де: скін – концентрація крохмалю в досліджуваній пробі після реакції, мг/мл; ДDпр – оптична густина досліджуваної проби після 15 хв ферментації; ДDкалібр – оптична густина певної точки калібрувального графіку, значення якої найближче до ДDпр; скалібр – концентрація крохмалю в даній точці калібрувального графіку, мг/мл.

Для більш точного визначення концентрації крохмалю в досліджуваних пробах замість перерахунку кожного значення отриманих оптичних густин відносно окремих точок калібрувального графіку нами використовувалося рівняння лінійної регресії, отримане за значеннями оптичних густин всіх проб калібрувального графіку. Рівняння відображало лінійну залежність між значеннями оптичних густин і концентраціями крохмалю. Для зменшення похибки вимірювання визначення активності проводили для кожної дослідної проби у двох повторах одночасно. Активність ферменту розраховували з формулою:

де: свих – вихідна концентрація крохмалю у пробах, мг/мл (0,2 мг/мл); скін – кінцева концентрація крохмалю у пробах, розрахована за рівнянням калібрувального графіку, мг/мл; Vпр – об’єм проби, мл (2,5 мл); 15 – час інкубації ферменту з субстратом, хв; Vпреп – об’єм ферментного препарату, мл; [pR] – концентрація загального білка, мг/мл.

За одиницю активності б-амілази приймали кількість ферменту, яка розщеплювала 1 мг крохмалю за 1 хв в перерахунку на 1 мг загального білка.

2.4. Визначення термостабільності б-амілази

Для виявлення термостабільних ферментів препарати б-амілази інкубували при 100єС на киплячій водяній бані протягом 10 хв. Питому активність визначали після інкубації, попередньо відцентрифугувавши денатуровані білки (6000 g, 15 хв). Отримані препарати термостабільних б-амілаз інкубували при 100єС протягом 10, 30 та 60 хв, визначаючи активність на кожному етапі для перевірки термостабільності в часі.

2.5. Визначення рН-залежності активності б-амілази

Залежність активності б-амілаз від рН середовища визначали в 50 мМ суміші цитратного (15 мМ), Тріс-HCl (15 мМ) і калій-фосфатного (20 мМ) буферів. З вихідного 50 мМ буферу, який проявляв буферну дію в широкому діапазоні рН, методом титрування HCl чи KOH готували серію буферів зі значеннями рН від 4,0 до 12,0. Отримані буфери використовували для визначення активності термостабільних ферментів при різних значеннях рН і приготування проб калібрувальних графіків з кожним буфером, замість 50 мМ калій-фосфатного буферу, враховуючи можливість додаткового кислотного чи лужного гідролізу крохмалю.

2.6. Визначення концентрації білка і статистична обробка результатів

Концентрацію загального білка визначали методом Бредфорда [6], за інтенсивністю забарвлення комплексу білка з барвником Кумасі яскраво-голубим, використовуючи для побудови калібрувального графіку сироватковий бичачий альбумін. Розрахунок концентрації білка в досліджуваних препаратах б-амілази проводили за допомогою рівняння калібрувального графіку з використанням комп’ютерної програми Excel.

Статистичну обробку результатів здійснювали за допомогою комп’ютерної програми MYNOVA [7], використовуючи критерій Даннетта. Дані представлені як середнє ± похибка середнього (M ± m).

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

3.1. Результати скринінгу продуцентів б-амілази

Скринінг продуцентів б-амілази проводили серед 76 штамів роду Вacillus, ізольованих з різних екологічних ніш з 7 районів Івано-Франківської області. На етапі попереднього відбору штами оцінювалися за розмірами і виглядом їхніх колоній на селективному середовищі. Оскільки для роду Вacillus властиві різнотипові колонії [4, 26], виділені штами оцінювалися за родовими критеріями [26], і в подальших дослідженнях використовувалися тільки штами, які являли собою рухливі палички з ендоспорами, грам-позитивні чи грам-варіабельні, які проявляли каталазну та б-амілазну активності.

3.2. Результати підбору умов культивування бактерій роду Вacillus

Для отримання б-амілази штами-продуценти культивували в середовищі з 0,05-0,025% концентрацією крохмалю, що індукувало посилений синтез ферменту [16]. Оскільки при вищих концентраціях крохмалю в середовищі культивування нами було отримано посилення секреції зовнішньоклітинних білків, як видно з мал.1., проте надлишок крохмалю зумовлює значну похибку при визначенні активності йодометричним методом.

Мал. 1. Підбір оптимальних концентрацій крохмалю у середовищі культивування Bacillus sp. штаму BKL 20

Act ? активність б-амілази, OD600 ? оптична густина бактерій, [pR] ? концентрація білка в середовищі культивування.

Дані представлені як відсотки відносно відповідного максимального значення.

Культивування проводили протягом 24 год до досягнення пізньої стаціонарної фази росту бактерій для накопичення ферменту в середовищі культивування. На мал. 2. і мал. 3. продемонстровано, що оптична густина суспензії бактерії (Мал. 2.) та активність б-амілази йодометричним методом (Мал. 3.) не змінюються протягом 72 год культивування.

Мал. 2. Зміна оптичної густини суспензій бактерій Bacillus sp.

Мал. 3. Зміна активності б-амілази протягом культивування бактерій Bacillus sp

Дані наведені для бактерій з 4 штамів, позначених як BKL.

3.3. Термостабільність виділених амілаз

Виділені штами характеризувалися різною активністю б-амілази від 1,06 (штам BKL8) до 85,9 (штам BKL3) Од/мг білка. Найвища б-амілазна активність була властива ферментам з найнижчою термостабільністю. При перевірці термостабільності б-амілаз з 76 виділених штамів після 10 хв при 100°С більшість ферментів зберігали від 5 до 30% активності відносно контролю без нагрівання. Проте ферменти з 15 штамів зберігали 30-100% б-амілазної активності навіть після 60 хв при 100°С. З даної групи термостабільних ензимів 8 б-амілаз зберігали близько половини вихідної активності (табл. 1.).

Таблиця 1

Вплив температури (100°С) на питому активність б-амілаз з середньою термостабільністю

Штам-продуцент | Активність б-амілази (Од/мг білка)

0 | Інкубація при 100°С (хв)

10 | 30 | 60

BKL6

BKL12

BKL22

BKL38

BKL52

BKL57

BKL58

BKL60 | 25,0 ± 3,14

24,0 ± 0,87

22,2 ± 1,54

23,1 ± 2,21

13,3 ± 0,53

8,55