2О2- + 2Н+ Н2О2 + О2 [4,10]

1.2. Коротка історія відкриття СОД

Ксантиноксидаза, яка каталізує окислення ксантину до сечової кислоти, ініціює аеробне окислення сульфіту до сульфату, яке відбувається за вільнорадикальним механізмом. При заміні в такій системі нуклеофільного реагенту (сульфіту) на електрофільний реагент (феррицитохром с) спостерігається відновлення в молекулі останнього Fе3+ до Fе2+. Як виявилось, ці дві реакції, окислювальна і відновна, ідуть тільки при наявності в середовищі супероксидного радикалу, який утворюється при аеробному окисленні ксантину, а потім піддається спонтанній дисмутації [10,18]:

Е + О2 Е+ + О2-

Е+ + ксантин + Н2О Е-сечова кислота

О2- + О2- + 2Н+ Н2О2 + О2

Деякі білкові препарати (карбоангідраза із еритроцитів бика і людини, міоглобін) мали здатність гальмувати окислення сульфіту і відновлення феррицитохрому с, не впливаючи в той же час на окислення ксантину, яке каталізується ксантиноксидазою. Ці дані можна було пояснити, припустивши існування ферменту, який каталізує реакцію дисмутації і який має мати більшу специфічність до О2- , ніж сульфіт і цитохром с.

Після очистки і вивчення фізико-хімічних властивостей нового ферменту (СОД) було знайдено, що він подібний на еритрокупреїн із еритроцитів бика. Близькі за складом металопротеїди виділяли на протязі багатьох років із різних біологічних джерел, але їх каталітична функція не була відома [12].

1.3. Виділення, деякі характеристики і регуляція експресії СОД

На сьогодні в Esherichia coli відомо три типи СОД, для функціонування яких необхідно наявність Сu2+, Zn2+, Мn2+, Fе3+. Марганець-вмісна супероксиддисмутаза (Мn-СОД) кодується геном sod А, який регулюється транскрипційно залежним від йонів металів шляхом. Виявлено як мінімум шість глобальних ефекторів транскрипції гену sod а, серед яких є продукти локусів soxR, sохS і soxQ, генів fur, arcA і fnr, a також білок ІНF [14]. Продукти локусів sохR, sохS і soxQ активують експресію sod а, а інші - пригнічують її. Якщо активність Мn-СОД чутлива до зовнішнього окcидативного стресу, то активність іншої ізоформи СОД, що містить залізо (Fе-СОД), подібна майже у всіх умовах росту культури бактерій. Остання форма синтезується як в аеробних, так і в анаеробних умовах і тому названа конститутивною, на відміну від індуцибельної Мn-СОД, яка відсутня в анаеробних умовах, але швидко синтезується при подачі кисню. Можливе також утворення гібридної форми, яка містить субодиниці Мn-СОД і Fе-СОД, яка, звичайно, міститься в аеробних умовах. Але все ж таки існує можливість змінити рівень обох дисмутаз через модифікацію рівня доступних катіонів, які входять в склад їх активного центру. Так, йони Мn(II) збільшували вміст Мn-СОД, і йони Fе(II) - Fе-СОД. Хелатуючі агенти індукували Мn-СОД і істотно збільшували ступінь індукції ферменту марганцем. Найбільші рівні Мn-СОД досягались спільною обробкою культури йонами марганцю, хелатуючими агентами і паракватом. Всі ці ефекти залежали від наявності кисню [12-15]. Недавно в Esсherichia coli і в ряді інших бактерій знайдено ще одну форму СОД, яка містить мідь і цинк, - Сu,Zn-СОД. Прийнято вважати, що цей фермент локалізований в периплазмі.

Основні етапи очистки СОД, яка містить Сu2+ і Zn2+, подібні до методу виділення еритрокупреїну із еритроцитів бика по Манну і Кейліну. Фермент виділяють із цього ж об'єкту, використовуючи таку послідовність етапів: 1) лізис клітин за допомогою деіонізованої води; 2) осадження гемоглобіну сумішшю хлороформу і етанолу; 3) висолювання із спиртової фази білка додаванням K2HPO4; 4) осадження ферменту ацетоном; 5) йонообмінна хроматографія на ДЕАЕ-целюлозі. В результаті досягається очистка СОД приблизно в 2750 раз (в порівнянні з еритроцитами) при виході ферменту 60%.

На думку деяких вчених, процедури виділення, які включають обробку лізованих клітин сумішшю хлороформу і етанолу і наступні осадження білка ацетоном, можуть змінити фізико-хімічні характеристики білкових молекул, наприклад, впливати на розподіл гідрофобних груп. Щоб запобігти цьому, була запропонована така система виділення СОД: 1) лізис клітин за допомогою сапоніну: 2) адсорбція білка з наступною йонообмінною хроматографією на ДЕАЕ-целюлозі чи КМ-целюлозі; 3) повторна хроматографія на ДЕАЕ-целюлозі, 4) гель-фільтрація на сефадексі G-100; 5) ще одна хроматографія на ДЕАЕ-целюлозі, 6) йонообмінна хроматографія на КМ-целюлозі. Остання стадія може бути замінена ізоелектрофокусуванням. Вихід СОД з еритроцитів людини при такій очистці складає 50%.

1.4. Супероксиддисмутази еукаріотів і прокаріотів

Ферменти, які виділені у еукаріотів, подібні між собою. Для Cu,Zn-СОД величина молярного поглинання при 680 нм добре корелює з вмістом міді і служить часто основою для визначення кількості білка в розчині. Вважають, що на молекулу білка приходиться по два атоми міді та цинку. Деякі дослідники, порівнюючи мідь-вмісні білки, вважають, що серед цих білків можна виділити голубі і неголубі форми, які мають ЕПР-сигнал, а також білки, які містять димагнітну мідь. У відповідності до цієї класифікації СОД еукаріотів відноситься до другого класу. Найбільші відмінності дисмутаз, які виділені з різних джерел, відносяться до УФ-спектру і амінокислотного складу. В основному ясно, що слабке поглинання в УФ-області спектру, незвичайне для більшості білків, обумовлене низьким вмістом тирозину та триптофану. Кілі і його колеги провели порівняння дисмутази еритроцитів людини і бика. Знайдені відмінності дали змогу припустити, що в молекулі супероксиддисмутази бика присутній триптофан [17-20].

Показано, що СОД еукаріотів складається з двох субодиниць. Наявність субодиниць з молекулярною масою 16300 для дисмутази еритроцитів виявляється після обробки білка додецилсульфатом в присутності в - меркаптоетанолу. Ймовірно, що між субодиницями ферменту не ковалентний, а дисульфідний зв'язок.

В даний час відомо, що в клітині