Дослідження впливу Протефлазіду на антиоксідантний статус включає підбір експериментальної системи, у якій, по-перше, має місце постійне генерування радикальних форм кисню і, по-друге, можна реєструвати і вивчати вплив препарату на інтенсивність свободнорадикальних процесів.

Швидкість генерування супероксідного радикалу визначали на ЕПР-спектрометрі РЕ 1307 з використанням спінової пастки 2,2,6,6-тетраметілпіперідін-N-оксілу (TEMPO), що утворить з короткоживучим супероксідом стабільний TEMPO-радикал, ЕПР спектр якого являє собою триплет з фактором спектроскопічного розщеплення g=2.005, N=16 чc, Нрр=0.4 чс. Реакція нагромадження стабільних TEMPO-радикалів у кюветі спектрометру ЕПР після введення в суспензію клітин пастки протікала лінійно протягом 5-6 хв. Спектри реєстрували з хвилинними інтервалами. По величині амплітуд другого компоненту спектру ЕПР TEMPO-радикалу реєстрували швидкість нагромадження TEMPO-радикалу, що відповідає швидкості генерування супероксідного радикалу аніона [16].

Нативні клітини контрольної культури МТ-4 при кімнатній температурі генерували супероксідрадикал-аніон зі швидкістю в середньому 0.53 нмоль/100 тис. клітин за 1 хв (мал. 1). Після температурної обробки (і 600С и 00С) ЕПР сигнал утворення ТЕМРО-комплексу був відсутній, що свідчить про участь термолабільних компонентів у процесах генерації активного кисню і про відсутність впливу невраховуваних субстанций на результати досліду.

При інкубації клітин МТ-4 у присутності Протефлазіду швидкість генерації супероксідрадикал-аніону знижувалася на 20-30 % після 2-х годин інкубації, і більш, ніж на половину після 4-х годинної інкубації. Через 24 години інкубації швидкість генерування цього радикалу була близька до нуля.

Активність генерації цього радикалу клітинами лінії Namalwa була трохи нижче, ніж клітинами МТ-4 (у середньому 0.33 нмоль/100 тис. клітин за 1 хв). При цьому в цих клітинах відзначалося практично повне гасіння генерації радикалу після інкубації з Протефлазідом в усі терміни спостереження (мал. 2).

Мал. 1. Вплив препарату Протефлазід на швидкість генерирування супероксідрадикалів клітинами МТ-4.

Мал. 2 Вплив препарату Протефлазід на швидкість генерирування супероксідрадикалів клітинами Namalwa.

Мал. 3 Вплив препарату Протефлазід на швидкість генерирування супероксідрадикалів гомогенатом клітин МТ-4.

Мал. 4. Хемилюмінесценція клітин МТ-4, індукована Н2О2: а - клітини контрольної культури; б - клітини після інкубації з Протефлазідом протягом 4 годин.

Вплив Протефлазіду на інтенсивність свободнорадикальних процесів, індукованих пероксидом водню

Інтенсивність свободнорадикальних процесів вивчали хемілюмінесцентним методом на установці ХЛМ 1Ц-01 при кімнатній температурі. Як індуктор генерації радикальних форм кисню використовували пероксид водню, що вводили в осередок хемилюмінометру з розрахунку 0.5 мл 3 % Н2О2 на 1 мл суспензії клітин після попередньої реєстрації базового рівня світіння клітин при відкритій шторці ФЕУ. Клітини, відмиті від культурального середовища, вводили в концентрації від 1 до 8 млн./мл.

Інкубація клітин із Протефлазідом значно змінювала інтенсивність хемілюмінесценції клітин, атакованих Н2О2. Типові хемилюмінограми приведені на мал. 4. Для зразків клітин, інкубованих у присутності препарату, виявилося характерним зниження хемілюмінесценції в перші секунди після атаки Н2О2 у 2.2 рази в порівнянні зі світінням клітин контрольної культури. Максимум світіння контрольних клітин реєструвався на 90-180 секундах, після чого реакція переходила в стаціонарну фазу з амплітудою світіння 62 - 75 у.е. У зразках клітин, інкубованих із протефлазідом, розвиток свободнорадикальних реакцій носив уповільнений характер - максимум світіння наставав на 270-300 секундах, а стаціонарний рівень - на 560-600 секундах.

Таким чином, використана методика дозволяє реєструвати кінетику свободнорадикальних процесів, що відбуваються в мембранах клітин МТ-4, а досліджуваний препарат Протефлазід виявляє в цій експериментальній системі антирадикальні властивості, які можна розцінювати, як здатність підвищувати стійкість клітин до свободнорадикального стресу.

Вивчення модулюючої дії Протефлазіду на цитотоксичні й апоптичні ефекти протипухлинних препаратів

Для вивчення можливої модулюючої дії досліджуваного препарату у відношенні цитотоксичних та апоптичних ефектів відомих протипухлинних препаратів клітини обох досліджуваних ліній у логарифмічній фазі росту попередньо культивували в присутності Протефлазіду в розведенні 1:200, що відповідало концентрації 3.4 мкг/мл по глікозіду кверцетину. Потім клітини, культивовані в присутності препарату, і клітини, культивовані без препарату, обробляли цитотоксичними дозами (20-40 мкм) етопозиду, препарату, що відноситься до групи інгібіторів топоізомерази II. Клітини культивували з цитотоксичним препаратом протягом 18 годин, при цьому в культурі був присутній і Протефлазід у зазначеній вище дозі. Після закінчення часу інкубації клітини концентрували центрифугуванням у пробірках Еппендорфу і підраховували індекс цитотоксичності, викликаної етопозідом, по відсотковому співвідношенню клітин, що офарблюються трипановим синім. Прояву цитотоксичності й індукції апоптозу в досліджуваних культурах при дії різних доз етопозиду були вивчені нами раніше. Результати однієї із серій експериментів, проведених із двома культурами в порівнянних умовах, приведені в таблиці. Індекс цитотоксичності в окремих серіях варіював. Різної була і різниця в цитотоксичності клітин, попередньо оброблених і неопрацьованих Протефлазідом. Варто помітити, що в окремих експериментах посилення цитотоксичності етопозиду в культурах, предоброблених Протефлазідом, не реєстрували.

Вплив препарату Протефлазід на стан гена с-myc у культурах злоякісних лімфоїдних клітин людини

Відомо, що деякі препарати, що використовуються в клінічній практиці для лікування пухлин і лейкозів, а саме інгібітори ДНК-топоізомерази ІІ, є індукторами вторинних лейкемій. Така індукція, імовірно, пов'язана із сайт-специфічними перебудовами деяких генів, а саме гена MLL. Останнім часом було показано, що деякі біологічно активні речовини, а саме флавоноїди, мають аналогічну сайт-специфічну рекомбинантну дію, що реалізується завдяки їх впливу на ДНК-топоізомеразу ІІ (R. Strick et al. 2000). На думку авторів такі ефекти деяких флавоноїдів можуть викликати індукцію первинних лейкемій у немовлят. Таким чином, активність біофлавоноїдів може бути двоякою. Тому аналіз безпеки яких-небудь препаратів, що містять флавоноїди, повинний враховувати цей аспект проблеми.

Крім гена MLL існує також ряд генів, щодо яких у літературі документовані сайт-специфічні перебудови, до таких генів відноситься і ген с-myc