В 1530 році імператор Священної Римської Імперії Карл V дарує іоанітам в вічне володіння три невеликих острови в центрі Середземного моря – Мальту, Гоцо і Коміно. Орден отримує свою третю частину після Святої Землі і Родоса, батьківщину з цього часу, до наших днів носить назву "Державний орден шпиталю святого Іоана Єрусалимського, Родоса і Мальти" [Доманін А. с.375] В повсякденному побуті він є відомий як Мальтійський орден.

Малтійський орден продовжував проводити активну анти турецьку діяльність, практично він став форпостом християнських держав у боротьбі з Османською імперією, яка досягнула в цьому часі апогею своєї могутності. [Райлі-Смітт с.394]

Новопризначені малтійські лицарі досить швидко освоїлись на новому місці – знадобився родоський досвід – і довели Карлу V, що його благородний порятунок ні в якому разі не був помилкою. Уже в 1531 році іоаніти приймають участь у військовій експедиції на Пелопоннесі – це був острів у Південній Греції. В 1535 році мальтійці активно беруть участь у великому поході Карла, який був направлений на завоювання Тунісу.

Мальта розмішала в собі велику гавань, розміщуючись між іспанською Сицилією і османською Африкою, являла собою прекрасну базу для проведення військових дій на морі турецьких армад і африканських корсарів. Лицарі домовилися про ввозі зерна із Сицилії і зміцнили тим самим мальтійську гавань. Вони привезли з собою із о. Родоса реліквію і частину архіву ордену і продемонстрували можливість пристосуватися до нових умов. Мальту захопили близько 540 лицарів і сержантів ордену іоанітів, а до кінця 1631 року весь орден братів-мальтійців нараховував 1755 лицарів, 148 капеланів і 155 сержантів, це є всього 2058 людей, із яких 995 знаходилося у трьох французьких провінціях, а 226 – на Мальті.

Лицарі-мальтійці мужньо боролися зі своїми ворогами, незважаючи на важкі небезпеки та втрати. У 1551 році Триполі було захоплене турками, а мальтійський острів Гюго підкорився руйнівному нападу. Але лицарі продовжували воювати. Найвищого розвитку Мальтійський орден отримав під час магістра Жана де Ла Валетта (1557-1568), ветерана останньої облоги Родоса в 1522 році, при якому Мальті довелося витримати страшну облогу турків. До моменту нападу османів фортеця Сент-Анжело, нове місто Ізола і форт Сент-Ельмо при вході у гавань були вже міцно укріплені. Турків було набагато більше, чим захисників острова, і завдяки тому, що Жан де Ла Валлет був відважним і розумним воїном і талановитим воєнноначальником, йому помагало все мальтійське населення. Мальта протрималася до прибуття спасенної експедиції під командуванням віце-короля Палермо і командора ордена Сантьяго Гарсія де Толедо.

Мальтійські лицарі повністю розплачуються з імператором, спасаючи йому життя під час панічного відступу іспано-імперського війська під натиском алжирської армії.

Велику увагу пиляється зміцненню обороноздатності самої Мальти. В період діяльності великого магістра Жана де Ла Валлет досягає вершини могутності в той же час піддається великому випробуванню.

В 1565 році Сулейман направляє величезний флот на завоювання Мальти. Проти переважаючих сил мальтійців змогли виставити близько сімсот лицарів і вісім тисяч солдатів. Жан де Ла Валлет показав себе достойним слави попередників. Його розумне керівництво, високий бойовий дух мальтійських лицарів, які були активно підтримані населенням, відіграли свою вирішальну роль. Після чотиримісячних безплідних атак турками, які втратили в безперервних боях половину армії, вимушені були покинути Мальту. Великими були і втрати іоанітів: за час блокади загинуло двісті сорок лицарів і майже п’ять тисяч солдатів. Але Мальта зуміла вистояти свою незалежність, а після смерті престарілого Сулеймана в 1566 році і особливо після тяжкої поразки турецького флоту в боротьбі при Лепанто через п’ять років, небезпека нового османського населення значно зменшилась. До того ж іоаніти ніколи не забували про постійне укріплення своєї твердині.

Після відбиття турків почалося нове будівництво нової столиці – Ла-Валлетиз першокласною фортецею, був серйозно посилений захист Гоцо і Каміно. Будівництвом нових укріплений орден займався до останніх днів свого перебування на Мальті: флот Тіньє був закінчений в 1794 році.

Зниження небезпеки безпосереднього турецького вторгнення після Лепанто дозволило Мальтійському ордену повернутися до вже випробуваної стратегії "корсо". З кінця ХVІ століття і до 1718 років корсарство є для Мальтійського ордену улюбленою тактикою боротьби з турками і в цей же час, одним із основних способів поповнити багатства ордену. Щоби забезпечити "корсо" живою силою, в орденський статут було внесено доповнення: кожен мальтійський лицар повинен був провести два з половиною роки своєї служби на військовому кораблі ордену. А по скільки недостатку в численності членів ордену не спостерігалося – в на початку ХVІІ століття горде названня мальтійських лицарів носили 1755 чоловік, - і "корсо" довгий час не знало проблем.

Організаційна структура іоанітів практично не змінювалась. Всім керував великий магістр.

У 1631-1776 роках коли Мальту охопила фінансова криза, орден був розпущений ні разу, але ставав все частіше і частіше авторитетнішим. Велика частина доходів іоанітів поступала у власну казну магістра, який володів майже абсолютною владою у ордені.

У орден братів-мальтійців