Курсова робота на тему:

Визначення активності б-амілази амілокластичним методом в сироватці коропа звичайного(Cyprinus carpio L.)

Зміст

Вступ……………………………………………………………………………2

Огляд літератури…………………..…………..…………………….……...…4

1.1.Загальна характеристика б-амілаз. Особливості механізму їхньої дії...4

1.2.Особливості структури субстрату (крохмалю)……………………….....5

1.3. Особливості структури б-амілаз……………….………………………...6

1.3.1.Доменна організація…………………………………….…….….…6

1.3.2.Активний центр б-амілаз. Механізм каталізу……………….….....7

1.4.Фізіологія слинних та підшлункової залоз………………………...……..8

1.4.1.Великі слинні залози………………………………………………...8

1.4.2.Підшлункова залоза…………………………………………………13 2. Матеріали і методи…………………………………………...……………...17 2.1.Дослідження активності б-амілази (діастази) у сироватці крові амілокластичним методом……………………………………………………..17

3.Результати та обговорення ………………………………………………......20

Висновок………………………………………………………………………….23

Список використаної літератури……………………………………………….23

Вступ

В останні роки розширюються можливості використання крохмальдеградуючих ферментів. Зокрема амілаз, що є одною з найбільших родин глікозидгідролаз, трансфераз та ізомераз, що насам перед привертають увагу дослідників завдяки їх технологічній важливості й економічній вигідності. Вони характеризуються широким спектром застосування в різних галузях, таких як клінічна , медична і аналітична хімія, у цукрофікації крохмалю та інших галузях промисловості. Амілази становлять близько 30% світової продукції ферментів. Та постає питання про оптимізацію методу визначеня активності ферменту. Метою роботи стало опановування методів забору крові у риб коропа звичайного(Cyprinus carpio L.), отримання сироватки, визначення активності амілокластичним методом.

1. Огляд літератури

1.1. Загальна характеристика б-амілаз. Особливості механізму їхньої дії

б-Амілази (б-D-1,4-глюкан глюканогідролази, EC 3.2.1.1) здійснюють невпорядкований гідроліз внутрішніх б-D-1,4-глікозидних зв’язків у полімерах глюкози (амілозі та амілопектині) і утворюють суміш лінійних і розгалужених вуглеводів: глюкози, мальтози, олігосахаридів і декстринів із збереженням б-аномерної конфігурації продуктів [ V Maarel et al., 2002]. Оскільки б-амілази випадковим чином гідролізують б-D-1,4-глікозидні зв’язки, утворюючи лінійні та розгалужені олігосахариди з різною кількістю мономерних глюкозних одиниць, вони відносяться до ендодіючих амілаз. [Somers et al., 1989].

Рис. 1. Гідроліз глікозидних зв’язків полімеру глюкози амілолітичними ферментами. Стрілками вказано: – редукуючий (біля першого вільного атома вуглецю в молекулі глюкози) та нередукуючий (біля четвертого вільного атома вуглецю в молекулі глюкози) кінці молекули полімеру глюкози; глікозидні зв’язки (типи зв’язків вказані під їх схематичним зображенням), які гідролізуються відповідними амілолітичними ферментами (назви ферментів окреслені овальними рамками).

б-амілази загалом прийнято вважати розріджуючими амілазами, оскільки більшість цих ферментів здійснює гідроліз крохмалю на 30-40%, але б-амілази, які гідролізують крохмальвмісні субстрати на 50-60 чи більше відсотків отримали назву оцукрюючих б-амілаз.

1.2. Особливості структури субстрату (крохмалю)

1.2.1. Хімічна будова та просторова організація

Найпоширенішим полісахаридом у природі, який виступає субстратом б-амілаз є крохмаль. Крохмаль синтезується в рослинах і накопичується в ролі запасаючого полісахариду у формі нерозчинних у воді гранул. Форма і діаметр гранул залежать від виду рослин, проте більшість крохмалів, які використовуються в промислових цілях характеризується розміром від 2 до 200 мкм. При цьому більшим за розміром гранулам крохмалю властиве менше значення співвідношення площа поверхні/об’єм, а отже ? вони швидше та ефективніше гідролізуються б-амілазами [Tester et al., 2004]. Гранули більшості крохмалів характеризуються сферичною чи наближеною до кулястої формою, що дозволяє мінімізувати співвідношення площа поверхні/об’єм гранули і сприяє їхньому ефективному гідролізу .Крохмаль ? це гомополімер, мономерами якого є молекули глюкози, сполучені між собою глікозидними зв’язками (зв’язками між першим атомом вуглецю одного глюкозного залишку і киснем іншого). На вільних кінцях полімерного ланцюга біля першого вуглецевого атому в молекулі залишку глюкози присутні латентні альдегідні групи, які отримали назву редукуючих кінців, а, відповідно, не задіяні в глікозидних зв’язках вільні четверті атоми вуглецю ? нередукуючих кінців (рис. 1).

Гранули більшості крохмалів сформовані двома видами полімерів глюкози: лінійного (амілози) і розгалуженого (амілопектину), які становлять, відповідно 15-30 і 70-85% Молекули амілози та амілопектину відрізняються ступенем полімеризації (degree of polymerization, DP) ? кількістю залишків глюкози залежно від рослинного об’єкту. На загал, амілоза являє собою лінійний полімер 500-6000 глюкозних одиниць, сполучених б-D-1,4-глікозидними зв’язками, тоді як амілопектин складається з поєднань лінійних ділянок з б-D-1,4-глікозидними зв’язками між залишками глюкози, які через кожні 10-60 мономерних ланок розгалужуються за рахунок утворення

б-D-1,6-глікозидних зв’язків, при цьому молекула амілопектину може сягати 2 000 глюкозних залишків. Найшвидше розщеплюються б-амілазами глікозидні зв’язки в аморфних ділянках крохмальних гранул .

Рис.2. Структура б-амілази . Відтінками позначено: ¦ – каталітичний домен (домен А), ¦ – варіативний домен (домен В), ¦ – домен зв’язування субстрату (домен С). Стрілками вказано: 1 – каталітичний центр, 2 – центр зв’язування субстрату. Буквами позначено; N– та С–кінці молекули ферменту. Іони Ca2+ та Na+ зображені у формі кульок.

1.3. Особливості структури б-амілаз

1.3.1. Доменна організація

Амілолітичні ферменти, які розщеплюють глікозидні зв’язки характеризуються подібною структурою і розподіляються на кілька родин глікозидних гідролаз на основі подібностей їх амінокислотних послідовностей. б-Амілази належать до 13-ї родини глікозидних гідролаз (GH-13) [..] і відзначаються наявністю кількох функціональних доменів у структурі мономерного ферменту (рис.2)

Характерна особливість цієї родини ферментів ? наявність циліндричного каталітичного домену А, сформованого з восьми паралельно розташованих в-складок, оточених вісьмома б-глобулами (так званого TIM-циліндру, оскільки вперше був виявлений у структурі тріозофосфатізомерази м’язів курчат, звідки і отримав свою назву) і кількох додаткових доменів, залежно від типу амілази . У структурі більшості відомих б-амілаз виділяють три різні за будовою і функціям домени: центральний каталітичний домен А, який найчастіше перетинається між 3-ю б-глобулою і 3-ю в-складкою варіативним доменом В, який відрізняється найбільшою різноманітністю структури і форми. Цей домен приймає участь у зв’язуванні субстрату і кальцію та визначає субстратну специфічність і стабільність ферменту [Svensson, 1994]. Третій домен, домен С, розташований біля домену А, формуючи захисний щит для каталітичного домену . Наявність домену С ? ще одна особливість б-амілаз, яка відрізняє їх з-поміж амілолітичних ферментів 13-ї родини глікозидних гідролаз, яким властиві дев’ять різних