Методи клітинної біології

1. Мікроскопія.

2. Радіоізотопний та неізотопні методи мічення.

3. Визначення фізіологічного стану клітини.

4. Клітинна інженерія.

1

Мікроскопія – сукупність методів спостереження мікрооб’єктів за допомо-гою різних мікроскопів.

Зараз дуже широко використовуються такі види мікроскопів як фазово-кон-трастний, флуоресцентний, а зокрема конфокальний сканувальний мікроскоп, електронний трансмісійний та сканувальний мікроскопи, а останнім часом атомний силовий мікроскоп.

Все, що зараз відомо про клітину та її органели, було встановлено за допо-могою електронної та світлової мікроскопії (включаючи темнопольну, фазово-контрастну та флуоресцентну). Так, зокрема, була встановлена наявність плаз-малеми, тонка будова хлоропластів та мітохондрій, центріолей, апарату Голь-джі тощо. Фактично розвиток клітинної біології, як і багатьох інших біологіч-них дисциплін визначається появою нових методів дослідження. Так, з появою світлового мікроскопу були відкриті самі клітини, трансмісійний електронний мікроскоп дозволив встановити мікроструктуру органел. Зараз локалізація ком-понентів клітини (зокрема білків, іонів неорганічних сполук) визначається за допомогою флуоресцентного мікроскопу, з’єднаного з комп’ютером і цифро-вою камерою. З’єднання з комп’ютером дозволяє працювати з окремими еле-ментами зображення за допомогою спеціальних програм. Як флуоресцентну мітку використовують різні барвники – флуоресцеїн, родамін, DAPI тощо. Ши-роко використовується так званий зелений флуоресцентний білок (GFP), який виділяють з медузи Aequorea victoria. Як правило, в клітину вводять генний конструкт (плазміду), в якій ген, відповідальний за кодування досліджуваного білка, злитий із геном, який кодує GFP. Конструкт інтегрується в хромосому. Досліджуваний білок коекспресується із GFP, являючи собою хімерний міче-ний білок. Флуоресценція, зумовлена GFP, дозволяє слідкувати за переміщен-ням та локалізацією досліджуваного білка. Найбільш розповсюдженими бар-вниками є дихлорофлуоресцеїн диацетат (DCFDA), який взаємодіє з перокси-дом водню; ізотіоціанат флуоресцеїну, родамін, сафранін О, Хьохст (Hoechst) та DAPI (4, 6-діамідіно-2-феніліндол), акридиновий оранжевий, броміди та йодиди етидію та пропідію. Для візуалізації F-актинового цитоскелету використовуєть-ся фалоїдин, зв’язаний з флуоресцентною міткою. За допомогою міто- та ER-трекерів вточнено форму ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій. Зо-крема встановлено, що мітохондрії не є поодинокими двомембранними вези-кулами, розкиданими по клітині, а утворюють мережу, яка, подібно до ендо-плазматичної сітки, складається з довгих каналів та “цистерн”, що перебувають у постійному русі. Мітохондріальні канальці можуть розриватися і зливатися між собою в точках дотику, причому цей процес не спонтанний, проте контро-люється спеціальними білками – мітофузинами.

Одним з досягнень сучасної світлової мікроскопії є оптика Номарського, або диференційно-інтерференційний контраст. Останній досягається за допомо-гою використання растрів. Оптику Номарського часто використовують для мі-кроманіпуляцій з клітинами.

Електронний мікроскоп – прилад, в якому для отримання збільшеного зо-браження використовується струмінь електронів. Електронних мікроскопів іс-нує два основних типи: трансмісійний та сканувальний. Трансмісійний мікро-скоп пропускає пучок електронів через препарат (ультратонкий зріз), форму-ючи зображення на екрані за ним. В сканувальному мікроскопі пучок електро-нів проходить над препаратом точка за точкою, зумовлюючи емісію вторинного пучка, що утворює зображення на флуоресцентному екрані катодної промене-вої трубки; відмінності глибини поверхні можуть утворювати тривимірне зо-браження.

Всередині 80-х рр. 20-го століття був розвинений метод атомної силової мі-кроскопії. Апогей припадає на кінець 90-х рр., коли Бану Йєна та співробіт-никами була встановлена наявність та структура поросом у плазмалемі, за до-помогою яких здійснюється секреція гранул зимогену в клітинах підшлункової залози. Одним з основних елементів атомного силового мікроскопу є над-звичайно тонка голка, яка притягається атомами поверхні об’єкта. Рух голки, зумовлений нерівностями поверхні, трансформується в електричні сигнали, а останні – за допомогою комп’ютера – у зображення.

Існує безліч інших різновидів мікроскопії, зокрема світлової. Відмінності торкаються будови оптичної системи і спрямовані на досягненні максимальної чіткості зображення. Проте контрастність не є самостійною метою. Вибір мі-кроскопу визначається типом структур, які бажає розглядати дослідник. Інколи буває достатньо простої імерсійної мікроскопії, деколи буває доречнішою темнопольна мікроскопія. Дуже часто всі ці можливості можна реалізувати на одній платформі, використовуючи різні насадки та види освітлення.

2

Авторадіографія – метод реєстрації розподілу радіоактивних речовин в об’єкті. Плівка з чутливою до радіоактивного випромінювання емульсією на-кладається на зріз. Радіоактивні речовини ніби самі себе фотографують. Місця потемніння на плівці після проявлення відповідають локалізації радіоактивних частинок.

3

Сучасні дослідження в галузі клітинної біології орієнтовані на спостере-женнях та експериментах, які дозволяють встановити роль органел і окремих молекулярних комплексів у фізіологічних процесах. Клітина, таким чином, роз-глядається в динаміці. Особлива увага приділяється процесам некрозу, апопто-зу (програмованої загибелі клітини), диференціації, переродження. Досліджу-ються зміни в клітині та органелах за дії різних чинників.

Для індикації некрозу та апоптозу зараз широко використовується протічна цитофлуориметрія. При цьому клітини фарбуються прижиттєвим флуорохро-мом, здатним зв’язуватись з ДНК, наприклад Хьохстом або DAPI. Потім сус-пензія фарбованих клітин пропускається через ультравузький канал, у якому клітини слідують одна за одною. В певному місці каналу знаходиться детектор, який вловлює флуоресценцію клітини. Тут варто відзначити, що залежно від фази клітинного циклу клітини містять різну кількість ДНК. Інтенсивність флу-оресценції буде залежати як від кількості ДНК, так і від її стану (фрагментована / дефрагментована). Цитометр виводить дані на екран комп’ютера, позначаючи кожну клітину у вигляді крапки. Причому ці крапки виводяться на площину ко-ординат. По вісі ординат відкладається кількість клітин, а по вісі абсцис – ін-тенсивність флуоресценції кожної клітини. Тому загальний підрахунок має ви-гляд фігури з піками. Розміщення піків (паттерн) залежить від фази клітинного циклу та стану ДНК. Втім, фарбувати можна будь-яку структуру клітини: по-трібно лиш знати, як виглядає пік для “норми” і значення його зміщення.

Для ідентифікації апоптозу / некрозу часто використовується імуногістохі-мічний аналіз з наступною мікроскопією, флуоресцентна мікроскопія, імуно-ферментний аналіз тощо. Флуоресцентну мікроскопію застосовують