1.4.3. Вплив температури

б-Амілази багатьох мезофільних мікроорганізмів посилено виділяються в навколишнє середовище при підвищених температурах: б-амілаза зі штаму Bacillus sр. TS-23 посилено секретується при 55°С [18], а зі штаму B. subtilis TN 106 – при 60°С [17]. Подібне явище, коли оптимальні температури росту мікроорганізмів і посиленої продукції ферменту значно відрізняються, властиві і іншим мікроорганізмам. Оскільки термостабільність має таке ж важливе значення для практичного застосування ферменту, як і алкалотолерантність, то більшість наукових пошуків спрямовані на виділення термостабільних амілолітичних ферментів. Більшість виділених термостабільних ферментів відносяться до б-амілаз. Так, б-амілаза з термофільного штаму Bacillus sр. SMIA-2 виявляла максимальну активність при 70°С [9]. Даний температурний оптимум властивий і для інших б-амілаз, отриманих з бактерій роду Bacillus [12, 18]. Амілолітичні ензими, стабільні при температурах вищих за 70°С, продукуються термофільними продуцентами: родами Pyrococcus, Thermoсoccus [8], а також окремими штамами роду Bacillus [19, 27]. Одним з перспективних напрямків прикладної мікробіології є селекція штамів бактерій роду Bacillus для виділення природних продуцентів термостабільних б-амілаз. Так, б-амілази з B. subtilis демонстрували найвищу активність при температурах 60-95°С [1], подібно до іншої б-амілази з B. subtilis, температурний оптимум для якої становив 99°С [16]. Термостабільні б-амілази, отримані з кількох штамів бактерій роду Bacillus, повністю зберігали амілазну активність навіть після 60 хв інкубації при 100°С [2]. Посилену термостабільність можливо отримати шляхом ненаправленого мутагенезу штаму-продуцента з використанням опромінення ультрафіолетом [4]. Перспективи промислового використання належать саме термостабільним ферментам, що прискорює і здешевлює біотехнологічні процеси.

2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

2.1. Штами та реактиви

В якості продуцентів термостабільної б-амілази використовували бактерії роду Вacillus, виділені з різних природних субстратів: ґрунту, сіна і молока. Було відібрано 76 штамів роду Вacillus з 7 районів Івано-Франківської області. Для отримання бактерій відповідний субстрат кип’ятили протягом 10 хв для елімінації наявної в ньому мікрофлори, а спори, що залишилися, пророщували протягом 2-3 діб при температурі 38-40єС. Поверхневий шар спільної культури висівали на чашки Петрі з селективним крохмальним середовищем [26]. Після 1-2 діб колонії найбільшого діаметру з морфологічними ознаками колоній роду Вacillus [4, 26] пересівали на скошені середовища аналогічного складу [26], які використовувалися в подальшому в якості продуцентів б-амілази. Належність отриманих штамів до роду Вacillus підтверджували даними світлової мікроскопії, фарбуванням клітин за Грамом, визначенням каталазної та б-амілазної активностей [26]. Виділені штами позначені як BKL1-76. Всі використані в роботі реактиви були вітчизняного виробництва найвищого доступного ступеня чистоти.

2.2. Умови культивування та отримання ферменту

Для отримання б-амілази культури бактерій зі скошених середовищ переносили мікробіологічною петлею в рідкі середовища культивування з концентрацію крохмалю 0,05% [16]. Культивування проводили в пробірках об’ємом 50 мл, загальний об’єм живильного середовища становив 25 мл. Бактерії вирощували при температурі 40єС при постійному прокачуванні повітря через середовище протягом 24 год (до настання пізньої стаціонарної фази). Клітини відділяли центрифугуванням (6000 g, 15 хв), а отриманий супернатант використовували в якості препарату ферменту.

2.3. Визначення активності б-амілази

Активність ферменту визначали модифікованим йодометричним методом, в основі якого лежить зменшення інтенсивності забарвлення комплексу крохмаль-йод внаслідок зниження концентрації крохмалю при дії б-амілази [2]. Поглинання комплексу крохмаль-йод вимірювали при довжині хвилі 620 нм на Specol 211 (Німеччина). Загальний об’єм проби становив 2,5 мл. При визначенні активності у нагріту до температури 40єС суміш 50 мМ калій-фосфатного буферу (рН 7,0) і 1% крохмалю додавали препарат ферменту з розрахунку 0,5-1,0 мкг білка на пробу, що дозволяло вимірювати поглинання суміші в межах калібрувального графіку. Інкубували 15 хв при температурі 40єС. Після інкубації суміш охолоджували протягом 3 хв при 0єС. Реакцію зупиняли додаванням 0,25% розчину J2 в 0,66% розчині KJ і 0,2 н HCl. Для проведення вимірювань в лінійному діапазоні і дисоціації ферменту від субстрату