Марія у себе в кімнаті зайнята вишиванням. Прийшовши Річчіо пояснює їй, що не міг поїхати, оскільки у нього поєдинок з Дугласом вранці. Він зізнається, що життя без її любові йому не потрібна. Він просить Марію віддати йому вінок із троянд - він поставить квіти на вівтарі в Римі ... Входять Генріх, Дуглас і Діндсей і вбивають Річчіо. Королева непритомніє. Дуглас вражений соромом і жахом - він добровільно видаляється у вигнання. Генріх занепокоєний, не зненавидить чи його королева. Ліндсей захоплює короля геть, нашіптуючи йому про майбутнього полювання. Входить запрошений королевою Ботвел. Марія приходить до тями, бачить Ботвела і зізнається йому в коханні. Ботвел змушує її визнати, що вона хоче смерті Генріха і віддає їй свій флакон з отрутою, сказавши, що це снодійне. Марія передає королю це «ліки», але отрута випиває блазень. Проте вже ніщо не може зупинити вбивчу інтригу - Ботвел підриває будиночок короля Генріха. На віддалі чути наростаючі крики натовпу. Ботвел з королевою ховаються.