За допомогою поєднання методів імпульсного радіолізу, спектрофотометрії і ЕПР було показано, що швидкість взаємодії ферменту з О2- близька до межі швидкості дифузійно-контролюючих реакцій. Цей висновок підтверджувався і зниженням швидкості реакції при збільшенні густини середовища. Найбільш цікаві дані про функціонування атомів міді в активному центрі ферменту. Якщо утворення О2- проходило в присутності повністю окисленої форми ферменту, то після імпульсу спостерігалось швидке пониження оптичної густини при 680 нм (А680). Після припинення подачі імпульсів А680 продовжувала знижуватись, але з дуже малою швидкістю. Автори показали, що повільна фаза пов'язана з подальшим відновленням СОД пероксидом водню, так як в присутності каталази проходить реокислення ферменту до першочергового рівня. Поява О2- радикалу після імпульсу при наявності відновленого ферменту супроводжувалась реокисленням останнього з швидкістю, яка близька до швидкості відновлення окисленого фермента. Таким чином, механізм функціонування полягає в послідовному відновленні і окисленні міді в активному центрі СОД:

Е-Сu2+ + О2- Е-Сu++ O2

Е–Сu+ + О2- + 2H+ Е-Сu2++Н2O2

Відновлення Сu-дисмутази пероксидом водню було досліджено М. А. Симоняном і Р. М. Налбандяном, Реєструючи зменшення поглинання ферменту при 680 нм після додавання різних кількостей Н2О2, автори не знайшли змін в формі ЕПР-сигналу, що свідчило про здатність до реакції:

Cu2+ + H2O2 Cu+ + O2- + 2H+

Подальше збільшення концентрації Н2О2 викликало інактивацію ферменту, що автори пояснили це зміною оточення міді в білку. Пізніше Брей і співавтори підтвердили дані Симоняна і Налбандяна про те, що пероксид водню інактивує фермент, і запропонували слідуюючу схему реакції СОД:

E-Cu2+ + H2O2 E-Cu2+ + O2- + 2H+

E-Cu2+ + O2- E-Cu+ + O2

Оскільки реокислення СОД при імпульсному радіолізі проводилось на ферменті, який був відновлений Н2О2, автори досліджували і умови інактивації. Було виявлено, що даний процес протікає достатньо швидко при 11-кратній нестачі Н2О2 із зміною ЕПР-спектру інактивованого ферменту. Паралельний з вимірюванням ЕПР-сигналу аналіз складу амінокислот інактивованого ферменту виявив, що найбільші зміни заключаються в зменшенні залишків і гістидину. На цій основі автори заключили про зв'язування гістидиновими залишками Сu2+ з утворенням активного центру ферменту.

Цікавий і інший важливий аспект, який виник із вивчення ЕПР-спектрів і видимих спектрів ферменту. Виявилось, що зміни спектру ферменту у видимій області при взаємодії з О2- дуже малі для ствердження про участь всіх атомів міді в каталітичному процесі. За основу для такого висновку автори прийняли, що І00%-не поглинання при 680 нм обумовлене Сu2+, а поглинання Сu+ при 680 нм дорівнює 0. Зробивши поправку на можливі забруднення в препаратах дисмутази, автори розрахували, що теоретично зменшення А680 при відновленні О2- вихідного ферменту повинно відповідати перетворенню 40% кількості Сu2+ в Сu+. Але, дані, які отримані як спектрофотометрично, так і шляхом ЕПР-аналізу ферменту в стаціонарній фазі реакції, свідчили, що реакція з О2- торкається лише 20% загального вмісту міді. Наявність "ями" (за термінологією авторів) показує, що тільки 50% міді, яка здатна відновлюватись, реагує з О2-, так як відновлення ферменту Н2О2 супроводжується майже повним зникненням ЕПР-сигналу. Цю очевидну невідповідність автори запропонували подолати за допомогою наступного пояснення механізму реакції, беручи до уваги дані про існування субодиниць в молекулі СОД. В результаті реакції О2- з Сu2+ двовалентна мідь переходить в одновалентну тільки в одній субодиниці, тим самим тимчасово перетворюючи іншу субодиницю в нереагуючу з О2-. Звільнення прореагованої субодиниці від субстрату дозволяє взаємодію іншої субодиниці з О2-, що, в свою чергу, ніби замикає попередню субодиницю з Сu+ [21-23]. В наступному циклі прореагована з Сu+ субодиниця ферменту вивільняється від продукту реакції. Таким чином, в обох субодиницях мідь робиться одновалентною. Реакція ферменту з О2- проходить в зворотному напрямі. Оцінюючи запропоновану схему, автори відмітили, що реальність її існування обумовлена певними причинами. По-перше, ряд досліджень показали, що в кожній субодиниці ферменту активні центри ідентичні. По-друге, важко припустити, що два атоми міді присутні в одному активному центрі, так як така будова легко розпізнається за допомогою ЕПР. Крім того, нереально розглядати ситуацію, при якій половина активного центру належить одній субодиниці, половина іншій. Але Філден і співавтори допускають, що наявність "ями", яка визначається спектрофотометрично і за допомогою ЕПР, можливо в тому випадку, коли реакція міді з О2- в одній субодиниці супроводжується переносом відновлених еквівалентів на атом міді іншої субодиниці, яка містить Cu2+ і реагує із іншою молекулою О2-.

1.8. Методи визначення активності СОД

Для визначення активності СОД можна користуватись як прямими, так і непрямими методами дослідження. Але субстрат каталізуючої СОД реакції (О2-) є нестабільним, тому найчастіше для визначення активності СОД використовують непрямі методи визначення активності супероксиддисмутази. До непрямих методів відносяться:

ксантиноксидазна реакція (ксантиноксидаза окислює ксантин до сечової кислоти і при цьому утворюється О2-. Про кількість супероксидного радикалу, який утворюється при цьому, дізнаються з таких реакцій: відновлення заліза в окисленому цитохромі с, окислення адреналіну до адренохрому і утворення голубого формазану із тетразолію);

- реакція фоточутливого окислення (більшість барвників, в тому числі і похідні ізоаллоксазину, легко відновлюються при освітленні їх світлом видимої частини спектру в присутності донорів електронів. Фотовідновлені похідні реагують потім з киснем, даючи при цьому супероксидні радикали, яких виявляють по властивості відновлювати тетразолій до формазану. СОД, понижуючи рівень О2-, гальмує утворення формазану. Так як формазани нерозчинні, систему застосовують для визначення активності СОД після електрофорезу в поліакриламідному гелі; смуги, які містять всього 0,016