Дот-блот-гібридизація ПЛР-ампліфікованої ДНК

Дот-блот-гібридизація дає просту відповідь по типу так-ні й особливо корисна в тих випадках, коли проводиться аналіз великого числа зразків. Один із прикладів застосування цього методу описаний у протоколі 2. 

Протокол 2. Дот-блот-гібридизація ПЛР-ампліфікованої ДНК

Матеріали*

Розчин для денатурації: 0,4 М NaOH, 1 мм ЭДТА*

20 х SSPE (див. протокол 15.7)*

Найлоновий фільтр*

Прилад для одержання дот-блотів

Методика

1. Вимочують найлоновий фільтр у дистильованій воді не менш 5 хв.

2.10-20 мкл ПЛР-ампліфікованої ДНК додають до 300 мкл. розчину для денатурації (денатурація при цьому відбувається практично миттєво).

3. Кожен зразок вносять в окремий осередок приладу для одержання дот-блотів; стежать за тим, щоб для усмоктування зразка з осередку було потрібно близько 1 хв.

4. Промивають кожен осередок 20 х SSPE три рази по 5 хв.

5. Виймають фільтр із приладу й обполіскують його в 20 х SSPE.

6. Виконують операції, описані в протоколі 15.7, починаючи з п. 5.

Інтерпретація результатів

Результат ПЛР можна кваліфікувати як позитивний чи негативний у залежності від того, виявлена в зразку інтересуюча нас мішень чи ні. Однак порушення нормального ходу ампліфікації, недостатня чутливість методу і непередбачений поліморфізм послідовності-мішені в області зв'язування праймерів чи гібридизаційного зонда може дати помилково негативний результат. У випадку забруднення зразків і випадкової гомології між зондом, праймерами і послідовністю, подібною з мішенню, виходять помилково негативні результати. Проблеми, що виникають у зв'язку з перехресними реакціями за участю зонда або праймерів і можливим поліморфізмом.

Вибір контролів

Дуже важливим для правильної інтерпретації результатів є вибір контролів. Позитивні і негативні конт-ролі повинні бути добре охарактеризовані. Часто використовують ДНК із клітинних ліній, що завідомо містять чи не містять послідовність-мішень. У кожнім аналізі потрібні як мінімум три контролі:*

позитивний контроль;*

негативний контроль;*

бланк-контроль.

Бланк-контроль — це реакційна суміш, у якій присутні усі компоненти, за винятком ДНК; він є індикатором забруднень. Один тип позитивного контролю повинний містити максимальне число послідовностей-мішеней, інший — невелике їхнє число. Це дозволяє визначити чутливість і ефективність ПЛР.

У деяких випадках ампліфікація взагалі не відбувається, і якщо є підстави думати, що отриманий результат помилково негативний, дуже важко визначити, по якій саме причині. Щоб вирішити цю проблему, кожен зразок необхідно тестувати, провівши ампліфікацію якої-небудь геномної послідовності, наприклад гена рецептора ліпопротеїнів низької щільності або р-глобінового гена. При цьому розмір геномної послідовності-мішені повинний бути небагато більший, ніж досліджуваний; це дозволить переконатися, що ДНК зразка не занадто сильно деградована. При ПЛР будь-якого зразка тканин людини геномна ДНК повинна ампліфікуватися. Відсутність ампліфікації може означати інгібування ферменту, сильну деградацію ДНК чи те, що її занадто мало. У цьому випадку треба повторити ампліфікацію зразка, збільшивши і зменшивши кількість ДНК-матриці або збільшивши концентрацію ДНК-полімерази Tag. Ампліфікація може бути відсутня незважаючи на всі прикладені зусилля. Це може бути зв'язане із сильним некрозом досліджуваної тканини або фіксацією препарату не в 10% формаліні, а в інших фіксаторах. У цьому випадку єдиним виходом є повторна біопсія.

Геномні праймери можна використовувати в одному раунді ПЛР разом із праймерами, специфічними у відношенні послідовності-мішені: ампліфікація двох послідовностей йде при цьому одночасно (див. Протокол 4). Такий множинний ПЛР-тест може бути менш чуттєвим, чим той, у якому використовується один набір праймерів, але він виключає появу помилково негативного результату.

Чутливість

Визначити чутливість ПЛР-методу стосовно аналізу фіксованих і залитих у парафін препаратів досить складно. Це зв'язано з відсутністю добре охарактеризованих катаних тканин з відомим змістом послідовності-мішені, а чутливість методу при аналізі очищеної ДНК і ДНК, отриманої з фіксованих формаліном тканин, за таких самих умовах помітно розрізняється.

Однак у даний час існує можливість створювати штучні фіксовані тканини з відомим змістом послідовності-мішені на основі добре охарактеризованих клітинних ліній. Для цього змішують клітки, що містять потрібну послідовність і не містять її, суміш фіксують у формаліні і заливають у парафін. Отриманий блок нарізають і обробляють так само, як біоптати тканин, проводять ПЛР і визначають чутливість методу. І хоча цей метод не дозволяє визначити чутливість ПЛР-методу з такою високою точністю, як цього хотілося б (див. нижче), він вказує напрямок до правильної інтерпретації результатів.

Рис. 4. Чутливість ПЛР-аналіза, проведеного на фіксованих формаліном і залитих у парафін тканин.

Суміш кліток Raji (приблизно 50 копій ДНК EBV на клітку) і Molt 3 (не містять EBV) збирали центрифугування, фіксували в 10% забуференному формаліні протягом 1 год. і заливали в парафінові блоки. Робили зрізи товщиною 10 мкм, що містять приблизно по 1000 кліток, обробляли їх, і проводили ПЛР-аналіз з використанням геномних і EBV-специфічних праймерів. Продукти ампліфікації аналізували за допомогою дот-блот-гібридизації з геномним і EBV-специфічним зондами. Як і треба було очікувати, гібридизація з геномним зондом відбувалася у всіх клітинних сумішах, а з EBV-спецефічним спостерігалася тільки в суміші, у якій частка кліток лінії Raji складала 0,01, але не 0,001 або 0,0001. Таким чином, при тих умовах, у яких проводилася ПЛР, вдається виявити приблизно 10 EBV-інфікованих клітин на 1000 нормальних (число клітин, з яким проводився ПЛР-аналіз). Підвищити чутливість можна, змінивши умови проведення ПЛР або використовуючи для аналіза більшу кількість клітин.

Кількісний ПЛР-аналіз

Логічно думати, що кількість утворюваних при ПЛР ДНК корелюється з числом послідовностей-мішеней в аналізованому зразку. Однак так буває не завжди. Часто такі виключення спостерігаються при роботі з препаратами тканин, залитими в парафін: у цьому випадку число факторів, що впливають на ефективність ампліфікації, особливо велике. Це може бути природа тканини, спосіб фіксації і її тривалість, час, що