Після проведення реакції оберненої транскрипції, отримані молекули кДНК можуть служити мішенню для проведення ПЛР.

Аналіз ПЛР-ампліфікованої ДНК

Для аналізу ПЛР-ампліфікованої ДНК використовують різні методи. Ми розглянемо три найбільш простих: гель-електрофорез, дот-блот-гібридизацію і блот-гібридизацію по Саузерну. З їхньою допомогою можна аналізувати більшість ПЛР-продуктів, але абсолютно точні результати можна одержати тільки секвенуванням.

Підготовка ПЛР-продуктів

Насамперед необхідно видалити мінеральну олію, що покривала реакційну суміш. Для цього в пробірку для ПЛР додають краплю хлороформу, пробірку струшують і центрифугують при 12 000 g протягом 1 хв, щоб відокремити водяну фазу, що містить ПЛР-продукти. Ампліфіковану; ДНК можна зберігати з хлороформом при 4 °С протягом декількох тижнів. Для наступного аналізу звичайно беруть від 1/10 до 1/5 обсягу реакційної суміші.

При використанні ДНК виділення з кліток крові підготовчі роботи не проводяться.

Гель-електрофорез

Електрофорез в агарозном гелі дозволяє легко, без застосування радіоізотопів, знайти ампліфіковану ДНК і визначити її розмір. Зупинимося на деяких її особливостях стосовно аналізу ПЛР-ампліфікованої ДНК. 10-20 мкл ампліфікованої ДНК розділяють у 2% агарозном гелі з додаванням спеціального барвника ДНК, наприклад, бромистого етидія разом зі стандартними фрагментами розміром 50-1000 п.н. При заливанні за допомогою гребінок у гелі формують спеціальні лунки, у які надалі вносять продукти ампліфікації. При використанні ДНК виділеної з клітин крові використовують 5 мкл ампліфікованої ДНК змішують з 3 мкл барвники на парафилме і наносять у лунку.

Пластину гелю поміщають в апарат для горизонтального гель-електрофорезу і підключають джерело постійної напруги. Негативно заряджена ДНК починає рухатися в гелі від мінуса до плюса. При цьому більш короткі молекули ДНК рухаються швидше, ніж довгі. На швидкість руху ДНК у гелі впливає концентрація агарози, напруженість електричного поля, температура, склад електрофорезного буфера і, у меншому ступені, ГЦ-склад ДНК. Усі молекули одного розміру рухаються з однаковою швидкістю. Барвник вбудовується (інтеркалірує) площинними групами в молекули ДНК. Після закінчення електрофорезу, що продовжується від 10 хв. до 1 години, гель поміщають на фільтр трансіллюмінатора, що випромінює світло в ультрафіолетовому діапазоні (254 - 310 нм). Енергія ультрафіолету, що поглинається ДНК в області 260 нм, передається на барвник, змушуючи його флуоресценувати в оранжево-червоній області видимого спектра (590 нм).

Яскравість смуг продуктів ампліфікації може бути різною. Тому часто в ПЛР-лабораторіях прийнято оцінювати результат по трьох- чотирьох чи п'ятьох- бальній системі. Однак, як уже відзначалося раніше, це не можна зв'язувати з початковою кількістю Днк-мішені в зразку. Часте зменшення яскравості світіння смуг зв'язано зі зниженням ефективності ампліфікації під впливом інгібіторів або інших факторів.

Електрофорез проводять при високій напрузі (10-15 В/див), оскільки утворювані при ПЛР невеликі фрагменти складно детектувати після електрофорезу протягом ночі при невеликій напрузі внаслідок їхньої інтенсивної дифузії. Розділення можна підвищити, використовуючи поліакриламідні або агарозні гелі NuSieve (FMC Bio-Products, Rockland, USA) з високою концентрацією агарози (3-4%). Утім, якщо аналіз потрібно провести швидко і при невеликих витратах, цілком прийнятні 2% агарозні гелі.

Звичайно при ампліфікації ДНК, виділеної з фіксованих тканин, вихід ПЛР-продуктів нижчий і вони менш специфічні, чим у випадку ампліфікації високоочищеної ДНК.  

Інструкція 1 по приготуванню агарозного гелю (50мол).

Агарозний гель складається з 1,8% агарози і 98,2% Трис-буфера.

Зважуємо агарозу (0,9г).

Переносимо агарозу в термостійку колбу.

Додаємо 50мол трис-буфера в колбу.

Установлюємо плашку, установлюємо гребінку на плашку.

Плавимо агорозу шляхом нагрівання в мікрохвильовій печі до одержання однорідного розчину.

Додаємо барвник етидіум бромід у колбу і перемішуємо.

Заливаємо агарозний гель на плашку.

Гібридизація ПЛР-ампліфікованої ДНК по Саузерну

Цей метод дозволяє ідентифікувати смуги в гелі, що спостерігаються після електрофорезу ампліфікованої ДНК. Для гібридизації використовуються як ізотопно, так і неізотопно мічені зонди. Докладно метод гібридизації ПЛР-продуктів описаний у протоколі 1. 

Протокол 1. Гібридизація ПЛР-ампліфікованої ДНК по Саузерну

Матеріали*

Буфер для денатурації: 1,5 М NaOH, 0,5 М NaCl*

Буфер для нейтралізації: 1,5 М трис-Нс1, 0,5 М NaCl, p 6,5*

20 х SSPE: 3,6 М NaCl, 0,2 М фосфат натрію, 0,02 М ЄДТА, рН 7,4*

10% (в/о) ДСН

Методика

1.Для денатурації фрагментів ДНК гель вимочують у буфері для денатурації при обережному погойдуванні протягом 30 хв. при кімнатній температурі, потім витримують у буфері для нейтралізації протягом 30 хв.

2. За цей час вимочують найлоновий фільтр для переносу ДНК у 6 х SSPE протягом 5хв. (або довше). Ми використовуємо фільтри Genetrans 45 (Fiasco, Wolburn, Massachusetts, USA).

3. Збирають систему для переносу ДНК, і проводять перенос при кімнатній температурі протягом ночі. Як буфер для переносу використовують 20 х SSPE.

4. По закінченні переносу знімають фільтрувальний папір і відзначають положення лунок на фільтрі. Фільтр знімають і для видалення прилиплої агарози промивають у 20 х SSPE протягом 1 хв.

5. Пришивають ДНК до фільтра, помістивши останній (стороною з ДНК нагору) на 5 хв під УФ-лампу (254 нм). Можна скористатися і спеціальним приладом для пришивання ДНК (Stratagene, La Jolla, California, USA).

6. Поміщають фільтр у поліетиленовий пакет і запаюють його. Проводять предгібридизацію при 42 0С протягом 10 хв. і гібридизацію з відповідним міченим зондом при тій же температурі протягом 30-60 хв. Як зонд звичайно використовують 5-мічені за допомогою полінукле-отидкінази олігонуклеотиди.

7. Промивають фільтр у двох-трьох змінах 2 х SSPE, 0,1 % ДСН, по 5 хв. у кожній зміні. Іноді на цьому етапі проводять відмивання й у більш жорстких умовах, але необхідність цієї процедури визначають експериментальним шляхом.

8. Гібридизований зонд виявляють за допомогою радіоавтографії або неізотопними