Розділ I. Методи досліджень .

1.1.Методичні матеріали та об’єкти , необхідні для роботи .

1.1.1Лікарська рослинна сировина і методи її екстрагування.

Досліджувалась досить велика кількість екстрактів із лікарських рослин, зібраних на території Івано-Франківської, Львівської та Закарпатської областей. Із рослин та різних їх частин (листків, стебел, квіток, коренів, кори) готувались витяжки різними розчинниками: спиртом ( 40%, 70%, 90%), ацетоном. У ряді випадків витяжки випаровувались до визначеної густини; в інших випадках рослини оброблялися звичайним для виділення алкалоїдів способом. Діюча речовина осаджувалась, відділялась від рідини, висушувалась, і в подальшому з неї готувались розведення, необхідні для досліджень.

1.1.2.Поживні середовища, обладнання.

Для визначення чутливості бактерій до антибіотиків використовують такі середовища:

№1. 1000 мл бульйону Хоттингера , з вмістом 120-140 мг амінного азоту ,15 г агару , 3 г натрію фосфату двозмінного ;

№2. 1000 мл м?ясопептонного бульйону (1:2), 15 г агару ,3 г натрію фосфату двозмінного ;

№3. АГВ (сухий порошок розводимо відповідно до вказівки на етикетці).

Для проведення скринінгових досліджень заготовляють поживні середовища за певним принципом . У стерильну чашку Петрі рівномірно заливають щільне поживне середовище об’ємом 30 мл. Потім вирізають у ньому лунки однакової місткості . Засівають на чашку суспензію однієї культури , а потім в лунки вносять почергово екстракти рослин.

Для посіву досліджуваних культур на щільне поживне середовище з антибіотиками використовують штампи-реплікатори на 25 чи 50 культур.

Об’єм бактеріальної суспензії чи іншої рідини, залишеної штифтом штампа-реплікатора на відбитку поживного середовища становить 0.001-0.002 мл.

Штамп-реплікатор забезпечує стандартність результатів, зменшує число помилок і скорочує затрати часу на посів, і затрату поживних середовищ у порівнянні з іншими способами посіву.

Для посіву, позначення культур і обліку результатів застосовують трафарет на 25 чи 50 зон. Це клаптик паперу формою і величиною, рівно дну чашки Петрі. Так відбивають змочені тушшю штифти репліка тора. Місця нумерують від 1 до 25 чи 50 . Замість штампа-реплікатора можна використовувати пастерівську піпетку.

Для виконання методики необхідний термостат на 37 гр.С, побутовий холодильник +3 --5 гр.С, штативи, що не псуються при стерилізації, бактеріологічні чашки діаметром 9,5 см , бактеріологічні пробірки, преципітаційні пробірки, пастерівські і мірні піпетки, аналітичні терези, анатомічні пінцети, водяна баня, 0,5%-ний розчин NaCl, 10%-ний розчин желатину, дистильована вода.

1.1.3.Приготування поживних середовищ з антибіотиками.

При визначенні показника клінічної стійкості бактерії 1мл поживного середовища повинен містити концентрацію, рівну ј робочої (рекомендованої для застосування на практиці) концентрації антибіотика. Більш низька в порівнянні з робочими концентрація антибіотика в поживному середовищі вибрана на основі спеціальних досліджень, які показали, що після внесення антибіотика в біотоп проходить швидке зниження його концентрації.

Для приготування середовищ з антибіотиками в залежності від об’єму роботи заготовляють певну мірну кількість поживного середовища (15, 30, 45, 60, 90 мл) у пробірках чи мірних колбах.

Для антибіотиків, випущених промисловістю у сухому вигляді (порошок), в середовище вносять наважки препаратів, для рідких форм - певні визначені об”єми насичених чи розведених розчинів. Якщо необхідно вихідні розчини розбавити, то використовують стерильну дистильовану воду.

Розплавлене поживне середовище після внесення антибіотика ретельно перемішують і розливають в 1-2 або більше чашок.

На дні стерильних чашок, приготованих для розливу агару, відмічають „верх” (нанесення прямої лінії на відстані 1см від краю), вказують назву і концентрацію антибіотика, номер партії. Готові чашки з антибіотиками можна зберігати в холодильнику тиждень. Перед посівом чашки обов”язково підсушують у термостаті протягом 30-40 хв.

При визначенні МІК (мінімальна інгібуюча концентрація) використовують метод серійних розведень препаратів у щільному поживному середовищі. Для цього готують серію поживних середовищ з різними концентраціями антибіотиків. Інтервал між концентраціями може бути подвійним. В залежності від активності антибіотика, вибирають ряд концентрацій - від мінімальної, на якій ростуть всі штами певного виду, до максимальної, яка подавлює ріст всіх штамів даного виду.

1.1.4.Відбір і підготовка культур для дослідження

При дослідженнях в цілях вибору препаратів використовують штами від хворих з нагноєнням ран слизових оболонок, шкіри, підшкірної клітковини.

Для дослідження беруть чисті культури бактерій. При закритих процесах із одного патологічного матеріалу досліджують 2-3 культури кожного виду, що має етіологічне значення; із відкритих (зв”язаних з порожнинами або зовнішнім середовищем) патологічних процесів, в яких популяція бактерій більш гетерогенна, вибірка повинна бути більшою - 5-10 культур.

Якщо досліджується одна культура, помилка у визначенні чутливості може досягти 50%. При великій затраті антибіотика і поживного середовища помилка не збільшується, оскільки одного виду і виділені з одного матеріалу, можна змішувати і випробовувати в одній пробі (на одній чашці з поживним середовищем може бути досліджено на чутливість до антибіотиків 25-50 культур).

Досліджувані культури вирощують в термостаті протягом 18-20 годин на скошених поживних середовищах. Ріст культур змивають теплим стерильним розчином NaCl з 0.1%-ним розчином желатину і стандартизують до 850млн. бактерій на мл (бактеріальний стандарт №10).

Культури одного виду і з одного матеріалу досліджують окремо або готують із них суміш в рівних об’ємах, так, щоб в 1мл суміші була така ж густина (850млн/мл).

1.1.5.Техніка посіву досліджуваних культур на середовище з антибіотиками.

Перед посівом досліджуваним культурам присвоюють номери трафарету, які заносять у протокол досліджень. Відомі 2 варіанти, які дають ідентичні результати.

Посів штампом-реплікатором.

Досліджувані культури пастерівською піпеткою вносять у лунки основи штампа-реплікатора. Порядок внесення культур повинен відповідати присвоєним їм, згідно трафарету,