Одна одиниця активності СОД відповідає кількості ферменту, який наполовину інгібує реакцію окислення кверцетину (тобто активність в 1 одиницю має СОД, що міститься в К50 мл препарату тканини).

Специфічна активність показує, скільки одиниць активності знаходиться в 1 мг білка, і розраховується за формулою:

А = 1 / (К50 [білок]),

де А – активність, Од/мг білка; К50 – константа половинного інгібування, виражена в мілілітрах, [білок] – концентрація білка в пробі, мг/мл.

2.6. Визначення концентрації білка

Концентрацію білка в пробі визначали за допомогою методу Бредфорда [11]. Даний метод ґрунтується на здатності білка зв’язуватись з барвником кумасі яскраво-голубим G-250 і утворювати забарвлені сполуки. Концентрацію білка в досліджуваних пробах розраховували за формулою:

,

де – концентрація білка, мг/мл;

– оптична густина;

– оптична густина стандартної проби, що містить “С” мкг білка;

– об’єм препарату, мкл.

Поглинання дослідних проб і проб для калібрувального графіка визначали на спектрофотометрі Spekol 221 (Німеччина) при довжині хвилі 590 нм.

2.7. Електрофорeз в поліакриламідному гелі

Електрофорез дозволяє розділити білкову суміш не тільки по заряду, а також і по розмірам і формам частинок. Ми проводили електрофоретичне розділення білків в тонкому шарі поліакриламідного гелю тому, що використання тонких пластин полегшує ефективне відведення тепла при електрофорезі. Процес фіксації, фарбування і відмивання займає значно менше часу в порівнянні з електрофорезом в трубочках. Використання однієї пластини дозволяє в абсолютно ідентичних умовах проводити розділення зразу декількох (10-13) проб білка.

В роботі ми використали два типи гелю – концентруючий і розділяючий. Спочатку в касету на висоту 85 мм від дна заливали розчин для полімеризації розділяючого гелю (7%), який містив: 2,5 мл буферу для гелю (рН 8,9), 2,5 мл акриламіду, 20 мг персульфату амонію та 20 мкл концентрованого ТЕМЕДу. На нього наносили воду і касету залишали в вертикальному стані до полімеризації гелю. Воду видаляли, на поверхню цього гелю наносили суміш для полімеризації концентруючого гелю до повного заповнення касети і вставляли шаблон-гребінку. Склад концентруючого гелю (6%): 1,75 мл буферу для гелю (рН 8,9), 1,75 мл акриламіду, 5 мг персульфату амонію та 10 мкл концентрованого ТЕМЕДу.

Електрофорез проводили при 160 В і 36 мА.

Відомий гель витримували 20 хв в 2,45Ч10-3 М розчині нітротетразолію синього для утворення О2- з О2.. Потім рідину зливали. Інгібували 15 хв в суміші, що містила такі компоненти (вказано кінцеві концентрації): 28 мкМ ТЕМЕДу, 0,028 мМ рибофлавіну, 36 мМ КФБ (рН 7,8). Гель поміщали в сухі чашки Петрі і залишали на світлі на 5-10 хв. За цей час гелі зафарбовуються в синій колір, крім зон, які мають СОД-активність (незабарвлені).

2.8. Визначення термостабільності СОД

Пробу нагрівали на водяній бані при t=45°C. Через рівні проміжки часу відбирали супернатант для визначення активності СОД, приймаючи контроль (без нагрівання) за 100%. Нагрівання СОД проводили протягом 3 год.

2.9. Інгібування СОД диетилдитіокарбаміновою кислотою

Диетилдитіокарбамінова кислота (ДДК) є інгібітором Cu,Zn-CОД. Ця речовина видаляє мідь з активного центру Cu,Zn-СОД, в результаті чого даний фермент втрачає активність. Досліджено зміну загальної активності СОД при інкубації з ДДК різних концентрацій протягом різних проміжків часу.

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

3.1. Очистка і активність СОД з печінки свині

За допомогою вище описаного методу висолювання було проведено ряд дослідів по частковій очистці СОД. Спочатку висолювання проводили через кожні 10% насичення. Було отримано найбільшу активність СОД в фракції 90-100% в порівнянні з контролем. Дану фракцію було поділено ще на три фракції: 90-95%, 95-100%, >100%. Найбільшу активність СОД в порівнянні з контролем було отримано у фракції 95-100% (табл. 2), що в середньому становила 475 Од/мг білка. Дана активність СОД в цій фракції перевищує її активність в контролі приблизно в 3 рази.

Табл. 2. Характеристика СОД з печінки свині.

№ досліду | Фракція, % | Конц. білка, мг/мл | Заг. білок, мг | Активність, од/мг білка

1 |

вихідний супернатант

0-20

20-30

30-40

40-50

50-60

60-70

70-80

80-90

90-100 |

26,8

25,9

17,3

16,2

11,1

11,0

7,8

1,52

1,43

1,24 |

222

218

215

179

156

142

112

28,6

27,4

22,3 |

258

74,8

30,8

36,0

30,1

129

292

418

516

1240

2 | вихідний супернатант

50-80

80-85

85-90

90-95

95-100 |

14,2

21,3

5,69

3,73

1,19

1,08 |

398

510

96,7

61,5

19,6

14,0 |

200

269

91,8

62,5

284

611

3 | вихідний супернатант

40-90

90-95

95-100

>100 |

18,3

28,6

16,9

4,09

0,62 |

458

572

228

49,1

7,44 |

252

218

348

696

347

4 | вихідний супернатант

90-95

95-100

>100 |

4,93

0,45

0,42

0,2 |

49,3

3,6

3,36

1,14 |

101

256

516

122

5 | вихідний супернатант

95-100 |

20,9

0,39 |

209

3,9 |

97,6

233

6 | вихідний супернатант

95-100 |

15,2

1,65 |

50,6

7,9 |

120

329

На мал.1 представлена типова крива інгібування швидкості окислення кверцетину СОД з печінки свині. З цього графіка видно, що для повного інгібування реакції окислення кверцетину потрібно додати тільки 5-10 мкл супернатанту з печінки свині. К50 в даному випадку дорівнювало 1,68 мкл супернатанту, а активність 611 Од/мг білка.

Мал. 1. Графік типового інгібування швидкості окислення кверцетину СОД з печінки свині (фракція 95-100%).

3.2. Електрофорез

Наступним етапом роботи було дослідити СОД на наявність ізоформ ферменту з печінки свині. Використовували метод електрофорезу в поліакриламідному гелі на пластинці. Було зроблено шість повторів. У всіх цих повторах отримали одну смугу СОД-активності, що може свідчити про те, що тут наявна одна ізоформа СОД або дуже близько розташовані смуги. На мал.2 показано форез