У нас: 141825 рефератів
Щойно додані Реферати Тор 100
Скористайтеся пошуком, наприклад Реферат        Грубий пошук Точний пошук
Вхід в абонемент


мкг СОД, на голубому фоні безбарвні);

- реакція окислення кверцетину (даний метод базується на інгібуванні СОД реакції окислення кверцетину. Швидкість реакції окислення реєстрували на ФЕКу при довжині хвилі 400 нм.) [8].

2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

2.1. Матеріали і реактиви

Свіжу печінку заморожували при температурі -18°С. Цю печінку використовували протягом трьох місяців досліджень.

Для проведення дослідів використовувались наступні реактиви: акриламід (Reanal, Угорщина), ТЕМЕД (Reanal, Угорщина), рибофлавін (Reanal, Угорщина), N,N,N',N'-метиленбісакриламід (Reanal, Угорщина), гліцин (Reanal, Угорщина), ЕДТА (Sigma, США), ДДК (Sigma, США), нітразольтетрасиній (Sigma, США), сульфат амонію (Sigma, США), хлорид натрію (Sigma, США), КФБ (Реахім, СРСР), Тріс-буфер (Реахім, СРСР). Всі інші речовини кваліфікації не нижче „чда”.

В процесі проведення дослідів використовувались наступні прилади:

- гомогенізатор Поттера;

- центрифуга охолоджуюча К-24D (Німеччина);

- термобаня ТВ-110 (Німеччина);

- спектрофотометр СФ-46 (Німеччина);

- фотоелектрокалориметр КФК-2МП (СРСР);

- спектрофотометр Specol-221 (Німеччина);

- прилад для електрофорезу ПЕФ-3 (СРСР);

- рН-метр рН150;

- вага торсійна WTW (Польща);

- вага електронна Sartorius-1212MP (Німеччина).

2.2. Гомогенізація і отримання супернатанту

Розморожену тканину промивали в охолодженому фізіологічному розчині і просушували на фільтрувальному папері. Потім зважували потрібну кількість тканини. Гомогенізували в скляному гомогенізаторі Поттера. Середовище гомогенізації містило (вказано кінцеві концентрації): 50 мМ КФБ (рН 7,0), 0,5 мМ ЕДТА і кілька кришталиків ФMСФ (ця сполука – інгібітор протеаз). Центрифугували при 15000 обертів протягом 15 хв при +4°С. Для визначення активності СОД використовували супернатант.

2.3. Висолювання сульфатом амонію

Суть методу висолювання полягає в тому, що додаючи різну кількість сульфату амонію, можна осадити білки з різними молекулярними масами. При розчиненні певної порції солі розчин перемішують ще 1 год за допомогою магнітної мішалки при t=5C, а потім центрифугують при 15000 g протягом 15 хв. В залежності від того, які білки необхідно виділити, для подальшої роботи використовують осад чи супернатант. Осад перерозчинюють в невеликому об’ємі води чи буферному розчині і звільняють від надлишку сульфату амонію шляхом діалізу. Супернатант або також обезсолюють, або додають до нього нову порцію солі для досягнення більш високого ступеня насичення; в останньому випадку процедуру висолювання повторюють. В табл.1 подані кількості сульфату амонію, які необхідно додати, щоб перейти до більш високого ступеня насичення.

Табл.1. Кількості сульфату амонію (в грамах), які треба додати до 1 л розчину даного ступеня насичення, щоб отримати більш високий ступінь насичення. |

Кінцева ступінь насичення

Вихідна ступінь насичення |

0,1 | 0,2 | 0,3 | 0,4 | 0,5 | 0,6 | 0,7 | 0,8 | 0,9 | 1,0

0,0 | 76,0 | 152,0 | 228,0 | 304,0 | 380,0 | 456,0 | 532,0 | 608,0 | 684,0 | 760,0

0,1 | - | 73,5 | 146,9 | 220,4 | 293,8 | 367,3 | 440,8 | 514,2 | 587,7 | 661,1

0,2 | - | - | 70,4 | 140,7 | 211,1 | 281,5 | 351,9 | 422,2 | 492,6 | 563,0

0,3 | - | - | - | 67,9 | 135,7 | 203,6 | 271,4 | 339,3 | 407,1 | 475,0

0,4 | - | - | - | - | 65,5 | 131,0 | 196,5 | 262,0 | 327,5 | 393,0

0,5 | - | - | - | - | - | 63,3 | 126,7 | 189,0 | 253,3 | 316,7

0,6 | - | - | - | - | - | - | 61,3 | 122,6 | 183,9 | 245,2

0,7 | - | - | - | - | - | - | - | 59,4 | 118,7 | 178,1

0,8 | - | - | - | - | - | - | - | - | 57,6 | 115,2

0,9 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 55,9

2.4. Діаліз препаратів

Процес розділення високомолекулярних і низькомолекулярних частинок за допомогою напівпроникних мембран називається діалізом. Метод діалізу заснований на нездатності колоїдних частинок проходити через напівпроникні бар’єри: штучні мембрани, колодій, целофан, пергамент та ін. Частинки білка мають великий діаметр і тому не проникають крізь мембрани. Діаліз широко використовують для очищення білків від низькомолекулярних домішок (органічних і неорганічних); останні легко проходять через пори напівпроникних мембран. Розчин білка поміщають у целофановий мішечок. При цьому молекули низькомолекулярних речовин дифундують через мембрану, а колоїдний розчин білка залишається в мішечку.

Середовище для діалізу містило такі ж компоненти, що і середовище для гомогенізації, тобто 50 мМ КФБ (рН 7,0), 0,5 мМ ЕДТА (за виключенням ФМСФ).

Наші проби під час діалізу знаходились у целофанових мішечках з міцно перев’язаними краями, які попередньо були розмочені у дистильованій воді. Діаліз проводили за допомогою магнітної мішалки. Отримані препарати зберігали в холодильнику і використовували протягом двох днів.

 

2.5. Визначення активності СОД

Для визначення активності даного ферменту ми використовували спосіб, який базується на інгібуванні СОД реакції окислення кверцетину [24]. Суміш для визначення активності СОД містила (вказано кінцеві концентрації): 30 мМ Tріс-НСl-буфер (рН 10,0), 0,5 мМ ЕДТА, 0,8 мМ ТЕМЕД. В цій суміші ТЕМЕД генерує супероксид-аніон. При додаванні в цю суміш кверцетину (0,05 мМ) останній окислюється, а швидкість реакції окислення реєстрували на ФЕКу при довжині хвилі 400 нм.

В суміші даних речовин доводили рН до 10,0. В кювету додавали 2 мл проби, що містила 1,76 мл вище вказаної суміші, 200 мкл – [води + препарату] і 40 мкл кверцетину. Реакцію починали внесенням кверцетину. За контроль було


Сторінки: 1 2 3 4 5 6 7 8