А Б

Мал.2. Фарбування гелів на СОД-активність: А – в контролі; Б – в фракції 95-100%.

Інтенсивність забарвлення смуг СОД-активності була вища у фракції 95-100% при тому, що на обидві доріжки наносили однакову кількість препарату. RfCОД = 0,22.

3.3. Вплив температури на активність СОД

Препарат фракції 95-100% нагрівали протягом 3 год при t=45°C. Для розрахунків специфічної активності СОД в кожній часовій точці разом з визначенням активності ферменту визначали концентрацію білка, оскільки при нагріванні відбувається його денатурація, і концентрація його зменшується в порівнянні з вихідним препаратом.

На мал.3 показано сумарну криву зміни активності СОД при нагріванні протягом 3 год. З цього графіка видно, що протягом перших 10 хв нагрівання активність ферменту падає на 20%, але, починаючи з 25 хв нагрівання активність даного ферменту починає відновлюватись і далі зростати. Максимальне збільшення активності СОД (приблизно на 50%) спостерігали через 60-90 хв. нагрівання, але при нагріванні проби протягом 3 год активність СОД становила 79% в порівнянні з контрольною.

Мал.3. Вплив нагрівання (45С) на активність СОД з печінки свині (n=2).

3.4. Інгібування Cu,Zn-СОД диетилдитіокарбаміновою кислотою

Досліди проводились на замороженій печінці карася сріблястого. Спочатку був поставлений дослід на інгібування Cu,Zn-СОД різними концентраціями ДДК. Тривалість преінкубації становила 1 год. Використовували такі кінцеві концентрації ДДК в пробі: 1 мкМ, 10 мкМ та 100 мкМ. Отримали криву нелінійного інгібування ферменту вказаними концентраціями ДДК (мал.4). За контроль брали пробу без додавання ДДК. З мал.4 видно, що при додаванні 100 мкМ ДДК активність сумарної СОД зменшується приблизно на половину.

Мал. 4. Залежність активності СОД з печінки сріблястого карася від інкубації ДДК різних концентрацій (n=2). Тривалість преінкубації становить 1 год.

В наступному досліді ми вивчали вплив різного часу інкубації ДДК на активність СОД. Для досліду використовували 100 мкМ ДДК. Інкубували пробу з ДДК на протязі двох годин при +5°С. На мал.5 подана крива даного інгібування СОД. Інгібування напротязі 1 год практично не впливало на активність ферменту, але через 2 год. інкубації вона знизилась на 40%.

Мал.5. Залежність активності СОД від часу інкубації з ДДК концентрацією 100 мкМ. Представлені дані одиничного повтору.

3.5. Обговорення отриманих результатів

В результаті досліджень було здійснено напівочистку СОД. Найбільшу її активність було отримано у фракції 95-100%, де вона в середньому склала 475 Од/мг білка. Брюс Фрімен та колеги [7] знайшли найбільшу активність Мn-СОД (3200 Од/мг білка) з Е. coli у фракції 65-80%, а Р. Йозтюрк-Юрек і Л. Таран [15] найбільшу активність Сu,Zn-СОД з печінки курей (470 Од/мл) отримали у фракції 45-50%.

За допомогою електрофорезу отримали одну смугу СОД-активності. Можна припустити, що саме в цій фракції знаходиться одна ізоформа СОД, хоча може бути й те, що дві ізоформи СОД дуже близько розташовані одна відносно іншої і можуть зливатись.

СОД є досить термостабільною. Цікавим є те, що при нагріванні препарату при t°=45°C протягом 1 год. збільшувалась її активність на 50% (мал.3) при тому, що відбувалась денатурація білка. Р. Йозтюрк-Юрек і Л. Таран вивчали вплив різної температури (45-75°С) на активність Cu,Zn-СОД з печінки курей. Препарати піддавались нагріванню протягом 1 год. При t°=75°C активність ферменту становила 66% від її активності при t°=45°С [15].

Активність СОД з печінки карася сріблястого залежала від інкубування з ДДК різних концентрацій (мал.4). Так, при інкубуванні препарату з ДДК концентрацією 1 мкМ активність ферменту становила 75% від вихідної (без інкубування з ДДК); при інкубуванні з 10 мкМ ДДК – 62%; з 100 мкМ – 58%. Подібні дані були отримані А. Тераною та колегами, де для досліджень було взято бичачі ендотеліальні клітини (з 1мкМ ДДК – 75%, з 10мкМ – 50%, з 100мкМ – 42%) [12]. При інкубуванні препарату з 100 мкМ ДДК протягом 2 год. активність СОД становила 60% від вихідної (без преінкубації з ДДК).

ВИСНОВКИ

Фракція 95-100? містить основну частину активності СОД.

Фермент в даній фракції має одну ізоформу, про що свідчить електрофорез.

СОД з печінки свині – фермент термостабільний. При нагріванні препарату при t°=45°C протягом 1 год. активність даного ферменту зростає на 50%.

Крива інгібування СОД з печінки карася сріблястого диетилдитіокарбоміновою кислотою в часі показує, що сумарна активність даного ферменту зменшується, що є доказом інгібування Сu,Zn-COД. Крива інгібування ферменту за допомогою ДДК з концентрацією 100 мкМ виходить на плато, тобто при такій концентрації ДДС Сu,Zn-COД інгібується повністю.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Гродзинський Д.М. Радіобіологія: Підручник. – К.: Либідь, - 2000. - С. 448.

2. Якименко І.Л., Сидорук С.П. Регуляторна дія низькоінтинсивного лазерного опромінювання на стан антиоксидантної системи організму. // Український біохімічний журнал. - 2001. - Т.73, №1. - С. 16-24.

3. Гольдштейн Н. Активные формы кислорода как жизненно необходимые компоненты воздушной среды // Биохимия. - 2002. - Т.67, №2. - С. 592-609.

4. Фридович И. Свободные радикалы в биологии. –М.: Мир, - 1979. - С. 372.

5. Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий.// Биохимия. - 2001. - Т.66, №5. – С. 592-609.

6. Калуев А.В. Выполняют ли регуляторную роль в клетке взаимодействия АФК с ДНК? // Український біохімічний журнал. - 1999. - Т.71, №2. - С. 104-108.

7. Турпаев К.Т. Активные формы кислорода и регуляция експресии генов // Биохимия. - 2002. - Т.67, №3.