Н2О2 +2GSH > GSSG + 2H2O (7)

Для відновлення окисленої форми глутатіону [25] необхідний кофермент НАДФН, який утворюється в пентозофосфатному шляху. Ключовим ферментом ПФШ є глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа [7], яка перетворює глюкозо-6-фосфат (Г-6-Ф) у 6-фосфоглюколактон (6-ФГЛ). Саме в ході цієї реакції утворюється більша частина НАДФН:

Г-6-Ф + НАДФ+ > 6-ФГЛ + НАДФН + Н+ (8)

1.4. Респіраторна активність дріжджів

Класичним методом для визначення виживання клітин дріжджів є утворення колоній. При використанні росту клітин (мітотична життєздатність) в якості маркера виживання, важливо мати на увазі, що пошкодження різних видів може спричинювати затримку клітинного циклу. Але при цьому клітини можуть залишаються метаболічно компетентними. Таким чином існує альтернативний метод для визначення виживання клітин, який грунтується на їх метаболізмі [18].

Таким чином, клітин, які пережили стресові умови можна поділити на три групи:

клітини, здатні до утворення колоній;

метаболічно компетентні клітини, проте не здатних до репродукції;

мертві клітини.

Для визначення кількості мертвих клітин використовують деякі барвники. Серед них відомий метиленовий синій. Оскільки клітинні стінки мертвих клітин є пошкодженими, то вони стають проникними для них. Труднощі виникають з живими клітинами. Проте існує барвник, який здатний проникати в життєздатні клітини.

2,3,5-трихлортетразоліумхлорид (або ТТС) – це водорозчинний та безбарвний барвник, який в живих клітинах здатний відновлюватися до нерозчинного у воді формазану червоного кольору (Рис. 2). Дана реакція відновлення проходить у мітохондріях через ЕТЛ, де ТТС виступає ефективним акцептором електронів. Утворення кількості формазану є прямо пропорційним кількості живих клітин. Цей тест має кілька застосувань у дріжджів S. cerevisiae, зокрема для визначення редуктазної активності NAD(P)H цитохрому с, для виявлення мутацій в дихальному ланцюзі та визначення респіраторної активності (здатності до дихання) [18].

Рисунок 2. Відновлення водорозчинного та безбарвного барвника 2,3,5-трихлортетразоліумхлориду (ТТС) до нерозчинного у воді формазану червоного кольору в мітохондріях живих клітин [18] .

Останні є дуже важливими, адже відомо, що в клітинах, які дихають, постійно відбуваються процеси утворення АФК та їх знешкодження. А отже є можливість виникнення оксидативного стресу. В таких умовах, зазвичай, клітини інтенсивніше дихають. Такого ж ефекту можна досягти, індукуючи стрес різними несприятливими чинниками, зокрема пероксидом водню.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Штами. В дослідженнях використовували штами Sассharomyces cerevisiae YPH 250 (дикий тип, MATб trpl-l, his3-200, lys2-l, ade2-101, ura3-52, leu2--l ) та його похідний дефектний за генами обох ізоформ СОД (YPH 250 sod1:: can1 sod2:: can1), які були люб’язно надані доктором Y. Inoue (Кіотський університет, Японія).

Умови культивування та оцінка виживання клітин. Дріжджі вирощували при 28оС за умов аерації у середовищі YPD, яке містило 2 % (за масою) ферментативного пептону, 1 % (за масою) дріжджового екстракту, 2 % (за масою) глюкози або фруктози. Для досліджень відбирали відповідний об?єм нічної культури і розводили середовищем такого ж складу у співвідношенні 1:50. Культури вирощували на шейкері (180 об/хв.) при 28оС до досягнення необхідної фази росту. Виживання клітин визначали за їхньою здатністю утворювати колонії на твердому живильному середовищі в чашках Петрі. Стресові умови індукували обробкою дріжджів пероксидом водню різних концентрацій протягом 30 хв при 28оС. Для контролю клітини інкубували протягом того самого часу за тих самих умов без пероксиду водню. Для дослідів дріжджі відбирали на 14 год культивування.

Визначення респіраторної активності. Клітини дріжджів вирощували в середовищі YPD того ж складу і в тих же умовах. Для експерименту культури відбирали на третій добі росту (72 год). У пробі об'ємом 1 мл середовища містилось 3 млн клітин. Клітини обробляли 100 мМ пероксиду водню протягом різного часу (часова залежність) або різними концентраціями пероксиду водню протягом 30 хв (концентраційна залежність). Клітини центрифугували та ресуспендували 50 мМ калій-фосфатним буфером. Відцентрифуговані клітини інкубували разом із 350 мкл барвнику протягом 20 год в темноті. Після цього їх руйнували скляними кульками, а барвник екстрагували ацетоном. Респіраторну активність визначали, реєструючи поглинання світла формазаном при довжині хвилі 485 нм [18].

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

3.1. Виживання S. cerеvisiae, вирощених на глюкозі та фруктозі, за дії пероксиду

Дріжджі S. cerеvisiae за час свого розвитку проходять такі фази росту: lag фаза, експоненційна та стаціонарна фази. Для отримання культур дріжджів у необхідній фазі росту, ми визначали криві росту S. cerеvisiae в живильному середовищі YPD. Раніше нами було виявлено, що на 14 год росту культури знаходяться на експоненційній фазі. На цій стадії клітини інтенсивно діляться і їх кількість зростає в геометричному порядку. Проте саме в логарифмічній фазі клітини дріжджів чутливі до дії різних несприятливих факторів, зокрема до АФК. А щоб вижити, вони змушені швидко пристосовуватися до нових умов.

В наших попередніх дослідженнях було показано, що виживання та поділ клітин, вирощених на фруктозі був вищим, ніж дріжджів, які росли на глюкозі.

Отже, першим етапом нашої роботи було вивчення впливу пероксиду водню різних концентрацій на життєздатність клітин S. cerеvisiae, вирощених на обох джерелах вуглецю, в експоненційній фазі росту. Для цього клітини, взяті з культур на цій фазі росту, піддавали дії