«Система глутатіону»

1.Транспорт цисплатина

Взаємодія цисплатина з плазматичною мембраною є першою щаблею багатостадійного процесу реалізації цитотоксичного ефекту препарату. Ступінь пошкодження мембран цитостатиком залежить від текучості їх ліпідної компоненти, яка визначається швидкістю проходження процесів перекисного окислення ліпідів [1].

На сьогодні існують дві гіпотези поглинання препарату пухлинною клітиною. Більш аргументована гіпотеза пасивного транспорту, основана на фактах відсутності інгібування переносу цисплатина за допомогою його структурних аналогів та проникнення цисплатина в клітину без насичення до межі його розчинності у культуральному середовищі [2]. Але ряд вчених відстоює ідею існування активного транспортера цисплатина. У 1984 році був відкритий інгібітор синтезу протеінів бензальдегід, який послаблював цитотоксичний ефект цисплатина за рахунок зменшення його накопичення в клітині. Інший відомий інгібітор білкового синтезу – циклогексамід не мав такого ефекту. Це й стало основою для заключення, що бензальдегід якимось чином безпосередньо реагує з мембранним білком-транспортером, уповільнюючи таким чином проникнення цисплатина у клітину [3].

Пізніше було знайдено, що альдегідні похідні пиридоксаль та пиридоксаль-5-фосфат також значно послаблюють цитотоксичну активність цисплатина. Відомо, що ці речовини утворюють основи Шиффа з аміногрупами на поверхні клітини. Було показано, що і бензальдегід і інші похідні інгібують проникнення цисплатина у клітину на 50% у порівнянні з контролем. Є дані про те, що попередня інкубація клітин з інгібітором Nа/К АТФ-ази уабаіном також зменшує проникнення цисплатина у клітину на 50%. Подальші дослідження у цьому напрямку показали, що безпосередньо Nа/К АТФ-аза не є транспортером цисплатина, однак транспорт ліків Na-залежний, а також залежить від мембранного потенціалу клітини [4,5].

Розглянемо загальновживану модель акумулювання цисплатина в клітині, яка влаштовує прибічників обох гіпотез. Швидке накопичення половини цисплатина у клітині проходить за рахунок пасивної дифузії, тоді як інша половина транспортується через канали, що закриваються. Якщо активність останніх заблоковано, то можна очикувати зменшення проникнення цисплатина в клітину на 50%. Дані про регуляцію активності каналів дозволяють зробити висновок, що проходження цисплатина через них регулюється каскадом реакцій фосфорилювання, що ініціюються протеінкіназою А (РКА), протеінкіназою С (РКС) чи кальмодулінзалежними кіназами [3]. Здатність мембранонепроникних альдегідних похідних блокувати накопичення цисплатина у клітині на 50% обумовлюється реактивністю зовнішніх аміногруп білків, що формують такий канал. Той факт, що інгібування початкового потоку цисплатина у клітину на 50% відбувається за допомогою уабаіна, підтверджує, що повний мембранний градієнт, зумовлений Na/K АТФ-азою, важливий для роботи каналів.

Bиведення цисплатина з клітини – двохфазний процес з дуже короткою почaтковою фазою тривалістю 5 хв та більш довгою кінцевою фазою [6,7]. Встановлено існування АТФ-залежного переносника цисплатина кон`югованого з глутатіоном [8,9]. Описана АТФ-залежна глутатіон-S-кон`югат експортуюча помпа (ГS-Х-помпа) , що має широкий спектр субстратної специфічності та транспортує органічні аніони, лейкотрієн С4 та інші сполуки, що несуть великі гідрофобні ділянки та хоча б два від`ємні заряди. ГS-Х-помпа виводить потенційно токсичні кон`югати глутатіон-S-платина (ГS-Pt) з пухлинних клітин, таким чином беручи участь в формуванні резистентності клітин до цисплатина [10].

2.Внутрішньоклітинна мішень цисплатина.

Внутрішньоклітинною мішенню цисплатина є ДНК, з якою препарат ковалентно зв`язується. Біфункціональні продукти взаємодії цисплатина з ДНК, що називаються цисплатин-ДНК-адукти, блокують реплікацію, транскрипцію і, як наслідок, - клітинну проліферацію. Цисплатин діє на 7-му позицію залишка гуаніна та формує декілька типів адуктів з основами ДНК. Два основні адукти це G-G внутрішньоланцюгові зшивки (складають 60-65% усіх адуктів), A-G внутрішньоланцюгові зшивки ( 20-25% усіх адуктів), а також міжланцюгові та ДНК-білкові зшивки [11]. Після дії цисплатина основна кількість адуктів утворюються вже через 6-12 годин [12]. Формування адуктів відбувається в два етапи. Спочатку має місце швидкий етап алкілування: один ланцюг ДНК формує цисплатин-моноадукт. Далі повільна фаза: реакція з`єднання з другим ланцюгом.

Але в останні роки вчених зацікавила у цьому відношенні мітохондріальна ДНК. Виявилось, що ця ДНК у 4-50 разів (для різних модельних систем) більш чутлива до пошкоджуючого ефекту цисплатина, ніж ядерна ДНК [13,14]. А у зв`язку з сучасними уявленнями про роль мітохондрій у реалізації програми апоптозу цей факт набуває нового значення.

3.Вплив цисплатина на клітинний цикл та індукція апоптозу.

Відомо, що у багатьох модельних системах in vitro цисплатин не э фазоспецифічним протипухлинним препаратом. Пухлинні клітини у різних фазах клітинного циклу однаково чутливі до нього [15]. Але дані деяких досліджень свідчать про те, що все таки у фазі G2/M клітини є більш чутливими до дії цитостатика [16]. Низькі концентрації цисплатина у клітинах викликають уповільнене проходження S-фази і зупинку у G2/M-фазі клітинного циклу [17]. В залежності від концентрації препарату і, відповідно, пошкодження ДНК, клітина після G2/M-зупинки вступає в наступну фазу клітинного циклу – мітоз, або входить в апоптоз. Щодо дії цитостатика на регулятори клітинного циклу, то встановлено, що цисплатин не впливає на внутрішньоклітинний вміст цикліну А [18]. Але при дії препарату збільшуються рівні цикліну В, p34cdc2 а також зростає активність гістон Н1-кінази [19]. Після дії цисплатина підвищується експресія цикліну D1, cdk4, а також збільшується рівень фосфорилювання білка ретинобластоми, тобто з`являються усі ознаки руху клітини по клітинному циклу [20]. І дійсно, якщо обробляти цисплатином клітини, що знаходяться у стані спокою (G0), вони виходять у G1-фазу, повільно проходять S-фазу і зупиняються у G2/M-фазі клітинного циклу.

Субтокичні дози цисплатина індукують загибель клітин за типом апоптозу, з усіма характерними біохімічними та морфологічними ознаками процесу: екстерналізацією фосфотидилсерину, активацією каспаз, фрагментацією ДНК, утворенням апоптичних тілець [22-24].

В багатьох модельних системах in vitro показано, що