що як гідрофобний так і заряджений кінець кульки роблять свій внесок у взаємодію між кульковим пептидом і рецептором більш інтенсивно досліджувалась шляхом спострежння ефекту мутантних пептидів на інактивацію ShakerВ і maxi К+. В обох випадках було продемонстровано, що зміна загального заряду кульки (внаслідок мутації амінокислот в СООН ділянці) впливає на рівень інактивації як макроструму так і струму через ізольовані окремі канали. Цікаво, що ці зміни заряду пептиду модулюють лише рівень включення інактивації, в той час як рівень виключення інактивації залишається в основному незмінним. Таким чином, збільшення позитивного заряду кульки підвищує рівень включення, і навпаки, зниження позитивного заряду або підвищення негативного зменшує рівень включення інактивації. Ці ефекти електричного заряду максимальні в умовах низької іонної сили і мінімальні при високих сольових концентраціях. Всі разом ці результати було інтерпретовано з точки зору різноманітних елктростатичних взаємодій між позитивно зарядженою кулькою і негативно зарядженою поверхнею в, або поблизу внутрішнього гирла каналу. Електростатичний потенціал, індукований цими негативними зарядами буде спрямовувати кульку до її рецептора. З іншого боку заміна гідрофобних амінокислот полярними і незарядженими залишками з NH2 – кінця кулькового пептиду зменшує рівень макроскопічної інактивації; і цей ефект спостерігається головним чином через збільшення неблокованого рівня. Особливо важливими є мутації, які змінюють гідрофобність в позиції L7 (заміна лейцину). З цих даних видно, що тоді, коли інактиваційний домен взаємодіє зі своїм рецептором, гідрофобні взаємодії зв’язують їх докупи і сила цих взаємодій визначає рівень при якому канали повертаються до неінактивованої конформації, точніше до рівня, коли кулька дисоціює з рецептора.
Однак, профіль гідрофобності консервативний, що виходить з припущення про те, що гідрофобні взаємодії визначають стабільність комплексу кулькового пептиду з рецептором. На підтвердження цієї думки, було показано, що цитоплазматичний домен (коли він приєднується в якості химерної частинки) зв’язує сегмент 3 або 4 (мал.1) потенціал-залежних Na-каналів також здатний діяти як інактиваційна частинка для калієвих каналів. 3-4 зв’язок було запропоновано як інактиваційну кульку для Na-каналів. З цих досліджень і було зроблено висновок про те, що рецептор кулькового пептиду може мати негативний поверхневий потенціал, як було попередньо показано для внутрішніх ворітних калієвих струмів, і також обов’язково має мати гідрофобну поверхню, яка здатна взаємодіяти з першою половиною кулькового пептиду. Хоча реакція між кульковим пептидом і ShB6-46 К+ каналом бімолекулярна, в проміжку часу, який відповідає відновленню від заблокованого стану можна розрізнити два різні стани блоку. Дуже складно пояснити молекулярну природу кожного стану, але з огляду на дуже високий рівень константи зв'язування Q10 в реакції пептиду з каналом, Murrell-Lagnago and Aldrich запропонували гіпотезу про те, що два стани виникають через присутність кількох різних структурних форм пептиду в розчині. Підвищення температури збільшує концентрацію пептиду з правильною структурою для зв'язування.
Isacoff et al. встановили, що мутації в цитоплазматичній петлі, яка приєднує трансмембранні домени S4 і S5 спричинюють дикий тип інактивації в ShakerB і drk1, в яких інактивація індукується додаванням ShakerB - кулькових пептидів з внутрішньої сторони плазматичної мембрани. Відповідаючи дослідженням з кульковим пептидом, гідрофобний залишок має особливе значення для стабілізації інактивованого стану. Мутації цієї ділянки також змінюють властивості йонної провідності, з чого можна припустити їхній близький зв'язок з канальними структурами, через які перебігає йонний струм.
Деякі автори пропонують вважати, що близькість залишків, задіяних в процесі швидкої інактивації до S4 домену може створювати основу тісного зв'язку між активацією та інактивацією. Конформаційні зміни внаслідок вилучення заряджених залишків S4 спіралі можуть збільшувати афінність кульки до її рецептора. На підтримку взаємодії між доменами, задіяними в процесах активації та інактивації, Bozanilla показав, що присутність інактиваційної частинки ShakerB каналів сповільнює переміщення воротних зарядів під час припинення деполяризаційних пульсів. Ці результати змушують думати про можливість конформаційних перебудов, а не просто взаємодію кульки з рецепторами в процесах активації та інактивації.
Механізм блокування кульковим пептидом.
Як зазначалося вище, інактиваційна частинка поводиться схоже на блокатор йонного струму. Це було продемонстровано, використовуючи ТЕА блокатори К+ каналів в гігантському аксоні кальмара. Для того, щоб зрозуміти механізм блокування інактиваційною частинкою, необхідно повернутися до класичної біофізики.
Armstrong встановив, що внутрішньоклітинний ТЕА блокує лише канали у відкритому стані, що пов'язується з думкою про те, що ТЕА глибоко проникає в середину каналів, перекриваючи потік йонів. Така ідея протилежна до думки про можливу алостеричну дію, яку виявляє ТЕА, індукуючи довготривалі конформаційні зміни і порушення провідності йонів через канальні структури.
Виходячи з припущення про локалізацію блокатор-зв'язуючої ділянки, можна прогнозувати, що збільшення йонного струму через канал здатне дестабілізувати взаємодію блокатора з каналами і таким чином пом'якшувати блокаду.
Властивості інактиваційної частинки ShakerB як блокатора відкритих каналів також були продемонстровані.
Demo and Yellen показали, що час відновлення від інактивації (тобто час, потрібний для того, щоб канальний білок повернувся від інактивованого стану до закритого неінактивованого стану) скорочується за присутності високих концентрацій К+ в зовнішньому середовищі. Це узгоджується з ідеєю про "пом'якшення інактивації".
Експерименти з ізольованими каналами підтвердили точку зору про те, що канали інактивуються у відкритому стані. Точніше, для того, щоб інактивуватись, канал спочатку має відкритися, а після приєднання, інактиваційна частинка заважає каналові повернутися до закритої конформації. Отже, просту кінетичну модель актиації можна зобразити таким чиом: С-О-І. Для того, щоб перейти від інактивованого до закритого стану, каналові необхідно відкритися. (мал.2) Інактиваційний ShakerB кульковий пептид поводиться як блокатор відкритих каналів.
Стехіометрія інактиваційної реакції.
З вищесказаного