Після повернення в Париж Пастер почав вивчати проблему мимовільного зародження. Вона начебто, не мала безпосереднього відношення до біологічної теорії бродіння, але, установивши, що бродіння викликається мікроорганізмами, Пастер не міг пройти повз теорію, відповідно до якої мікроби здатні самозароджуватись в органічних сполуках. Якщо це так, то погляди Пастера на бродіння вимагали перегляду, захищати рідини, що бродять, від сторонніх мікробів було беззмістовно і вся технологія бродильних виробництв, заснована на внесенні в рідину культур мікробів, втрачала своє значення. Питання про мимовільне зародження мав тривалу історію, у цій області багато хто експериментували, але приходили до різних висновків.

З розвитком науки зменшувалися розміри об'єктів, мимовільне зародження яких вважалося можливим. Якщо в XІ столітті самозародження бджіл, чи мишей хробаків уже вважалося абсурдним, то ряд відомих професорів і натуралістів допускали самозародження мікроорганізмів. У наші дні погляди деяких учених на появу вірусів у рослинній клітині в якомусь ступені нагадують погляди прихильників самозародження.

Навколо питання про здатність мікробів самозароджуватися в середині XІ століття велися настільки запеклі суперечки, що Академія наук у Парижі в 1860 р. оголосила премію за рішення цього питання. В умовах конкурсу було наступне місце: премія буде присуджена тому, "хто своїми бездоганними дослідами доведе, спростує самозародження". Цю премію одержав Пастер. Вивчення робіт своїх попередників дозволило йому як блискучому експериментатору не тільки установити істота їхніх методичних помилок, але й уникнути у своїх досвідах найменших дефектів методичного характеру. От що він писав з цього приводу: "Я не вводжу нових методів дослідження, я обмежуюся тільки тим, що намагаюся робити досвід добре в тому випадку, коли він був зроблений погано, і уникаю тих помилок, унаслідок яких досліди моїх попередників були сумнівними і суперечливими". Багато учених, що працювали раніше в цій області, складність проблем усе це робить зрозумілим, чому друзі Пастера усіляко відговорювали його починати ці дослідження. Не побоявшись застережень, Пастер послідовно, з винятковою переконливістю спростовував доводи прихильників самозародження.

Круглими балонами з відтягнутою шийкою, він кип'ятив цукровий розчин, що міститься в них, чи настої дріжджову воду і запаюючи балони, переконувався в тім, що рідина залишалася прозорою.

В Політехнічній школі Парижа тривалий час зберігалися балони Пастера і через 80 років рідина була зовсім прозорою. Модифікуючи методику самих досвідів, Пастер довів, що при кип’ятінні не відбувається зміни самої рідини й у ній можуть розвиватися зародки, якщо внести їх у балон разом з рідиною. Тим самим він спростував припущення, начебто повітря, що знаходиться над рідиною, у результаті нагріванні стає непридатним для підтримки життя. Пастер кип'ятив рідину у балонах, але в природі існують спороносні мікроби, що витримують навіть тривале кип'ятіння. Це спонукало провести стерилізацію розчину під тиском при більш високій температурі. У результаті перевірки робіт Бастіана народилася ідея створити автоклав, так широко застосовуваний тепер у лабораторній практиці і промисловості. Пастер вперше показав, що в балон мікроби попадають з повітрям, у якому, разом з частинками пилу, носяться клітки мікроорганізмів. У час своєї блискучою науково-популярної лекції про мимовільне зародження, що дотепер можна вважати неперевершеним зразком, що сполучить строгу науковість з ясністю і художністю викладу, Пастер продемонстрував у затемненому залі смугу світла, де переміщалися частинки пилу. Виходячи з результатів досліджень Пастера, Тіндаль провів дуже витончений дослід. Відкриваючи балони, вміщаючі стерильну рідину, у різних місцях і надалі запаюючи балони, він знайшов, що в сільській місцевості рідина стає мутної в багатьох балонах, тоді як в Альпах на льодовику Морді Гляс, майже у всіх балонах рідина залишається прозорою. Таким чином, Пастеру належать дослідження про розповсюдження мікроб у природі. В 1862 р. Пастер був обраний в Академію наук але секції мінералогії. Він був призначений професором Школи образотворчих мистецтв, а в 1867 р.- професором природного факультету в Паризькому університеті, всі ці роки він вивчав причини бродіння, але двічі змінював тематику своїх досліджень.

Другим відхиленням було здійснено тим, що Франція, у якій шовківництво відігравало велику роль, несла значні економічні втрати і з-за епідемічних захворювань шовковистих хробаків. Якщо судити по особистих записах Пастера, то в нього не було великого бажання займатися цим питанням, тому що це була далека для хіміка і далека від його інтересів область. На це пішло п'ять років завзятої роботи. Як завжди, Пастер з винятковою старанністю вивчив монографії і статті, присвячені шовководству і хворобам гусениць шовкопряда. Одна з хвороб викликалась блискучими тільцями, що завжди виявлялися в хворих комах і були відсутні в здорових. Сама хвороба полягала в появі чорних плям на тілі гусіні, що нагадує частинки здрібненого перцю. Звідси назва хвороби - пебрина. Інша хвороба - фляшерія - викликалася коковидними бактеріями, що розташовувалися ланцюжком (стрептококи). Пастер установив, що блискучі тільця можуть усіляким шляхом попадати в тіло гусениці. Вони можуть потрапити через ранки, нанесені на шкірочку коготками інших гусениць, збудники пебріни знаходяться в пилу червоводен, вони знаходяться також на листках шовковичного дерева, і при поїданні таких листків здорові гусениці занедужують. Крок за кроком Пастер ви яснив