пройшов від моменту одержання тканини до її фіксації, «вік» парафінових блоків, розмір зрізу, кількість виділеної і використаної для ПЛР ДНК.
Часто клінічні зразки отримують в умовах, далеких від оптимальних, що теж утрудняє проведення кількісного аналізу, особливе визначення абсолютної кількості послідовності-мішені. Для таких препаратів розроблений простий відносний метод, заснований на ПЛР-аналізі декількох розведень препарату ДНК. Для цього готують послідовні десятикратні розведенням ДНК у воді і проводять ампліфікацію в умовах, що дозволяють одержати максимальну чутливість; число циклів ПЛР при цьому може досягати 50. Такий аналіз дозволяє оцінити мінімальне число послідовностей-мішеней у препараті, оскільки при досить сильному розведенні ампліфікація повинна припинитися. Якщо паралельно проводити ампліфікацію якої-небудь геномної послідовності, то можна визначити співвідношення між числом клітин і числом послідовностей-мішенів. При відомому числі клітин у препараті (наприклад, у препараті СМЖ) інтерпретацію результатів проводять так, як це описано в табл. 2.
Таблиця 2. Визначення чутливості методом розведення
Число ампліфікованих кліток | Послідовність-мішень | Геномна послідовність | Інтерпретація
100000 | + | + | 1 мішень/100000 кліток
10000 | + | + | 1 мішень/ 10000 кліток
1000 | + | + | 1 мішень/ 1000 кліток
100 | + | + | 1 мішень/ 100 кліток
10 | + | + | 1 мішень/10 кліток
1 | + | + | Мішень практично
у кожній клітці
0 | - | - | Система працює нормально
Точна кількість кліток в останніх розведеннях визначити неможливо внаслідок помилок у піпетуванні і пуассонівському розподілу числа клітин. Геномні послідовності повинні ампліфікуватися і детектуватися на рівні приблизно 1 клітини. У цьому випадку, якщо послідовність-мішень міститься в 1% клітин, останнє розведення, що дає позитивний сигнал, повинне відповідати 100 клітинам.
В даний час ПЛР-тести можна ставити тільки в спеціально оснащених клінічних лабораторіях. Зразки тканин, одержувані при звичайних хірургічних операціях, фіксують формаліном і заливають у парафін. Такі препарати можна досліджувати методом ПЛР, що при необхідності дозволяє провести молекулярно-генетичний аналіз без заморожування і збереження препаратів.
