і методу імунодифузії. Така комбінація методів дає можливість, за допомогою реакції преципітації між антигенами і відповідними антитілами, розділити та ідентифікувати близькі за електрофоретичною рухливістю білкові молекули. Метод особливо є цінним при виявленні антигенів в складних фізіологічно активних сумішах, наприклад в препаратах муноглобулінів. Принцип методу полягає в тому, що спочатку зразок розділяють з допомогою тонкошарового електрофорезу на агаровій пластинці. Після припинення електрофорезу в жолобок, вирізаний в агарі, вносять суміш антитіл і витримують час, необхідний для проходження процесів дифузії. Антитіла дифундують латерально, а дифузія антигенів зразку проходить в радіальному напрямку. При зустрічі антигену з відповідним антитілом відбувається реакція преципітації, яка локалізується на носії у формі дуги. Кількість дуг, що утворились, відповідає кількості досліджуваних антигенів.
Ізоелектричне фокусування.
В основі цього методу лежить фронтальний електрофорез в градієнті рН середовища. Цим методом розділяють органічні амфоліти, такі як амінокислоти, пептиди та інші. Молекули амфолітів містять як позитивно, так і негативно заряджені групи. Причому. сумарний заряд їх молекул залежить від величини рН середовища, в якому вони розчинені. При низьких значеннях рН іони амфолітів несуть переважно позитивний заряд, а при високих – переважно негативний. Однак, для кожного амфоліту існує таке значення рН, при якому їх сумарний заряд стає рівним нулю. Таке значення рН називають ізоелектричною точкою. При ізоелектричній точці молекули амфолітів не будуть рухатись в прикладеному до них електричному полі.
Суть методу полягає в тому, що при електрофорезі в градієнті рН, кожен амфоліт рухається до тієї зони колонки, в якій значення рН відповідає його ізоелектричній точці. Досягнувши зони ізоелектричної точки, рух молекул амфоліту припиняється і вони концентруються (фокусуються) в даній частині колонки. Для формування та стабілізації в електрофоретичній колонці градієнту рН використовують синтетичні низькомолекулярні поліамфоліти, які являють собою суміш поліаліфатичних аміно- і карбонових кислот.
Ізоелектричне фокусування проводять в насичених розчинах сахарози або в крупно пористих піліакриламідних гелях. Гель-ізоелектрофокусування переважно використовують для мікроаналізу білків. В останньому випадку електрофорез проводять наступним чином: в електрофоретичній колонці формують крупнопористий гель. Готують водну суспензію із синтетичних поліамфолітів, ізоелектричні точки яких мають значення, що перекривають попередньо вибрану ділянку рН. Колонку з гелем заповнюють приготовленою суспензією і під’єднують до буферних камер. Верхню камеру наповнюють сильнокислим буфером, а нижню – сильнолужним буфером. Буферні розчини дифундують в колонку і через деякий час в колонці встановлюється градієнт рН з крайніми значеннями, що відповідають рН кислого та лужного буферних розчинів. Після цього на електроди верхньої (анод) та нижньої (катод) буферних камер подають напругу. Під впливом прикладеної напруги поліамфоліти суспензії мігрують у відповідні зони рН, при яких їх сумарний заряд буде рівним нулю. Дальший рух поліамфолітів припиняється і вони стабілізують встановлений в електрофоретичному середовищі градієнт рН.
У сформовану таким чином електрофоретичну колонку вносять зразок і починають розділяти його білкові компоненти. Процес розділення триває 6-9 годин; за цей час компоненти суміші розподіляються по зонах з відповідними значеннями рН, які характеризують їх ізоелектричні точки. Після закінчення розділення колонку висушують, визначають локалізацію білкових фракцій в гелі і проводять їх кількісний чи якісний аналіз відповідними інструментальними методами.
Метод ізоелектричного фокусування має ряд значних переваг: дає можливість розділити білки, які іншими методами розділити неможливо; забезпечує високий ступінь концентрації білків в зонах їх локалізації; висока роздільна здатність методу дозволяє розділити білки, які різняться своїми ізоелектричними точками всього на 0,02 одиниці рН.
Електродіаліз.
Електродіаліз використовують для розділення колоїдних частинок від низькомолекулярних електролітів. Для цього використовують діалізні мембрани товщиною від 10 до 1000 нм. Матеріалом для таких мембран служать плівки з поліефірів целюлози, полівінілового спирту, целофану. Діалізні плівки мають пори розміром від 0,01 до 1,00 мкм. Такі плівки пропускають низькомолекулярні сполуки і не пропускають частинки макромолекулярних сполук. Промисловістю випускаються також спеціальні іоноселективні плівки, які вибірково пропускають або тільки аніони (аніонітні плівки) або тільки катіони – (катіонітні плівки).
Робочий контейнер з іоноселективними мембранами заповнюють колоїдним розчином, який потрібно очистити від низькомолекулярних іонів. Заповнений контейнер кріплять на роторі механічної мішалки і опускають в діалізатор з робочим розчином. Діаліз проводять при постійній напрузі в декілька сот вольт. Внаслідок прикладеної напруги низькомолекулярні іони через пори мембрани мігрують з колоїдного розчину в робочий. Високомолекулярні іонізовані частинки, внаслідок своїх великих розмірів, не можуть проходити через малі пори мембрани і залишаються в контейнері. Через певний проміжок часу всі низькомолекулярні іони покинуть колоїдний розчин, тобто відбудеться розділення. Застосування іоноселективних мембран не дозволяє іонам мігрувати з робочого розчину в колоїдний.
Застосування електрофорезу.
Електрофорез застосовується для розділення речовин, молекули яких несуть сумарний електричний заряд. У фармацевтичних дослідженнях електрофоретичне розділення використовують при аналізі препаратів, які містять амінокислоти, пептиди, нуклеїнові кислоти, ненасичені і насичені жирні кислоти, похідні вуглеводів, ліпопротеїди, глюкопротеїди та інші високомолекулярні сполуки.
Низьковольтний електрофорез на папері та ацетат целюлозі знайшов широке застосування при аналізі амінокислот, пептидів та амінів, особливо при низьких концентраціях цих субстанцій у лікарських засобах. При високих концентраціях таких субстратів, більш ефективним є використання високовольтного електрофорезу. Висока роздільнальна здатність високовольтного тонкошарового електрофорезу використовується у фармації для аналізу нафтолів, фенолів та неорганічних іонів.
ТЕХНІКА ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ.
Розрізняють три основні способи введення лікарських речовин в тіло людини за допомогою постійного струму.
1. Найбільш ширше використовується введення лікарських речовин з розчинів, якими змочують гідрофільні прокладки, поміщені між металевим електродом і тілом людини. Ці прокладки робляться з фланелі, бязі, марлі або фільтрувального паперу. Гідрофільна прокладка повинна