ОЧИСТКА І ВЛАСТИВОСТІ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗИ ІЗ ПЕЧІНКИ СВИНІ

Дипломна робота для здобуття кваліфікації

спеціаліст-біолог

ЗМІСТ

с.

СПИСОК СКОРОЧЕНЬ………………………………………………..4

ВСТУП …………………………………………………………………5

1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ …………………………………….............7

1.1. Антиоксидантна система організму……………………….7

1.2. Коротка історія відкриття СОД…………………………….9

1.3. Виділення, деякі характеристики і регуляція експресії СОД………………………………………………………….9

1.4. Супероксиддисмутази еукаріотів та прокаріотів ….….…11

1.5. Локалізація СОД в клітині………………………………...13

1.6. Будова активного центру Cu,Zn-CОД…………………….14

1.7. Взаємодія активного центру СОД з супероксиданіоном..14

1.8. Методи визначення активності СОД……………………..18

2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ……………...........20

2.1. Матеріали і реактиви ………………………………............20

2.2. Гомогенізація і отримання супернатанту............................20

2.3. Висолювання сульфатом амонію……………………..........21

2.4. Діаліз препаратів ………………………...............................22

2.5. Визначення активності СОД.................................................23

2.6. Визначення концентрації білка ……………………………24

2.7. Електрофорез в поліакриламідному гелі.............................24

2.8. Визначення термостабільності СОД....................................25

2.9. Інгібування СОД диетилдитіокарбоміновою кислотою....26

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ ……….27

3.1. Очистка і активність СОД з печінки свині…..……….......27

3.2. Електрофорез……….............................................................29

3.3. Вплив температури на активність СОД..............................29

3.4. Інгібування Cu,Zn-СОД........................................................30

3.5. Обговорення отриманих результатів……………………..32

ВИСНОВКИ …………………………………………………………34

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ ……………………………….....................35

СПИСОК СКОРОЧЕНЬ

- Активовані форми кисню – АФК;

- Супероксиддисмутаза – СОД;

- Марганець-вмісна супероксиддисмутаза – Mn-СОД;

- Залізовмісна супероксиддисмутаза – Fe-СОД;

- Мідь,цинк-вмісна супероксиддисмутаза – Cu,Zn-СОД;

- Тетраетилметилетилендиамін – ТЕМЕД;

- Етилендиамінтетраацетат – ЕДТА;

- Диетилдитіокарбамінова кислота – ДДК;

- Калій-фосфатний буфер – КФБ;

- Фотоелектроколориметр – ФЕК;

- Фенілметилсульфонілфторид – ФMСФ.

ВСТУП

В більшості хімічних реакцій, які проходять в живому організмі, в ролі акцептора електронів виступає кисень. При цьому в залежності від типу і умов реакцій в якості проміжних чи побічних продуктів можуть утворюватися активовані форми кисню (АФК), до яких належить супероксид-аніон (О2-), пероксид водню (Н2О2) і гідроксил-радикал (НО*) [1-7].

В нормі в живих клітинах існує баланс між утворенням активованих форм кисню і їх розпадом внаслідок роботи антиоксидантної системи. Цей баланс забезпечує нормальний розвиток організму в цілому.

Оксидативний стрес – стан, коли генерація вільно-радикальних форм кисню в організмі починає перевищувати потужність антиоксидантних систем. За таких умов пошкоджуються практично всі компоненти клітини. Пошкодження, ініційовані АФК, в більшості випадків локалізуються в місцях розташування йонів перехідних металів, в першу чергу заліза і міді. У білках вони приводять до окислення сульфгідрильних груп цистеїну, імідазольних груп гістидину, циклічних кілець тирозину, фенілаланіну, триптофану, що приводить до модифікації самих білків [3-5]. Дія АФК на ДНК призводить до розриву нуклеотидного ланцюга, модифікації вуглеводної частини і азотистих основ нуклеотидів, що є причиною появи точкових мутацій в самому ланцюгу ДНК. У ліпідах АФК приводять до ланцюгової реакції утворення пероксидів ліпідів (ліпід-ООН) і так званих “лізоліпідів” [6,7]. В організмі існують спеціальні лінії захисту від АФК. Першою лінією захисту є супероксиддисмутаза (СОД), яка перетворює супероксид-аніон на пероксид водню. Цей пероксид водню може легко дисмутувати до води і молекулярного кисню під дією ще одного антиоксидантного ферменту – каталази. СОД – перша лінія захисту від АФК, тому вивчення її властивостей має важливе значення.

Метою дипломної роботи було: провести часткову очистку СОД та дослідити деякі властивості даного ферменту.

Перед нами були поставлені такі завдання:

1 – провести часткову очистку СОД за допомогою висолювання сульфатом амонію;

3 - визначити ізоферментний склад СОД в печінці за допомогою електрофорезу;

4 – вивчити вплив температури на активність СОД;

5 – провести інгібування Cu,Zn-СОД диетилдитіокарбоміновою кислотою.

1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

1.1. Антиоксидантна система організму

В живому організмі, в ролі акцептора електронів виступає кисень. При цьому в залежності від типу і умов реакцій в якості проміжних чи побічних продуктів можуть утворюватися активні форми кисню (АФК), до яких належить супероксид-аніон (О2-), пероксид водню (Н2О2) і гідроксил-радикал (НО*) [6-8].

АФК як побічні продукти утворюються при метаболізмі біологічних амінів, пуринів, стероїдів, амінокислот, карнітину, при окисленні невеликих молекул (флавінів) мікросомальними цитохромами Р-450 і b5, мікросомальними флавопротеїнредуктазами, ксантиндегідрогеназами, моноаміноксидазами і при втечі електронів з електронно-транспортного ланцюга. У хребетних тварин швидкість утворення АФК тісно пов'язана з швидкістю споживання кисню І пропорційна кількості мітохондрій в клітинах [14,16,18]. Наведемо схему основних шляхів утворення і взаємних перетворень АФК:

НО*

Fe2+ +з

O2 +з O2- +з, 2Н H2O2

В клітині є спеціальні системи захисту від них - антиоксидантні системи [4,6,8,10]. Ці системи діють в трьох напрямках:

1) попередження утворення АФК;

2) розрив вільнорадикального ланцюга і знешкодження радикалів антиоксидантними ферментами;

3) репарація пошкоджень.

Важливим компонентом захисту від дії АФК, який запобігає вільнорадикальним процесам, є хелатування йонів перехідних металів спеціалізованими і неспеціалізованими білками, наприклад, ферритином, трансферином, альбумінами. Низькомолекулярні антиоксиданти включають глутатіон, б-токоферол (вітамін Е), аскорбінову (вітамін С), сечову кислоту та ін. Вони діють в основному на стадії розриву ланцюга, зупиняючи його поширення [3-6]. Глутатіон гасить гідроксил-радикал і є субстратом для деяких антиоксидантних ферментів.

Ферментами, які приймають участь в захисті від вільних радикалів (антиоксидантні ферменти), є супероксиддисмутаза (СОД), яка метаболізує супероксид-аніон, каталаза і глутатіонпероксидаза, які деградують різні пероксиди. Антиоксидантні властивості мають також білки, які виконують інші головні функції. Це, наприклад, міоглобін і гемоглобін [8]. Важливою є також група ферментів, яка функціонально пов'язана з глутатіоном. Глутатіон-S-трансферази каталізують кон’югацію відновленого глутатіону з нуклеофільними ксенобіотиками або клітинними компонентами, які пошкоджені в результаті дії АФК. Залежна від НАДФН глутатіонредуктаза відновлює окислений глутатіон за рахунок окислення НАДФН. НАДФ+, в свою чергу, відновлюється глюкозо-6-фосфатдегідрогеназою.

Супероксиддисмутаза - фермент, порівняно недавно виявлений в різних тканинах тварин і рослин, виконує важливі біологічні функції у всіх аеробних організмах, забезпечуючи захист від пошкоджуючої дії супероксидних радикалів. Препарати СОД можуть бути використані для вияснення механізмів дії ряду ферментів, які каталізують реакції з участю кисню.

Даний фермент каталізує реакцію