Міністерство освіти і науки України
ВИВЧЕННЯ ВЛАСТИВОСТЕЙ ТЕРМОСТАБІЛЬНИХ б-АМІЛАЗ З БАКТЕРІЙ РОДУ Bacillus
Курсова робота
ЗМІСТ
с.
ВСТУП……………………………………………………………………………….3
1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ……………………………………………………………4
1.1. Механізм дії б-амілаз ………………………………………………………..4
1.2. Особливості структури б-амілаз ……………………………………………4
1.3. Отримання б-амілаз………………………………………………………….5
1.4. Властивості б-амілаз…………………………………………………………5
1.4.1. Субстратна специфічність…………………………………………......….5
1.4.2. Вплив рН середовища……………………………………………………..6
1.4.3. Вплив температури……………………………………………………..…7
2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ………………………….……..….8
2.1. Штами та реактиви…………………………………………………….….....8
2.2. Умови культивування та отримання ферменту……………………………8
2.3. Визначення активності б-амілази…………………………………..………9
2.4. Визначення термостабільності б-амілаз…………………………………..10
2.5. Визначення рН-залежності активності б-амілаз………………………….10
2.6. Визначення концентрації білка і статистична обробка результатів…….11
3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ……………………..12
3.1. Результати скринінгу продуцентів б-амілази……………………………..12
3.2. Результати підбору умов культивування бактерій роду Вacillus……......12
3.3. Термостабільність виділених амілаз………………………………………13
3.4. рН-залежність активностей виділених амілаз…………………….………15
ВИСНОВКИ………………………………………………………………………..17
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ…………………………………………………………...18
ВСТУП
б-амілази, (1,4-б-D-глюкан-4-глюкангідролази, ЕС 3.2.1.1.) здійснюють невпорядковане розщеплення б-1,4-глікозидних зв’язків крохмалю та інших полісахаридів з утворенням декстринів, олігосахаридів, мальтози і глюкози в б-аномерній конфігурації [22, 23]. Ці ферменти знайшли широке застосування в різних галузях промисловості: у текстильній промисловості – для розшліхтування волокон [4], у харчовій промисловості – для утворення декстринів і поліпшення якості тіста [1], в синтетичній хімії – для продукції олігосахаридів [28]. Вони використовуються при виробництві шоколадного сиропу і смакових додатків, отримання цукрів і алкоголю, приготування фуражу і обробки стічних вод [30], в пивоварінні і виноробстві [4]. Амілази мають потенційне використання як складові миючих засобів і пральних порошків [15]. Велике значення в даних процесах має термостабільність і висока активність б-амілаз, оскільки окремі етапи даних процесів проводять при високих температурах, що дозволяє уникати ризику зараження мезофільною мікрофлорою, збільшує швидкість протікання реакцій, підвищує якість продукції і знижує її собівартість за рахунок зменшення витрат на охолодження реакторів [11, 18]. Значний інтерес в останні роки становить виділення термостабільних б-амілаз, здатних виявляти амілолітичну активність при лужних значеннях рН, що дає можливість застосовувати дані ферменти у процесі сахарифікації (завершальному етапі гідролізу крохмалю до моносахаридів) і виготовленні екологічно безпечних миючих засобів [5, 15, 25].
Термостабільні б-амілази продукуються цілим рядом мікроорганізмів, проте з комерційною метою, як правило, використовують ферменти з бактерій роду Вacillus [3, 22, 23, 30, 31], основними продуцентами є Вacillus licheniformis, B. stearothermophilus, B. subtilis і B. amiloliquefaciens [23].
Метою даної роботи було отримання стабільної в області високих температур і лужних значень рН б-амілази з бактерій роду Вacillus з перспективою її подальшого вивчення і практичного використання.
1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
1.1. Механізм дії б-амілаз
б-Амілази (б-D-1,4-глюкан-глюканогідролази, EC 3.2.1.1.) здійснюють невпорядкований гідроліз внутрішніх б-D-1,4 глікозидних зв’язків у полімерах глюкози (амілозі та амілопектині), звільнюючи суміш вуглеводів: глюкози, мальтози, олігосахаридів і декстринів зі збереженням б-аномерної конфігурації продуктів [23]. Глюкоза відщеплюється при атакуванні ферментом кінцевої мономерної одиниці, мальтоза – при гідролізі другого глікозидного зв’язку, олігосахариди і декстрини – вкорочені сегменти крохмалю формуються в результаті невпорядкованого гідролізу внутрішніх глікозидних зв’язків. Альфа-амілази наявні у всіх організмів і відіграють домінантну роль в метаболізмі вуглеводів [22]. Дані ферменти продукуються великою кількістю мікроорганізмів, проте найширшого застосування набули б-амілази, які виділяють бактерії роду Bacillus [22, 23, 30, 31].
1.2. Особливості структури б-амілаз
Альфа-амілази, які продукуються різними видами мікроорганізмів, відзначаються значною гомологічністю первинної структури і просторової конформації. Дані ферменти є мономерами, які складаються з кількох доменів (рис. 2) [20]. Характерною особливістю даної родини є наявність циліндричного каталітичного домену А, який сформований з 8 б-глобул і 8 в-складок, і кількох додаткових доменів, залежно від типу амілази. Так, б-амілази відзначаються наявністю трьох різних доменів: центрального А-домену, який перетинається між третьою б-глобулою і третьою в-складкою В-доменом, який вирізняється найбільшою різноманітністю структури [13]. Третій домен, домен С розташований поза доменом А і стабілізує його структуру, формуючи захисний щит з гідрофобних залишків над каталітичним центром. Активний центр розташований в заглибленні між доменами А і В, в місці з’єднань б-глобул і в-складок [13].
1.3. Отримання б-амілаз
Індустріальні ферментативні процеси відбуваються з участю амілаз мікробного походження, оскільки у мікроорганізмів дані ферменти є позаклітинними і виділяються у навколишнє середовище. Тому як джерело ферменту найчастіше використовують середовище культивування бактерій продуцентів після видалення клітин. Основними продуцентами є мезофільні бактерії родів Bacillus [22, 23, 30, 31], Lactobacillus [24] та термофільні бактерії родів Thermococcus і Pyrococcus [8].
1.4. Властивості б-амілаз
1.4.1. Субстратна специфічність
Особливості просторової структури та кількість глюкозних залишків в полісахаридах впливають на активність амілолітичних ферментів. Даний ефект простежувався на прикладі б-амілази з B. licheniformis. Поступове накопичення продуктів гідролізу крохмалю протягом часу ферментації впливає на кінетичні характеристики ферменту. Значення КМ для різних субстратів знижувалося по мірі збільшення довжини олігосахаридів. Вища спорідненість б-амілаз до лінійних олігосахаридів з великою кількістю глюкозних мономерів пояснюється моделлю дії ферменту, запропонованою Kandra et al. [14]. Згідно даної моделі, б-амілазі з B. licheniformis властиві 8 субсайтів і 1 каталітичний сайт. Молекули вуглеводів з довгими глюкозними ланцюгами здатні окупувати більше центрів зв’язування субстрату у молекулі ферменту і формують стабільний фермент-субстратний комплекс, значно знижуючи енергію розриву глікозидних зв’язків. При використанні різних оліго- чи полісаридних субстратів для амілолітичних ферментів окрім довжини ланцюга, утвореного глюкозними залишками, слід враховувати відсотковий вміст б-1,4 і б-1,6 глікозидних зв’язків. Оскільки похідні амілози (наявні тільки б-1,4 глікозидні зв’язки) підвищують активність б-амілаз, тоді як похідні амілопектину – декстрини з великою кількістю б-1,6 глікозидних зв’язків в місцях розгалужень молекул гальмують амілази.
1.4.2. Вплив рН середовища
З усіх амілолітичних ферментів б-амілази відзначаються специфічним характером залежності активності від рН середовища. Ряд дослідників виявили наявність кількох рН-оптимумів для даних ферментів, отриманих з різних видів роду Bacillus: в області