9,52 ± 0,71

12,7 ± 2,42 | 6,26 ± 0,39**

4,17 ± 0,30**

6,79 ± 0,51**

6,62 ± 0,54**

3,07 ± 0,55**

4,79 ± 0,21**

3,89 ± 0,42**

5,89 ± 1,06** | 4,43 ± 1,81**

3,93 ± 0,24**

8,53 ± 0,23**

6,50 ± 0,93**

4,62 ± 0,99**

3,39 ± 0,15**

4,26 ± 0,18**

6,87 ± 0,95* | 10,9 ± 0,60**

5,62 ± 0,52**

10,4 ± 0,18**

12,0 ± 0,72**

5,29 ± 0,22**

5,28 ± 0,87**

4,97 ± 0,78**

4,86 ± 0,28*

Примітка.*значення достовірно відмінне від відповідного значення без інкубації при 100 °С з р<0,05; **р<0,01, n=3-6

Дані ферменти з середньою термостабільністю характеризуються майже втричі вищою б-амілазною активністю порівняно з рештою 7 б-амілазами з високою термостабільністю, які повністю зберігали активність протягом 60 хв інкубації при 100°С (табл. 2).

Таблиця 2

Вплив температури (100 °С) на питому активність б-амілаз з високою термостабільністю

Штам-продуцент | Активність б-амілази (Од/мг білка)

0 | Інкубація при 100°С (хв)

10 | 30 | 60

BKL20

BKL35

BKL40

BKL48

BKL51

BKL59

BKL62 | 8,03 ± 0,42

4,08 ± 0,68

8,61 ± 0,91

5,29 ± 1,85

5,10 ± 1,36

3,51 ± 0,71

5,41 ± 1,32 | 4,53 ± 1,34

4,22 ± 0,26

5,69 ± 0,96

4,70 ± 1,92

3,53 ± 0,30

3,42 ± 0,66

3,20 ± 0,37 | 4,88 ± 1,46

3,89 ± 0,21

8,21 ± 1,57

4,94 ± 1,55

5,23 ± 0,73

3,05 ± 0,86

4,23 ± 1,46 | 9,63 ± 2,12

4,24 ± 0,26

7,92 ±1,59

5,23 ± 1,02

4,75 ± 0,50

4,26 ± 0,72

4,99 ± 0,96

Примітка. n=3-6

3.4. рН-залежність активностей виділених амілаз

Залежність активності б-амілази від рН середовища визначалася для всіх 15 термостабільних ензимів (мал. 4. а, б). Всі термостабільні б-амілази відзначаються подібним характером рН-залежностей з двома рН-оптимумами. Слід зауважити, що один з рН-оптимумів досліджуваних нами ферментів знаходиться в області лужних значень рН (рН 9,0 та 10,0), що робить їх перспективними для практичного використання у промислових цілях (рис 3, б ) [5, 15, 25].

а б

Мал. 4. а, б. Вплив рН на активність термостабільних б-амілаз з Вacillus sp. Представлені дані типового експерименту.

Така властивість досліджуваних б-амілаз не є унікальною, оскільки вона характерна і для інших б-амілаз, отриманих з бактерій роду Вacillus [10, 29]. Для 6 термостабільних б-амілаз, які повністю зберігали свою активність після 60 хв інкубації при 100°С, характерна максимальна амілолітична активність при рН 9,0, а б-амілаза з штаму BKL35 відзначалася максимальною активністю при рН 10,0. Альфа-амілаза з штаму BKL20 характеризувалася значною активністю при рН 6,0, що надає можливість застосовувати її у процесах сахарифікації крохмалю [11]. Виділені ферменти виявляли 10-30% активності навіть при екстремальних значеннях рН 11,0 і 12,0. Значна алкалотолерантність б-амілази раніше досягалася методами напрямленого мутагенезу шляхом генного шифту [5].

Отже, в результаті скринінгу бактерій роду Вacillus нами отримані 15 продуцентів термостабільних б-амілаз, які зберігали від 30 до 100% амілолітичної активності після 60 хв інкубації при 100єС відносно вихідного значення без нагрівання; 7 термостабільних ферментів повністю зберігали свою активність після 60 хв інкубації при 100єС і характеризувалися значною активністю в області лужних значень рН, що робить їх перспективними для подальших досліджень і можливого практичного використання.

ВИСНОВКИ

1. Для отримання б-амілаз з підвищеною термо- та алкалостабільністю результативним є скринінг штамів бактерій роду Вacillus, виділених з різних субстратів, особливо з екологічно забруднених районів.

2. Доведено, що для отримання максимальної продукції амілолітичних ферментів оптимальними умовами є низькі концентрації крохмалю (0,05-0,025%) та культивування бактерій протягом 24 год.

3. Ряд виділених нами штамів бактерій роду Вacillus здатні продукувати б-амілази, стабільні в області високих температур і лужних значень рН, що робить їх перспективними для подальших досліджень і можливого практичного використання.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

Варбанець Л.Д., Мишак К.В., Мацелюх О.В. та ін. б-Амілази Вacillus subtilis // Мікробіол. журн. – 2006. – 68, №2. – С. 30–38.

Кубрак О.І., Лущак В.І. Скринінг штамів Bacillus sp. для отримання продуцентів термостабільної б-амілази // Мікробіол. журн. – Прийнято до друку.

Кубрак О.І., Лущак В.І. Мікробні амілази: характеристика, властивості та практичне застосування // Мікробіол. журн. – Прийнято до друку

Цурикова Н.В., Нефедова Л.И., Костылева Е.В. и др. Получение активного штамма Вacillus licheniformis – продуцента термостабильной б-амилазы // Прикл. биохимия и микробиология – 2002. – 38, №5. – С. 502–506.

Bessler C., Schmitt J., Maurer K.-H., Schmid R. Directed evolution of bacterial б-amylases: Toward enhanced pH-performance and higher specific activity // Prot. Sci. – 2003. – 12. – Р. 2141–2149.

Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. – 1976. – 72. – P. 248–254.

Brooks S.P.J. A simple computer program with statistical test for the analysis of enzyme kinetics // BioTechniques. – 1992. – 13. – P. 909–911.

Chung Y.C., Kobayashi T., Kanai H., Akiba T. et al. Purification and properties of extracellular amylase from the hyperthermophilic archeon Thermococcus profungus DT5432. // Appl. Environ. Microbiol. – 1995. – 64. – P. 1502–1506.

Cordiero C.A.M., Martins M.L.L., Luciano A.B. Production and properties of б-amylase from thermophilic Вacillus sp. // Braz. J. Microbiol. – 2002. – 33, №1. – P. 68–77.

Gastro G., Baigori M., Sineris F. Studies on б-amylase production by Вacillus licheniformis MIR-61. // Acta Biotechnol. – 1999. – 19, №3. – P. 263–272.

Haki G.D., Pakshit C.D. Developments in industrially important thermostable enzymes: a review // Biores. Technol. – 2003. – 89. – P. 17–34.

Jana M., Pati B. Thermostable, salt-tolerant б-amylase from Bacillus sp. MD 124. // J. Bas. Microbiol. – 1997. – 37. – P. 323–326.

Janecek