Перший прояв інфекційного процесу виражався в утворенні дрібних пухирців уздовж насічок на роговиці, що незабаром зливалися, утворюючи поразки, що нагадують гілочку. Звичайно на роговиці з'являлися 2-3 такі гілочки.

Лікування з використанням розчинів Протефлазіду концентрацією 6.8-0.68 мкг/мл починали через 24 години після інфікування, щодня 1 раз на добу закапували протягом 3 днів. Усього в досліді було 3 групи тварин по 3 кролика в кожній групі:

1 - кролики, роговицю яких заражали вірусом герпесу,

2 - кролики, заражені вірусом герпесу + лікування Протефлазідом у концентрації 6,8 мкг/мл

3 - кролики, заражені вірусом герпесу + лікування Протефлазідом у концентрації 0,68 мкг/мл.

Вивчення антигерпетичної активності препарату Протефлазід у досвідах in vitrо

Для вивчення антивірусної активності Протефлазіду використовували культуру клітин, що перевивається, Vero (клітини нирки мавпи). Клітини вирощували в плашках на середовищі RPMI-1640+10 % фетальної сироватки (Nunclon, Surface, Denmark) при температурі 37о С в термостаті з подачею СО2.

Використовували вірус герпесу 1-го типу, штам VC (ВПГ), інфекційний титр - 6.5 lg ТЦД50.

Для вивчення антивірусної активності використовували добові культури клітин Vero із суцільним моношаром клітин. Середовище росту зливали, на моношар клітин наносили препарат Протефлазід у різних концентраціях або вірус герпесу в залежності від модифікації експерименту. Через 1 годину контакту неадсорбувавшийся вірус герпесу видаляли й у лунки вносили підтримуюче середовище (живильне середовище без сироватки).

Наступного дня в лунки плашок, що інкубувались з різними розведеннями препарату Протефлазід вносили вірус герпесу в дозі 100 ТЦД50 , а в лунки, що були інфіковані вірусом герпесу, вносили різні розведення препарату. Культури інкубували в термостаті з подачею СО2 протягом 5 діб щодня мікроскопіруя і відзначаючи репродукцію вірусу по цитопатичній дії ВПГ на клітини Vero у порівнянні з контрольними культурами, де моношар не піддавався ніяким впливам.

Цитопатична дія ВПГ на клітини морфологічно виявляється в утворенні симпластів чи округлих клітин у сполученні з проліферацією і гігантськими багатоядерними клітинами.

Через 5 діб культуральне середовище з лунок плашок збирали і визначали інфекційний титр у кожній пробі при профілактичній і лікувальній дії препарату. Результати репродукції ВПГ при профілактичному і лікувальному введенні препарату представлені в таблицях 5,6.

Таблиця 5. Профілактична дія Протефлазіду на репродукцію ВПГ у культурі клітин Vero

Концентрація препарату мкг/мл Вірус герпесу 100 ТЦД50 Інфекційний титр у lg ТЦД50 Ингібіруючий інфекційний титр у lg ТЦД50

6.8 + 0 6.0

3.2 + 1.0 5.0

1.7 + 2.0 4.0

0.85 + 2.0 4.0

0.425 + 2.0 4.0

0.212 + 2.0 4.0

0 + 6.0 -

Таблиця 6. Лікувальна дія Протефлазіду на репродукцію ВПГ у культурі клітин Vero

Концентрація препарату мкг/мл Вірус герпесу 100 ТЦД50 Інфекційний титр у lg ТЦД50 Інгібіруючий інфекційний титр у lg ТЦД50

6.8 + 0 6.0

3.2 + 1.5 4.5

1.7 + 2.0 4.0

0.85 + 2.0 4.0

0.425 + 2.0 4.0

0.212 + 3.0 3.0

0 + 6.0 -

Аналізуючи результати, представлені в таблицях 5 і 6, слід зазначити, що при профілактичному і лікувальному впливі різних концентрацій Протефлазіду (від 6.8 до 0.212 мг/мл) відзначалася виражена противогерпетична активність.

Вплив препарату Протефлазід на мітотичний режим і хромосоми кліток ЧЕТ, заражених вірусом герпесу

Вплив Протефлазіду на мітотичний режим і хромосоми проводили в первинно-тріпсінізованій культурі клітин, що заражали вірусом герпесу (ВПГ-1 типу). Були вивчені наступні групи:

контроль культури клітин (негативний контроль);

зараження вірусом герпесу;

одномоментне зараження ВПГ + препарат у дозі 6.8 мкг/мл;

одномоментне зараження ВПГ + препарат у дозі 0.68 мкг/мл.

Результати представлені в таблиці 7.

Таблиця 7. Вплив Протефлазіду на мітотичний режим людських ембріональних клітин

Вплив на клітини Мітотичний індекс, % Аномальні мітози, % Багатоядерні клітини, %

Протефлазід, концентрація 6.8 мкг/мл +ВПГ 15.3 ± 0.3 4.4 ± 0.2 -

Протефлазід, концентрація 0.68 мкг/мл +ВПГ 16.3 ± 0.3 8.6 ± 0.2 -

Інтактні клітини 16.0 ± 0.3 6.25 ± 0.2 -

Вірус герпесу 10.6 ± 0.3 23.6 ± 0.4 0.2

Протефлазід 6.8 мкг/мл 15.6 ± 0.3 4.2 ± 0.2 -

Протефлазід 0.68 мкг/мл 15.3 ± 0.3 6.1 ± 0.2 -

Зараження клітин вірусом герпесу приводило до зниження мытотичного індексу клітин (10.6 %) і збільшенню числа патологічних форм мітозів (багатополюсні метафази, відставання хромосом при розбіжності, розсіювання хромосом у метафазі) - 23.6 % у порівнянні з інтактними клітинами і клітинами, обробленими Протефлазідом. Таким чином, при одномоментному зараженні клітин ВПГ і обробкою їх Протефлазідом не встановлено змін мітотичного режиму.

Вивчення впливу препарату Протефлазід на хромосоми клітин проводили в первинно-тріпсінізованній людській ембріональній тканині. Результати представлені в таблиці 8.

Таблиця 8. Вплив Протефлазіду на хромосоми клітин ЛЕТ

Вплив на клітини % аберантних хромосом Аберрации хромосом, %

Пробіли Хроматидні розриви Пульверизація Ендоре дуплікація

Протефлазід у концентрації 6.8 мкг/мл 6.0±1,0 100.0 - - -

Протефлазід у концентрації 0.68 мкг/мл 5.0±0.9 100.0 - - -

Інтактні клітини 4.0±0.8 100.0 - - -

Вірус герпеса 13.0±1.5 53.8 15.4 15.4 15.4

Протефлазід в концентрації 6.8 мкг/мл + вірус герпеса 5.0±0.7 66.6 33.4 - -

Протефлазід в концентрації 0.068 мкг/мл + вірус герпеса 6.0±1.0 66.6 33.4

З представленої таблиці випливає, що Протефлазід у концентраціях 6.8 мкг/мл і 0.68 мкг/мл не приводив до збільшення числа аберантних метафаз, отже, вивчений препарат не має мутагенних властивостей. Вірус герпесу викликав збільшення числа аберантных метафаз у 2-3 рази (t=3.8) у порівнянні з даними, отриманими в інших групах експерименту, що узгоджується з даними, отриманими Н.І.Зацепіним із соавт. [13], В.Н.Блюмкіним і В.М.Ждановим [9] культурі фібробластів людини. При зараженні зазначеної культури симпластоутворюючим вірусом герпесу відбувалося значне