В умовах хронічного експерименту були вивчені детоксикаційні ефекти препарату при інгаляційному введенні експериментальним тваринам формальдегіду, формаліну, бензолу, ДДТ у дозах п'ятикратним Пдкрз (ДСТ 12.1.005-88). Починаючи з 30-ої доби, тварини, крім токсикантів одержували Протефлазід у дозі Lim ac. На 121 добу тварини виводилися з експерименту.

Аналіз гемограми, функціонального стану печінки, біохімічних показників функціонального стану нирок дозволяють зробити висновок, що в умовах тривалого введення екотоксикантів Протефлазід істотно поліпшує показники крові, детоксикаційну функцію печінки та нирок, сприяє адаптації організму до несприятливих впливів.

Механізми фармакологічної дії препарату

Хіміотерапевтичний індекс

Для визначення максимально переносимої концентрації (МПК) препарату Протефлазід використовували клітини МДВК (перевіваємі клітини нирки теляти). МПК препарату відповідала 6.8 мкг/мл, що збігалося з концентрацією спирту. Тому, МПК Протефлазіду (6.8 мкг/мл), імовірно, значно вище.

Хіміотерапевтичний індекс (ХТІ) Протефлазіду стосовно вірусу везикулярного стоматиту визначали шляхом установлення співвідношення МПК до мінімально активної концентрації (МАК), що являє собою мінімальну кількість препарату, що гальмує розвиток вірус специфічного ЦПД на 50 %. Для визначення МАК тест-вірус у дозі 100 ТЦД50/0,1 мл вносили в культуру клітин МДВК і інкубували протягом 1 години при 37о С. Після адсорбції вірусу на клітинах, його видаляли і клітини відмивали живильним середовищем 199, після чого в підтримуюче середовище (RPMI-1640 + 2 % фетальної сироватки) вносили Протефлазід у концентраціях від 0.85 до 0.05 мкг/мл. Відсутність ЦПД у досліді, при наявності його в контролі, дозволило виявити МАК препаратів (таблиця 3).

Таблиця 3. МАК Протефлазіду у відношенні вірус везикулярного стоматиту

Концентрація препарата, мкг/мл Титр віруса, lg TЦД50 Ингібіруюча активність, lg ID50

0.85 0 5.0

0.425 0 5.0

0.212 0 5.0

0.101 2.0 3.0

0.05 3.0 2.0

контроль віруса 5.0 -

Відповідно до методичних рекомендацій, речовина чи препарат вважають проявляючим активність при зниженні рівня репродукції вірусу на 2.0 lg і більше, отже, МАК Протефлазіду відповідають 0.05 мкг/мл. Результати визначення МПК, МАК і ХТІ представлені в таблиці 4.

Таблиця 4. Результати визначення МПК, МАК і ХТІ Протефлазіду

Препарати МПК, мкг/мл МАК, мкг/мл ХТІ

Протефлазід 6.8 0.05 136

Спиртовий р-р, 91% 0.91 - -

Як видно з представленої таблиці 4, показники МПК, МАК і ХТІ дозволяють віднести препарат Протефлазід до високоактивних антивірусних препаратів.

Антигерпетична активність Протефлазіду

Антигерпетичну активність (ВПГ-1) препарату вивчали на моделі герпесвірусного менінгоенцефаліту в білих мишей. Дана модель зручна для оцінки виразності симптоматики, відрізняється 100 % відтворюваністю і не вимагає застосування додаткових контролів. Розвиток клінічних симптомів захворювання в контролі починався на 5-6-у добу з моменту інфікування, досягав максимуму до 13-14 доби і далі відзначалося зменшення виразності симптоматики з наступним клінічним видужанням тварин, що вижили. Наявність гострої герпетичної інфекції підтверджувалася за допомогою имунофлюоресценції. Так, найбільш інтенсивне світіння спостерігалося в тканинах головного мозку (особливо в стовбурних відділах), що з'являлося через 6-7 діб з моменту інфікування, що відповідає моменту появи клінічних ознак захворювання. Менш інтенсивне світіння (+ чи ++) відзначалося в селезінці і було відсутнє в печінці і легенях. Летальність тварин, інфікованих вірусом герпесу простого, складала 100 %.

Для моделювання експериментальної герпетичної інфекції використовували вірус герпесу простого 1 типу. Вірус пройшов у лабораторії 24 пасажа через мозок білих мишей.

Вірусовміщуючий матеріал уводили мишам усередину мозку в обсязі 0.03 мл. Величина дози, що заражає, у дослідах дорівнювала 1-10 LD50 (мишачих летальних доз).

Інфекційну активність вірусу герпесу вивчали по летальності тварин і інфекційному титру вірусу в мозковій тканині мишей.

Антигерпетичну активність (ВПГ-2) препарата вивчали на моделі генітальної герпетичної інфекції морських свинок, що відтворювали шляхом зараження останніх вірусовміщуючою рідиною з інфекційним титром 5.0-5.5 lg ТЦД50/мл за методикою запропонованою С.С. Маренніковой [12]. Вірусовміщуючу рідину наносили на попередньо скарифіковану шкіру penis. Скарифікацію проводили за допомогою хірургічного ланцета, після того як тварини були анестезовані ефіром. Розмір поверхні скарифікації дорівнював 4-7 мм2. Вірусовміщуючу рідину вводили за допомогою піпетки відразу після скарифікації (з наступним утиранням). Клінічні симптоми експериментального герпесу геніталій реєстрували щодня перед проведенням лікування і спостерігали протягом усього періоду хвороби.

Критеріями оцінки тяжкості інфекційного процесу були поверхня і ступінь специфічних поразок, наявність набряку, гіперемії, орхіту. Максимальна виразність кожної ознаки складала 4 бали. Спостереження за тваринами проводили протягом 21 дня. Кожна досліджувана група складалася з 3 тварин.

Розчин Протефлазіду в дозі 6.8 мкг/мл і 0.68 мкг/мл наносили на скарифіковану і заражену поверхню 1 раз на добу протягом 5 днів. Як референс-препарат використовували мазь віролекс фірми KRKA (Словенія), що наносили так само як досліджуваний препарат Протефлазід: аплікації на поверхню рани щодня протягом 5 днів.

Лікування з використанням Протефлазіду і віролексу починали через 2 години після інфікування.

Віруси простого герпесу володіють кератотропними властивостями і викликають офтальмовірусну патологію при зараженні на роговицю ока. Найбільш придатним і доступним видом тварин для цих цілей є кролики. Ця модель зручна й інформативна, тому що легко відтворюється, близька до клінічної картини захворювань у людей, дає чіткі результати терапевтичної ефективності, що корелюють із противірусною активністю випробуваної речовини, встановленої в культурі клітин і на мишах. Використовували молодих кроликів породи "шиншилла" з масою тіла 2-2.5 кг. Герпетичний кератит викликали в такий спосіб. Перед зараженням ока анестезували закапуванням у кон"юктивальний мішок 0.5 % розчину дикаіна. Потім фіксували очне яблуко. Гострою голкою наносили поверхневі лінійні насічки (у шарі епітелію) у виді 3 взаємно перпендикулярних смуг. Для зараження використовували 10 % суспензію мозку інфікованої вірусом герпесу миші. Вірусовміщуючий матеріал наносили на ушкоджене місце в кількості 0.01 мл. Віка щільно стуляли і злегка втирали