З представленої таблиці видно, що Протефлазід дозозалежно стимулює продукцію інтерферону в лейкоцитах людини.

Типування інтерферону, індукованого в лейкоцитах людини представлено в таблиці 17.

Таблиця 17. Типування інтерферону, індукованого в лейкоцитах людини

Препарат в мкг/мл Титр інтерферона при Нейтралізація моноклональними антитілами

рН 7.0 рН 2.0 +56оС к альфа-ИФН к гамма-ИФН к альфа-гамма ИФН

Протефлазід 6.8 1280 160 160 160 320 -

Таким чином, Протефлазід є індуктором альфа- і гамма-інтерферону.

Вивчення індукції інтерферону in vivo

Препарат Протефлазід був вивчений в експерименті in vivo на мишах, яким він був уведений внутрішньочеревно (по 0.2 мл) у дозі 0.34 мг/кг ваги тварини. Через 3, 24 і 48 годин мишей забивали і визначали інтерферон у сироватках крові й органах тварин за загальноприйнятою методикою придушення ЦПД вірусу везикулярного стоматиту в клітинах, що перевиваються, L 929. Результати представлені в таблиці 18.

Таблиця 18. Рівень ІФН у сироватках крові й органах мишей, оброблених Протефлазідом

Досліджувані органи Активність ІФН в од. акт./мл

3 ч 24 ч 48 ч физ. р-р. 24 ч полі-И

полі-Ц

Кров

без змін рН

після змін рН

160

0

640

40

640

160

40

40

1280

1280

Селезінка

без змін рН

після змін рН

640

80

640

320

640

640

40

40

640

640

Легені

без змін рН

640

640

640

40

1280

Печінка

без змін рН

320

320

80

40

640

Таким чином, у результаті проведених досліджень, встановлено, що Протефлазід индукує синтез ІФН у високих титрах через 3 години після введення препарату. Зміна рН середовища значно знижує рівень вироблюваного ІФН у 1-у добу (3 години і 24 години), до 48 годин продукція ІФН зростала. Ранній синтез ІФН (3 години), а також вплив зміни рН середовища в 1-у добу на рівень ІФН свідчить про те, що препарат Протефлазід є індуктором альфа- і гамма- ІФН.

Вплив Протефлазіду на тімідінкіназну активність у клітинах мозку мишей, заражених вірусом простого герпесу

З літературних даних відомо, що спочиваючі клітини мозку містять незначну кількість тімідінкінази. Стресові стани, а до них відноситься вірусна інфекція, підвищують рівні синтезу цього ферменту.

Ранніми білками при синтезі герпесвірусів є активатори синтезу білків ДНК-полімераза, тімідінкіназа і цитоплазматичні антигени. Фермент тімідінкіназа входить до складу всіх герпесвірусів. Цей ензим є складовою частиною нуклеозідного комплексу, що катализують реакцію між АТФ і нуклеотидами для утворення нуклеозід- і трифосфатів.

Визначення тімідінкіназної активності в гомогенатах мозку мишей проводили по методу [15]

Були оптимізовани всі умови по визначенню ферменту в кіназній суміші - по температурному режимі, рН, підбор концентрацій двовалентних катіонів, кількості внесеного білка.

Тімідінкіназа бере участь у реакції перетворення нуклеотидів у нуклеозіди і % її визначають по формулі

кількість рахунок/хв перетворення нуклеотидів

---------------------------------------------------------- *100%

кількість рахунок/хв контрольних препаратів нуклеотидів

Так як герпесвіруси у своєму складі містять тімідінкіназу, збільшення кількості її в системі мозкові клітини - вірус простого герпесу можна вважати за рахунок вірусіндукуємих процесів. Кількість тімідінкіназної активності в заражених клітинах без застосування препарату приймали за 100%.

Дані по вивченню впливу Протефлазіду представлені на графіку.

Діаграма 1

Контроль 1 - Незаражені клітини мозку мишей

Контроль 2 - Клітини мозку мишей, заражених вірусом простого герпесу

Діаграма 2

Контроль 1 - Незаражені клітини мозку мишей

Контроль 2 - Клітини мозку мишей, заражених вірусом простого герпесу

Згідно з отриманими даними препарат Протефлазід у дозі 10 мкг/мл інгібірує тімідінкіназну активність на 30 %, у дозі 25-50 мкг/мл на 50 %, а в дозі 75-100 мкг/мл - на 70%.

Вплив Протефлазіду на ДНК-полімеразну активність у клітиних мозку мишей, заражених вірусом герпесу

Згідно отриманим нами даним, препарат Протефлазід володів вираженою інгібіруючою дією на ДНК-утримуючий вірус герпесу 1 і 2 типи, для репродукції якого важливе значення має система ДНК-полімеразної активності вірусіндуковоної клітини.

Для з'ясування механізму иінгібіруючої дії препарату Протефлазід було проведене вивчення впливу різних доз препарату на ДНК-полімеразу. Дослідження проводили в системі ДНК-полімерази клітини, інфікованої вірусом герпесу.

Тестування на ДНК-полімеразну активність проводили ін вітро в системі, що містить як субстрати дезоксітріфосфатнукліотіди (альфа-АТФ, альфа-ЦТФ, альфа-ГТФ, -ТТФ), один із ТТФ, містив мічений по тритію тімідін. Як запал синтезу нуклеїнової кислоти використовували матрицю - активовану ДНК тимуса теляти. Ферментним препаратом служила ДНК-полімераза клітин, заражених вірусом герпесу. Дана реакційна суміш служила контролем, у дослідні зразки вносили інгібітори нуклеїнового синтезу в концентрації від 1 до 250 мкг/мл. Суміш витримували 45 хвилин при 40о С, а потім поміщали на мембранні фільтри GF/C, що промивали сумішшю пірофосфату з водою і трикратно етиловим спиртом 96о, сушили при 50о протягом 30 хв, а потім поміщали в сцинтилятор Ж-3 і вимірювали в системі Бекман-L8-7800. Результати представлені на малюнку.

Вивчення дії Протефлазіду на антиоксідантний статус клітин

Аналіз токсичності препарату, вивчення його впливу на проліферацію клітин з метою оптимізації дозувань препарату для проведення наступних експериментів по визначенню антиоксідантної активності були виконані на суспензійних культурах двох ліній, що перевиваються, злоякісних лімфоїдних клітин людини, а саме В - клітинній лінії Nамаlwа, отриманої з лімфоми Беркітта і Т - клітинної лінії МТ 4 (гострий Т-клінинний лейкоз).

Встановлено, що Протефлазід у дозі 1.7 - 3.4 мкг/мл мав лише слабку гнітючу дію на проліферацію клітин зазначеної культури. Причому цей ефект, що виявляється на першу добу після культивування клітин із препаратом у дозі 1.7 мкг/мл, практично цілком нівелювався при наступному пасированні клітин у присутності тієї ж дози препарату. Життєздатність клітин у всіх дослідних крапках складала не менш 90% і не відрізнялася від такої в контролі. Лише в пробах, де концентрація препарату складала більш 3.4 мкг/мл, до третьої доби життєздатність клітин трохи знижувалася. Наявність відповідної кількості екстрагента (спирту етилового) не робило ніякого впливу на ріст клітин у даній концентрації і не перешкоджало, таким чином, аналізу біологічних властивостей самого