У нас: 141825 рефератів
Щойно додані Реферати
Тор 100
|
|
кишкової палички присутні три типи супероксиддисмутази: Мn-СОД Fе-СОД і Сu,Zn-СОД. Форма, що містила марганець, була першою, яку індифікували в цих бактеріях. СОД прокаріотів, що містить марганець і залізо, не інгібується ціанідом і по стабільності, молекулярній масі і амінокислотному складу значно відрізняється від СОД, яка міститься в еукаріотів [18,20]. Наявність залишків метіоніну і тирозину обумовлює появу УФ-спектру, типового для білків, з максимумом при 280 нм, в той же час, коли СОД еукаріотів не містить цих амінокислотних залишків і має атиповий УФ-спектр, який обумовлений поглинанням фенілаланіну.
Показано, що в послідовності амінокислот СОД E. coli обох типів і мітохондріальної СОД еукаріотів існує значна гомологічність. Для виявлення ЕПР-сигналу нативного ферменту прокаріотів застосовують обробку 0,1 н. НСl при 100°С після денатурації білка був зареєстрований сигнал, типовий для Мn2+. Кілі і співавтори вважають, що марганець в ферменті може бути як дво-, так і трьохвалентним. Якщо метал в ферменті знаходиться в двовалентному стані, відсутність ЕПР-сигналу нативного білка можна пояснити тісним зв'язком Мn2+ і іммобілізацією його в лігандному колі. Але червонуватий відтінок виділених ферментів свідчить, що марганець швидше трьохвалентний. Наявність ЕПР-сигналу після денатурації пояснюється відновленням металу. На відміну від інших марганець-вмісних ферментів, молекулярна маса СОД мітохондрій складає 79400. Детальний аналіз, який був проведений в лабораторії Фрідовича, виявив, що фермент знаходиться в матриксі мітохондрій. Крім того, при обробці додецилсульфатом виявились чотири субодиниці, а не дві, як це було виявлено для всіх вивчених ферментів. Таким чином, СОД мітохондрій еукаріотів відрізняється від цитоплазматичної СОД еукаріотів і має ті ж властивості, що і СОД прокаріотів [18]. Дана подібність дає підставу вважати, що мітохондрії виникли шляхом симбіозу. Найбільш вірогідно, що вирішальним фактором для появи засобу захисту від супероксиду в формі дисмутази послужило накопичення атмосферного кисню. У прокаріотів з'явилася СОД, яка містила марганець і залізо, а у еукаріотів появилася СОД, яка містила мідь і цинк. Таким чином, до сучасних облігантних анаеробів ми можемо віднести ті мікроорганізми, які не виробляли захисту від супероксиду, тобто, які не мають СОД. В ході еволюції прокаріоти сформували досконалу кисень-трансформуючу систему, утворивши вільно живучі мітохондрії. Симбіоз цих форм життя з протоеукаріотами привів, ймовірно, до появи сучасних еукаріотичних клітин, які мали мітохондріальний апарат. В любому випадку структурна подібність мітохондріальної і бактеріальної супероксиддисмутаз прямо свідчить про їх походження із спільного білка-попередника і служить вельми переконливим доказом на користь симбіотичного походження мітохондрій. 1.5. Локалізація СОД в клітині У всіх об'єктах, із яких виділена пов'язана з мітохондріями СОД, яка містить Мn2+, виявлено також присутність в цитозолі іншого типу ферменту, який містить Сu і Zn [18]. Фрідовіч запропонував, що наявність двох типів СОД в клітинах являється характерним для всіх еукаріотів. На його думку, це узгоджується з відомою гіпотезою про походження мітохондрій і еукаріотів із аеробних бактерій. Але останнім часом при дослідженні мітохондрій печінки курей виявлено в міжмембранному середовищі фермент, що містить Сu і Zn. Аналогічна робота була проведена і з мутантними штамами Saccharomyces cerevisiаe, у яких мітохондрії були позбавлені своєї ДНК. Але і у них був знайдений той же рівень СОД, яка містила Мn, що і в нормальних штамах. Ймовірно, що цей вид СОД синтезується в цитозолі, а потім мігрує в мітохондрії. 1.6. Будова активного центру Cu,Zn-СОД Перші роботи відносно ферментативної активності Cu,Zn-СОД свідчили, що в каталітичному механізмі головну роль відіграють йони Сu2+, в той час, як йони Zn2+ прямо не беруть участі в реакції дисмутації. Маккорд і Фрідович шляхом діалізу розчину ферменту проти ЕДТА отримали апофермент, який містив мідь в кількості 10 % від початкового і він володів лише 14 % початкової активності. Апофермент, вільний від обох металів, не виявляв реактивації при інкубації ні з міддю, ні з цинком. Таким чином, ймовірно, що йони Сu2+ в молекулі ферменту беруть участь при каталізі дисмутазної реакції, а Zn2+ має відношення швидше до збереження певної конформації білка, яка необхідна для формування нативної Сu-зв'язуючої ділянки [18]. 2+ 1.7. Взаємодія активного центру СОД з супероксиданіоном Дослідження, які були зроблені в лабораторії Фрідовича, показували, що СОД проявляє виключно високу активність по відношенню до О2-. В дослідах з тетранітрометаном константа швидкості була рівна 5х10 М-1*сек-1. Дана каталітична активність служила основною перешкодою для пояснення механізмів взаємодії між О2- і активним центром ферменту, так як в цих умовах було отримано достатньо високі концентрації субстрату О2-. Можливо, що раніше використовувані реакції, які продукували О2- - такі як, наприклад, взаємодія ксантиноксидази і ксантину, виявились неприйнятними. Труднощі були подолані за допомогою імпульсного опромінення водних розчинів електронами з високою енергією. Даний метод дозволяє отримати високі концентрації О2-, які вимірюються оптично при 250 нм, а також можна одночасно спостерігати за змінами поглинання міді в молекулі Cu,Zn-СОД при 680 нм. Клуг і співавтори показали, що СОД каталізує зникнення О2-, причому даний каталіз був пропорційним до концентрації ферменту в широких межах рН. Вводячи поправку на швидкість спонтанного зникнення радикалів, автори знайшли, що ферментна дія СОД не змінюється при рН від 4,8 до 9,7, але виявляється зменшення при більш низьких рН. Константа швидкості дисмутаційної реакції 2х10 М-1*сек-1. Ротільо і співавтори визначили константу методом імпульсного радіолізу: 1,6х10 М-1*сек-1 [14]. Побудувавши графік подвійних зворотніх величин, автори виявили, що в їх експериментальних умовах фермент не може бути насиченим О2-, |