрапляючи в організм мишей, вони гинуть під дією захисних систем цих

тварин. На рис. Х.1 (див. додат.) наведені схеми виживання й загибелі пневмококів та

інфікованих ними мишей. Найнеочікуваніші результати одержали при введенні мишам

суміші живих непатогенних R-пневмококів з S-пневмококами вбитими нагріванням.

З’ясувалось, що миші захворювали і через добу після інфікування гинули, а в крові

загиблих тварин з’являлись пневмококи S-штаму (рис. Х.1, г (див. у додаток №1)). Разом з

цим введенні мишам окремо вбиті S-пневмококи не збуджували захворювання (рис. Х.1,

7

в). Отже, закономірно виникло питання, як ожили S-пневмококи, які були введені

мертвими в організм мишей.

Оскільки дослідження показали, що вбиті нагріванням пневмококи не могли

ожити, Гриффінс дійшов висновку, що присутність в крові мишей мертвих S-бактерій

спричинила трансформацією живих R-бактерій (у даному разі під трансформацією

розуміють здатність речовин спадковості мертвих S-клітин виділятись, проникати і

вбудовуватись у живі клітини R-мутантів, у складі яких вони відновлюють свою

генетичну функцію, тобто у складі генотипів живих R-мутантів відновлюється S-

фенотип).

Протягом довгого часу залишалось невідомим, з чого складається речовина, яка

трансформується в бактерії. І тільки в 1944 році О. Ейлері, К.М. Маклеод та М. Маккартні

отримали докази того, що речовиною, яка трансформується, є ДНК. Подальші

дослідження не тільки підтвердили висновки цих вчених, але й показали, що процес

трансформації відбувається лише в компетентних бактеріальних клітинах, тобто клітинах,

здатних захоплювати ДНК в оточуючому середовищі і включати її до складу власних

геномів. Невдовзі після завершення поділу клітин у пневмококів настає стан

компетентності, або чутливості, до ДНК. Через деякий час клітини знову повертаються у

стан некомпетентності, оскільки період компетентності в клітинному циклі бактерії

відносно короткий. У дослідах було встановлено, що трансформують лише двониткові

спіралі, а денатуровані, однониткові молекули ДНК з донорних клітин пневмококів

трансформації не викликають.

За деякими іншої публікації в Eucaryotic Genes (1983), у хворого на таласемію

(аномалії кровотворення) взяли пункцію кісткового мозку і розмножили кровотворні

клітини. Спочатку в культуру цих клітин ввели ДНК з домінантним геном, який

забезпечує нормальний процес кровотворення і має ген стійкості до метатриксату, потім

хворому були введені клітини з культури, а після – вводили метатриксату. Під дією

останнього хворі кровотворні клітини гинули, їхнє місце займали введенні

трансформовані клітини свого організму, які внаслідок трансформації набули здатності

виконувати функцію нормального кровотворення.

2.2. Метод трансдукції

Крім трансформації, в генетичній та генній інженерії для перенесення генів з одних

клітин в інші часто застосовують методи трансдукції. В даному разі певний фрагмент

ДНК геному клітини – донора з’єднується з ДНК вірусу, який переносить цей фрагмент у

8

реципієнтну клітину. Було з’ясовано, що розміри фрагментів ДНК кишкової палички, які

переносяться вірусами, складають 2% кількості ДНК геному клітини-господаря.

Наприклад, мутантні клітини E.coli, не здатні збуджувати цукор-лактозу,

характеризуються генотипом lac–. Якщо вірусними частками інфікувати клітини E. coli

lac+, клітини-господарі іноді приєднуються до ДНК вірусу і переносяться в іншу клітину.

Ген lac+, захоплений вірусною часткою і перенесений в клітину lac – шляхом рекомбінації

або вбудовуванням всієї ДНК вірусу в геном клітини реципієнта, відновлює здатність цієї

клітини зброджувати лактозу. Отже, процеси трансфукції здатні відновлювати

функціональну активність генотипів, пригнічених мутаціями генів.

Перенесення генів за допомогою хромосом. До методів генетичної інженерії

відносять також перенесення цілих хромосом або хромосомних фрагментів із

сукупностями локалізованих у них генів з одних клітин в інші. З’ясувалось, що при

введені метафазних хромосом в чужорідні клітини гени цих