на папері виявляють за допомогою барвників, які з різними функціональними групами компонентів зразку дають певне характерне забарвлення. "Плями" з розділеними речовинами на папері вирізають і проводять їх екстракцію відповідними розчинниками. Екстракти речовин можна кількісно аналізувати різними методами: спектрофотометрично, потенціометрично чи радіометрично, якщо речовини містять радіоактивні мітки.
Електрофорез на ацетат целюлозі.
Більшість органічних молекул адсорбуються на волокнах паперу за рахунок гідроксильних груп целюлози. Адсорбція протидіє руху частинок і викликає витягування плям, що в значній мірі погіршує процес розділення компонентів зразку. Цих негативних явищ можна позбутися, якщо замість паперу використовувати мембрани з ацетат целюлози. В ацетат целюлозі гідроксильні групи целюлози перетворено в ацетатні, які не проявляють адсорбційних властивостей. Це покращує якість розділення, збільшує швидкість процесу розділення, а також дає можливість використовувати більш нижчі напруги для електрофорезу. Методично електрофорез на ацетат целюлозі проводять так як і електрофорез на папері.
Потрібно також відмітити, що висока розчинність ацетат целюлози в різних розчинниках і її прозорість дозволяють легко екстрагувати розділені компоненти і визначати ці речовини спектрофотометрично.
Тонкошаровий електрофорез.
При тонкошаровому електрофорезі носієм служить шар сорбенту товщиною 0,25-0,50мм, який рівномірно нанесений на скляну пластину. Найчастіше в якості носія використовують оксид кремнію або оксид алюмінію. Пластину з носієм поміщають в апарат для горизонтального електрофорезу і дають можливість тонкому шару насититись буфером за рахунок дифузії розчину з буферних камер через контактний паперовий гніт. Мікропіпеткою наносять зразок і подають напругу.
Тонкошаровий електрофорез найчастіше використовують для розділення при високих напругах (високовольтний електрофорез). Метод має високу роздільну здатність і високу чутливість.
Часто тонкошаровий електрофорез проводять в комбінації з тонкошаровою хроматографією, тобто, після електрофорезу, в перпендикулярному до нього напрямі на тій же пластині проводять хроматографію. Такий метод дістав назву "методу відпечатків пальців" і дає можливість з високою якістю розділяти складні багатокомпонентні суміші.
Гель-електрофорез.
Найкращий ефект розділення органічних макромолекул досягають за допомогою гель-електрофорезу. В якості носія використовують гелі з крохмалу, агарози, поліакриламіду та агарози - акриламіду. Високу роздільну здатність гель-носіїв пояснюють ефектом ''молекулярного сита". Це пов’язано з пониженою дифузією частинок зразку в сітці гелю і розподільчою дією гель-проникаючої хроматографії. Структурно гелі складаються з хаотично переплетених полімерних ланцюгів, які утворюють ситоподібну структуру по всьому об'єму геля. Принцип дії молекулярного сита полягає в тому, що великі молекули будуть рухатись тим повільніше, чим менші пори в структурі гелю, розміри яких визначаються числом поперечних зшивок між полімерними ланцюгами.
Найбільш ефективними гель-носіями вважають поліариламідні гелі, які поєднують в собі ряд властивостей:
1. Розмір пор може коливатись в широких межах.
2. Гелі можна формувати в каліброваних контейнерах (трубках і пластинах).
3. Вони характеризуються дуже низьким рівнем адсорбції і електроосмосу.
4. Їх можна застосовувати з різними буферами.
5. Процес розділення проходить дуже швидко.
6. Розділені речовини можна визначати за допомогою денсітометра.
Поліакриламідні гелі отримують при співполімеризації акриламіду і метиленакриламіду в присутності системи вільнорадикальних каталізаторів. Мономери розчиняють в буфері, додають каталізатор і приготовлену суміш заливають у відповідні контейнери, в яких будуть проводити електрофорез. Процес полімеризації (утворення гелю) при необхідності прискорюють, опромінюючи контейнери ультрафіолетом. Змінюючи в буфері концентрацію акриламіду від 3 до 30% можна отримувати гелі з діаметром пор від 0,2 до 0,5 нм і таким чином регулювати ефект молекулярного сита.
Диск-електрофорез.
Диск-електрофорез є видозміненим гель-електрофорезом на вертикальних колонках в поліакриламіді. Цей метод електрофорезу був розроблений для високоякісного розділення фракцій білкових препаратів. Особливість методу полягає в тому, що:
В електрофоретичній колонці використовують гелі з різним розміром пор. Верхній шар гелю, який займає третину колонки, є крупно пористим і його називають концентраційним гелем. В нижній частині колонки формують дрібно пористий гель, який власне є робочим гелем. Такий градієнт розмірів пор дає можливість ефективно використовувати в процесі розділення явища молекулярного сита.
Для диск-електрофорезу підбирають такі буферні системи, які, іонізуючи білкові молекули, перетворюють їх в аніони. Тому для подачі напруги у верхній буферній камері розміщують катод, а в нижній – анод. Електрофорез проводять при постійній величині електричного струму в межах 10 мА.
3. У верхній та нижній буферних камерах використовують буферні системи з різним значенням рН. В нижній буферній камері величина рН на 2-3 одиниці вища, ніж у верхній. Це приводить до виникнення градієнту рН вздовж електрофоретичної колонки і супроводжується різним ступенем іонізації білкових молекул в концентраційному та робочому гелі.
Електрофоретичну колонку, заповнену робочим і концентраційним гелями, поміщають в нижню камеру з буферною системою тріс-гліцину. На поверхню геля наносять мікропіпеткою зразок і наповняють буферною системою тріс-НСІ верхню камеру. Прилад закривають кришкою і подають напругу на електроди.
Верхній шар гелю має високу пористість, тому рухливість білкових аніонів зразку в ньому буде наближатись до їх рухливості у вільному розчині. На межі верхнього та робочого гелю пористість різко зменшується, що викликає значне зниження рухливості білкових пластинок. Внаслідок цього компоненти зразку підходять до робочого гелю у вигляді дуже вузької концентрованої полоси.
Проходячи в зону робочого гелю, мікрочастинки зразку попадають в дещо інше електрофоретичне середовище. По-перше, дрібнопористий гель діє по принципу
молекулярного сита, і макроіони з більшою молекулярною масою рухаються повільніше. По-друте, більш високе значення рН тріс-гліцинового буферу викликає додаткову іонізацію білкових макроіонів. Більш іонізовані білкові аніони будуть мати більшу швидкість руху. Отже, електрофоретична рухливість білкових молекул в робочому гелі буде пропорційна відношенню їх заряду до маси. Саме цей фактор визначає високу роздільну здатність диск-електрофорезу.
Імуноелектрофорез.
Цей метод базується на комбінованому застосуванні тонкошарового електрофорезу