АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

ВОРОНІНА Алла Костянтинівна

УДК 615.9; 065: 099: 212; 356

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ ЗНИЖЕННЯ ТОКСИЧНОСТІ ПАРАЦЕТАМОЛУ ШЛЯХОМ МОДУЛЯЦІЇ ЙОГО МЕТАБОЛІЗМУ В ПЕЧІНЦІ

14.03.06 — токсикологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фармакології та токсикології АМН України

Науковий керівник - доктор біологічних наук КОВАЛЕНКО Валентина Миколаївна, Інститут фармакології та токсикології АМН України, завідуюча відділом загальної токсикології

Офіційні опоненти: - доктор біологічних наук КОКШАРЬОВА Наталія Володимирівна, Інститут екогігієни та токсикології ім. Л. І. Медведя МОЗ України, керівник лабораторії нейротоксикології;

- кандидат біологічних наук БОЙЦОВА Людмила Василівна, Інститут фармакології та токсикології АМН України, провідний науковий співробітник відділу експериментальної терапії.

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О. О. Богомольця, МОЗ України, кафедра фармакології

Захист дисертації відбудеться 20.02.2001 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє 14).

Автореферат розісланий 18.01. 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

Д 26.550.01

к.б.н. Данова І. В

.ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Переважна більшість захворювань супроводжується болем, отже, анальгетики, особливо ненаркотичні, представляють категорію ліків найбільш поширеного використання.

Парацетамол (ПА) – засіб, який широко використовується у фармакотерапії, як самостійно, так і у складі комбінованих препаратів. Незважаючи на те, що він вважається досить безпечним, за останні 10 років накопичено велику кількість даних щодо токсичної дії ПА, і ця проблема для багатьох країн є досить актуальною. Так, отруєння ПА складають 5 % від загальної кількості інтоксикацій в США (M. Lavy, 1988), а за смертністю дітей внаслідок отруєння ПА, наприклад, в 1995 році він займає третє місце (R. Hanzlick, 1996). Аналогічні дані зареєстровані медиками Великобританії, Франції та Австралії (G. S. Grennell, 1997; C. T. Chiaviallo et. аl., 1994).

Аналіз даних літератури свідчить, що не лише передозування ПА, але й застосування його в терапевтичних дозах протягом тривалого часу, використання хворими на діабет, гепатити різної етіології, алкоголізм, а також за умов незбалансованості харчування, тривалого контакту з органічними розчинниками в промисловості та побуті призводять до гострого ураження печінки (C. S. Lieber, 1997).

Причиною розвитку гострої печінкової недостатності є порушення метаболізму ПА внаслідок індукції цитохромів Р-450, в першу чергу ізоформи Р-450 2Е1, та активація монооксигеназ ендоплазматичного ретикулуму печінки, що супроводжується зниженням її антиоксидантного статусу. Це спричиняє накопичення високореактивних метаболітів та активних форм кисню, здатних взаємодіяти з органелами клітин печінки, ініціюючи їх пошкодження та некроз (M. Black, 1984; P. A. Webster та співавт., 1996).

Як антидоти при отруєнні ПА використовуються попередники біосинтезу глутатіону (метіонін, N-ацетилцистеїн). Але обмеженість термінів їх ефективності (10-12 год після отруєння) та здійснення детоксикуючої дії лише в межах другої фази детоксикації є недоліком, що вимагає пошуку засобів, здатних проявляти поліфункціональні властивості: запобігати утворенню реактивних метаболітів, сприяти глутатіонзалежній кон'югації та проявляти антиоксидантну активність. Це дозволило б значно розширити спектр застосування ПА та зменшити прояви його побічної дії.

Аналізуючи літературні дані стосовно механізмів гепатотоксичності ПА та біологічних властивостей ряду фізіологічно активних речовин (метіонін, a-токоферол, нікотинамід, тіамін, цинк та ін.), здатних справляти комплексний коригуючий вплив на окремі ланки патогенезу токсичної дії ПА, значний інтерес представила розроблена у відділі біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України експериментальна композиція, до складу якої входять метіонін, a-токоферол, нікотинамід, тіамін та цинк (робоча назва "Метавіт").

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано у відповідності з планом науково-дослідних робіт Інституту фармакології та токсикології АМН України в межах теми “Дослідження ролі вільнорадикального окиснення в патогенезі токсичної дії ксенобіотиків та її корекція похідними токоферолу” (№ державної реєстрації 0195U003201).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було експериментальне обґрунтування зниження токсичності ПА шляхом модуляції процесів його біотрансформації в печінці.

Для досягнення вищезазначеної мети були поставлені наступні завдання:

1. Вивчити вплив композиції "Метавіт" та метіоніну на активність ферментів монооксигеназної системи печінки щурів при отруєнні ПА.

2. Дати порівняльну характеристику коригуючої ефективності "Метавіту" та метіоніну щодо функціонування глутатіонової системи печінки щурів за умов токсичної дії ПА, введеного ізольовано та на фоні індукції етанолзалежної ізоформи цитохрому Р-450.

3. Дослідити стан процесів вільнорадикального окиснення за отруєння ПА та антиоксидантні властивості "Метавіту" і метіоніну.

4. Вивчити ферментативну активність I-II та I-III комплексів дихального ланцюга мітохондрій печінки щурів за токсичної дії ПА та вплив на ці процеси композиції "Метавіт" та метіоніну.

5. Визначити гепатопротекторну ефективність "Метавіту" та метіоніну за умов отруєння ПА.

6. Провести порівняльне дослідження параметрів гострої токсичності для мишей та щурів ПА, уведеного внутрішньошлунково ізольовано, в комбінації з індуктором цитохрому Р-450 2Е1 етанолом (однократно та за умов експериментального алкоголізму), а також визначити вплив "Метавіту" та метіоніну .

7. Вивчити вплив "Метавіту" на специфічну (анальгезуючу) ефективність ПА.

Об'єкт дослідження. Гепатотоксичність ПА внаслідок порушення процесів його біотрансформації, які супроводжуються зростанням інтенсивності утворення високореактивного метаболіту, N-ацетил-п-бензохіноніміну, та виснаженням пулу глутатіону, активацією процесів вільнорадикального окиснення та модифікацією функціональних властивостей мітохондрій.

Предмет дослідження. Шляхи фармакологічної корекції біотрансформації ПА, яка зумовлює його гепатотоксичну дію.

Методи дослідження. В роботі використано методи: токсикологічні, біохімічні морфологічні, фармакологічні, статистичні.

Наукова новизна досліджень. В результаті проведених досліджень вперше експериментально обґрунтовано доцільність комплексного підходу, щодо корекції метаболізму ПА та зменшення його гепатотоксичної дії. Показано, що застосування композиції, яка крім відомого антидоту, метіоніну, містить ряд біологічно активних сполук, дозволяє справляти багатовекторний коригуючий вплив на окремі ланки патогенезу токсичної дії ПА. Зокрема, в умовах індукції етанолом доведено можливість інгібування активності цитохром Р-450 2Е1-залежних монооксигеназ, які в межах першої фази біотрансформації ПА зумовлюють утворення токсичного метаболіту - N-ацетил-п-бензохіноніміну. Крім того, переконливо показано, що введення спільно з анальгетиком "Метавіту" дозволяє оптимізувати процеси глутатіонзалежної кон'югації реактивних інтермедіатів ПА.

З огляду на відсутність остаточної визначеності щодо ролі перекисного окиснення ліпідів у патогенезі токсичної дії ПА, виявлене нами зростання інтенсивності вільнорадикальних процесів та зниження антиоксидантної активності печінки за умов гострого отруєння ПА значно розширює розуміння механізмів його гепатотоксичної дії.

Завдяки антиоксидантним властивостям "Метавіту" його застосування дозволяє значно знизити прооксидантну дію ПА на мембрани субклітинних органел, в першу чергу мітохондрій, які, як нами підтверджено, є критичною мішенню токсичних інтермедіатів та продуктів перекисного окиснення. Вперше встановлено, що сукцинатзалежний комплекс дихального ланцюга мітохондрій є більш чутливим до дії токсичних доз ПА.

Зроблено значний теоретичний внесок в концепцію гепатотоксичної дії ПА та визначено основні шляхи її фармакологічної корекції.

Практичне значення роботи. Експериментально обгрунтовано основні напрямки створення фармакологічних засобів профілактики та лікування токсичної дії ксенобіотиків, метаболізм яких здійснюється із залученням цитохрому Р-450 2Е1.

За результатами роботи розроблено рекомендації, які знайшли своє відображення у Інформаційному листі: "Фармакокорекція токсичної дії парацетамолу" (№ 13 2001 р.).

Результати роботи використано при плануванні теми АМН України: "Вивчення механізмів біотрансформації фармакологічних речовин з ряду ароматичних сполук, які метаболізуються за допомогою цитохрому Р450 2Е1, та обґрунтування напрямків зниження їх токсичності шляхом корекції обміну в печінці" (№ державної реєстрації 0100U000297).

Результати проведених досліджень впроваджено в учбовий процес на кафедрах фармакології Дніпропетровської державної медичної академії, Луганського державного медичного університету, Вінницького державного медичного університету, Національної Української фармацевтичної академії.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено патентно-інформаційний пошук, проведено аналіз даних літератури за темою дисертації, відпрацьовано моделі та виконано експериментальні дослідження, а також аналіз, систематизацію та статистичну обробку одержаних результатів, оформлено їх у вигляді таблиць та рисунків, сформульовано основні положення та висновки роботи. Морфологічні дослідження виконано за участю Матвієнко А. В., провідного наукового співробітника відділу патоморфології Інституту фармакології та токсикології АМН України.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на 2-ому Міжнародному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль, 1998); науковій конференції "Актуальные проблемы токсикологии" (Киев, 1999); I Українській конференції молодих вчених, присвяченій пам’яті В. В. Фролькіса (Київ, 2000); науково-практичній конференції молодих вчених "Актуальні проблеми фармакології та токсикології" (Київ, 2000); науковому семінарі Інституту фармакології та токсикології АМН України (Київ, 2000).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано десять наукових праць, з них – п'ять статей у фахових журналах та п'ять тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів та методів досліджень, 4 глави власних досліджень, заключення, висновки, список використаних джерел. Дисертаційна робота викладена на 146 сторінках машинопису. Роботу ілюстровано 19 рисунками та 29 таблицями. Бібліографія включає 33 вітчизняних та 188 іноземних джерела.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. В роботі використано: субстанцію парацетамолу фірми "Pfannenschidt", Німеччина, субстанцію метіоніну виробництва АТ "Київський вітамінний завод". Експериментальний зразок композиції "Метавіт", до складу якої входять метіонін, нікотинамід, тіамін, вітамін Е та цинк у вигляді мікроелементу, надано Інститутом біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України.

Експерименти проведено на мишах-самцях масою тіла 18-22 г та щурах-самцях масою тіла 180-220 г розведення віварію Інституту фармакології та токсикології АМН України.

ПА, "Метавіт" та метіонін уводили тваринам внутрішньошлунково в 2 %-вому крохмальному гелі. Дози "Метавіту" (ЕД50, визначеної для кожної моделі окремо) знаходились в межах 25-50 мг/кг маси тіла. Метіонін вводили в аналогічній дозі. Параметри гострої токсичності ПА визначали за методом D. J. Litchfield та E. Wilcoxon (1949). Загибель тварин реєстрували протягом 14 діб після введення ПА. Середньосмертельну дозу (ЛД50) ПА за алкоголізму мишей та щурів, середню ефективну дозу (ЕД50) "Метавіту" та метіоніну визначали за методом В. Б. Прозоровського (1998). Середній час загибелі тварин (ЛТ50) - за методом Г. Н. Красовського та співавт. (1982).

Вплив композиції "Метавіт" та метіоніну на процеси біотрансформації ПА досліджували на щурах, уводячи ПА в дозі 1/2 ЛД50, яка при надходженні останнього ізольовано, в комбінації з етанолом (3,2 г/кг – ЕД50 щодо ефекту "бокового положення тіла") та за алкоголізму склала відповідно: 1250, 400 та 500 мг/кг маси тіла. Алкоголізм моделювали згідно Ю. В. Бурова та Н. Н. Ведерникова (1985).

Через 24 год після останнього введення ПА ізольовано, спільно з "Метавітом" або метіоніном тварин під легким ефірним наркозом знеживлювали шляхом цервікальної дислокації. Печінку промивали через воротну вену охолодженим 1%-вим розчином KCl та гомогенізували в 0,05 М трис-НСl буфері (рН 7,4). Мітохондріальну та постмітохондріальну фракції печінки виділяли за методом І. І. Карузиної та А. І. Арчакова (1977). Усі процедури виконували при температурі не вище 40С.

Стан монооксигеназної системи оцінювали за вмістом цитохрому P-450, який визначали за методом T. Omura і R. Sato, (1964), анілін-п-гідроксилазною та амідопірин-N-деметилазною активністю постмітохондріальної фракції печінки (І. І. Карузина та А. І. Арчаков, 1977).

При дослідженні глутатіонової системи визначали вміст відновленого глутатіону печінки методом J. Sedlak і R. Lindsay (1968), глутатіон-S-трансферазну активність постмітохондріальної фракції печінки оцінювали згідно W. H. Habig та співавт. (1974), а глутатіонредуктазну - за методом I. Carlberg і B. Manervik (1985).

В мітохондріях печінки визначали вміст супероксиданіону та гідроперекисів відповідно B. M. Babior та співавт. (1973) і Л. А. Романової, І. Д. Стальної (1977). Швидкість індукованого аскорбіновою кислотою та НАДФH накопичення малонового діальдегіду (МДА) досліджували в постмітохондріальній фракції печінки за методом І. Д. Стальної і Т. Г. Гаришвілі (1977). Кількість сульфгідрильних груп білків в гомогенаті печінки – згідно методу J. Sedlak і R. Lindsay (1968). Крім того визначали каталазну активність гомогенату печінки за методом М. А. Королюк та співавт. (1988).

Функціональний стан мітохондрій печінки вивчали за сукцинатцитохром с-редуктазною (D. T. Howard, 1967), НАДH-цитохром с-редуктазною (J. Hatefi, J. S. Rieske, 1967) та сукцинатдегідрогеназною (R. Cooper, 1967) активністю.

Порушення печінки за токсичної дії ПА та гепатозахисну ефективність "Метавіту" досліджували за активністю аланін- (АлАТ), аспартатамінотрансферази (АсАТ) та лужної фосфатази (ЛФ) в сироватці крові, використовуючи біотести НПП "Філісіт – Діагностика" (Україна), а також гістологічними методами.

Білок у гомогенаті та субклітинних структурах печінки визначали за методом O. H. Lowry та співавт. (1951).

Вплив композиції "Метавіт" на анальгезуючу активність ПА вивчали за ноцицептивної стимуляції: хімічної, "оцтовокислі корчі", (S. H. Ferreira, 1985) та термічної, "тест із зануренням хвоста". (Grotto M. та Sulman F. G., 1967).

Статистичну обробку одержаних даних проводили з використанням критерію Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

В результаті проведених досліджень показано, що внутрішньошлункове введення щурам ПА в дозі 1/2 ЛД50 окремо, в комбінації з індуктором цитохрому Р-450 2Е1, етанолом, та на фоні алкоголізму призводило до зростання анілін-п-гідроксилазної активності постмітохондріальної фракції печінки – маркера цитохрому Р-450 2Е1 – відповідно на 21, 41 та 50 % порівняно з інтактною групою. Введення за аналогічних умов експерименту одночасно з ПА "Метавіту" сприяло зниженню даного показника на 80, 23 та 38 %, відповідно, по відношенню до контролю. Це свідчить про зменшення індукції цитохрому Р-450 2Е1, який зумовлює утворення гепатотоксичного метаболіту N-ацетил-п-бензохіноніміну (рис. 1 А). Поряд із цим слід зазначити, що, незважаючи на індукцію анілін-п-гідроксилазної активності в печінці щурів за отруєння ПА та комбінації його з етанолом, загальний рівень цитохрому Р-450 через 24 год знизився відповідно на 50 та 40 % порівняно з інтактними тваринами. Причиною цього може бути ковалентна взаємодія N-ацетил-п-бензохіноніміну з цитохромами з наступною їх деградацією, а також інактивація їх продуктами вільнорадикального окиснення, здатних взаємодіяти з ліпідами ендоплазматичного ретикулума, які визначають мікрооточення білкових кластерів цитохрому Р-450 в мембрані (D. W. Nebert, 1987). Спільне введення ПА та "Метавіту" дозволило запобігти зниженню вмісту цитохрому Р-450 в середньому на 20-25 % у гострих експериментах (рис. 1 Б).

І навпаки, за умов хронічного надходження етанолу при алкоголізмі, очевидно, внаслідок індукції цитохрому Р-450 2Е1 загальний рівень цитохрому Р-450 в печінці отруєних ПА тварин виявився вищим відносно інтактної групи на 35 %. Уведення "Метавіту" поряд із зазначеним вище зниженням анілін-п-гідроксилазної активності сприяло нормалізації вмісту цитохрому Р-450 в постмітохондріальній фракції печінки.

Рис. 1 Анілін-п-гідроксилазна активність (А) та вміст цитохрому Р-450 (Б) у постмітохондріальній фракції печінки щурів за різних умов отруєння парацетамолом та вплив на ці показники "Метавіту" і метіоніну

Примітки:

1. Контроль – групи тварин, яким вводили парацетамол (ізольовано, в комбінації з етанолом або за алкоголізму) без застосування фармакотерапевтичних засобів;

2. - парацетамол;

3. - парацетамол + через 3 год етанол;

4. - алкоголізм + парацетамол.

Отже, результати досліджень, проведених на моделях індукції цитохрому Р-450 2Е1, свідчать, що "Метавіт" здатен попереджати залежну від цитохрому Р-450 токсичну біотрансформацію ПА та знижувати інтенсивність утворення N-ацетил-п-бензохіноніміну. Метіонін, з огляду на дані, представлені на рис. 1, виявив незначну здатність знижувати анілін-п-гідроксилазну активність при отруєнні ПА, а отже, впливати на I фазу біотрансформації ПА.

Вивчення особливостей функціонування II фази детоксикації ПА, уведеного ізольовано або за 3 год до надходження етанолу, показано, що вміст глутатіону в гомогенаті печінки щурів знижувався на 30 %, а за експериментального алкоголізму – майже вдвічі (рис. 2 А). Зростання відносно контролю вмісту відновленого глутатіону в печінці щурів при введенні одночасно з ПА "Метавіту" сприяло збільшенню глутатіон-S-трансферазної активності, забезпечуючи ефективне виведення токсичних продуктів I фази біотрансформації ПА (рис. 2 Б).

Рис. 2. Зміни вмісту відновленого глутатіону (А) і глутатіонтрансферазної активності (Б) в печінці щурів, яким вводили парацетамол, та вплив на ці показники "Метавіту" і метіоніну

Примітки:

1. Контроль – групи тварин, яким вводили парацетамол (ізольовано, в комбінації з етанолом та за алкоголізму) без застосування фармакотерапевтичних засобів;

2. - парацетамол;

3. - парацетамол + через 3 год етанол;

4. - алкоголізм + парацетамол;

5. За 100 % прийнято показники інтактних тварин;

6. * - Р< 0,05 порівняно з інтактними тваринами;

7. ** - Р< 0,05 порівняно з контролем.

Метіонін поступався досліджуваній композиції за впливом на вміст глутатіону та глутатіонтрансферазну активність печінки щурів, отруєних ПА.

Окрім вказаних вище властивостей, глутатіон, як компонент антиоксидантної системи організму, запобігає переокисненню ліпідів та білків, захищаючи сульфгідрильні групи останніх (Sen C.K. та співавт., 1994). Тому виявлена нами здатність композиції "Метавіт" попереджувати зниження рівня глутатіону та зберігати вміст білкових SH-груп при отруєнні ПА в гострих дослідах на рівні інтактних тварин є важливим фактором збереження структурно-функціональних властивостей печінки.

Відомо, що активація цитохром Р-450-залежних ферментів монооксигеназної системи супроводжується посиленням вільнорадикального окиснення (Арчаков А.І., 1998), що може розглядатись як додаткова ланка в патогенетичному ланцюзі дії ПА.

Це знайшло своє підтвердження в результатах наших досліджень, де показано, що в мітохондріях печінки щурів при введенні ПА в дозі 1/2 ЛД50 вміст гідроперекисів зріс в 2,3 рази, а рівень супероксиданіону за комбінованого введення ПА з етанолом перевищив норму в 5,9 разів (рис. 3). Аналогічні дані, щодо активації процесів перекисного окиснення ліпідів одержано нами при дослідженні індукованого аскорбатом та НАДФH утворення МДА (рис. 3). Швидкість НАДФH-залежного (ферментативного) ПОЛ майже вдвічі перевищила індуковане аскорбіновою кислотою утворення продуктів взаємодії з тіобарбітуровою кислотою в постмітохондріальній фракції печінки щурів, що підтверджує визначальну роль монооксигеназної системи в активації вільнорадикальних процесів за токсичної дії ПА.

Застосування "Метавіту" на всіх моделях введення ПА дозволило попередити зростання вмісту супероксиданіонів і гідроперекисів в мітохондріях та інтенсивності індукованого утворення МДА в постмітохондріальній фракції печінки щурів.

Очевидно, антиоксидантні властивості "Метавіту" зумовлені комплексною дією його інгредієнтів (a-токоферол, нікотинамід, цинк, метіонін). При цьому відмічено активацію майже на 30 % каталази та глутатіонредуктази печінки щурів. При одночасному введенні з ПА метіоніну інтенсивність вільнорадикального окиснення зменшувалась, але активність антиоксидантних ферментів залишилась практично на рівні тварин, отруєних ПА.

Виявлена нами активація процесів вільнорадикального окиснення, а також зростання анілін-п-гідроксилазної активності, а, отже, утворення реактивних продуктів біотрансформації ПА, здатних взаємодіяти з ліпідами та білками, в першу чергу SH-групами, може викликати порушення структурно-функціональних властивостей мембран. Значною мірою це стосується багатих на сульфгідрильні групи мітохондріальних ферментів, яким належить вирішальна роль у забезпеченні енергетичного обміну в клітині.

Рис. 3 Вплив композиції "Метавіт" на показники вільнорадикального окиснення в печінці щурів при отруєнні парацетамолом (А) та токсичній дії його в комбінації з етанолом (Б), відносно інтактних тварин

Встановлене нами значне зниження сукцинат- та НАДH-цитохром с-редуктазної активності при отруєнні ПА (табл. 1) вказує на те, що порушення функцій мітохондрій є важливим фактором токсичної дії ПА. Показано здатність композиції "Метавіт" та метіоніну запобігати інгібуванню ферментів дихального ланцюга мітохондрій печінки при отруєнні ПА.

Таблиця 1

Активність ферментів дихального ланцюга мітохондрій печінки щурів за різних моделей застосування парацетамолу (·) та вплив на ці показники "Метавіту" і метіоніну, (нмоль/хвґмг білка; n і 6)

Моделі токсичної Експериментальні групи

дії ПА інтактна етанол алкоголізм контроль "Метавіт" метіонін

Сукцинатцитохром с-редуктаза

ПА (1250 мг/кг) 28,4±2,1 – – 17,8±1,4 * 27,8±3,0 Ё 25,1±2,1 Ё

ПА (400мг/кг) + етанол (3,2 г/кг) 54,7 ± 2,4 51,4±3,8 Ё – 29,4±2,3 * 51,2±4,4 Ё 24,0±2,2 *

алкоголізм + ПА (500мг/кг) 38,5 ± 2,7 – 80,3±1,6 *Ё 63,4 ± 1,7 * 76,6±1,7 *Ё 71,6±2,2 *Ё

НАДН-цитохром с-редуктаза

ПА (1250 мг/кг) 552,3± 34,2 – – 365,7±21,3* 531,8±40,2Ё 520,1±31,1Ё

ПА (400 мг/кг) + етанол (3,2 г/кг) 633,8±56,7 607,5±51,2 – 615,6 ± 44,0 653,4 ± 39,3 548,8 ± 23,2

алкоголізм +ПА (500 мг/кг) 523,4±24,6 – 436,1±8,6*Ё 349,9±11,6* 517,7±9,8Ё 432,7±4,5*Ё

Примітки:

1. · - дози парацетамолу для кожної моделі складають 1/2 ЛД50;

2. Контроль - групи тварин, яким вводили парацетамол (ізольовано, в комбінації з етанолом або за алкоголізму) без застосування фармакотерапевтичних засобів;

3. * - Р< 0,05 порівняно з інтактними тваринами;

4. Ё - Р< 0,05 порівняно з контролем.

При моделюванні отруєння ПА за однократного та хронічного введення етанолу ми спостерігали суттєву різницю у функціонуванні мітохондріальних ферментів. Так, в першому випадку не спостерігалось змін НАДН-цитохром с-редуктазної активності, в той час як сукцинатцитохром с-редуктазна - знизилась майже вдвічі (табл. 1). Отже, сукцинатцитохром с-редуктаза більш чутлива до токсичних проявів ПА. Не виключено, що це є наслідком зменшення кількості SH-груп апоферменту, що відіграє важливу роль у реалізації ферментативної активності сукцинатдегідрогенази.

За експериментального алкоголізму мало місце інгібування функціонування ферментного комплексу I-II на 17 % (табл. 1) та зростання активності сукцинатзалежного шляху транспорту електронів мітохондрій. Даний механізм слід розглядати, як один із шляхів адаптації до несприятливих факторів: ПА в дозі 500 мг/кг маси тіла за умов хронічної дії алкоголю призводив до зниження сукцинатцитохром с-редуктазної активності мітохондрій печінки на 21 % відносно алкоголізованних щурів, але порівняно з інтактною групою вона залишилась вищою на 65 %. За цих умов активність НАДН-цитохром с-редуктази зменшилась на 33 % відносно інтактної групи.

Уведення композиції "Метавіт" за умов однократної та багатократної дії алкоголю дозволило попередити порушення функціонування мітохондріальних ферментів, в той час як одночасне застосування ПА та метіоніну, незалежно від моделі, не виявило суттєвого ефекту на активність ферментів дихального ланцюга мітохондрій.

Здатність "Метавіту" коригувати метаболізм ПА шляхом попередження накопичення токсичних інтермедіатів обумовила його гепатопротекторні властивості. Нами показано, що одночасне введення ПА та композиції "Метавіт" сприяло зниженню активності АлАТ сироватки крові в гострих експериментах в 2 рази і при алкоголізмі - на на 17 порівняно з контролем (рис. 4).

Одночасно спостерігалось зниження активності АсАТ в середньому на 30-45 % та нормалізація масового коефіцієнта печінки щурів. Метіонін проявив меншу ефективність. Це підтверджено й морфологічними дослідженнями, де показано, що введення "Метавіту" за отруєння ПА сприяло зменьшенню ступеня ушкодження печінки.

Порівняльне вивчення здатності "Метавіту" та метіоніну проявляти захисні властивості щодо гострого отруєння ПА на рівні організму дозволило встановити, що при одноразовому внутрішньошлунковому введенні мишам "Метавіту" спільно з ПА на рівні ЛД50 останнього, в комбінації анальгетика з етанолом або за умов алкоголізму захисний індекс композиції дорівнював, відповідно, 3,05, 2,83 і 2,0, а середній час загибелі тварин подовжувався на 30-40 %. Детоксикуючі властивості метіоніну виявились значно нижчими.

Рис. 4 Зміни аланінамінотрансферазної (А) та аспартатамінотрансферазної (Б) активності сироватки крові щурів, яким вводили парацетамол, та вплив на ці показники "Метавіту" і метіоніну

Примітки:

1. * - Р< 0,05 порівняно з інтактними тваринами;

2. ** - Р< 0,05 порівняно з контролем.

При спільному застосуванні ПА і "Метавіту" принциповим постає питання впливу композиції на фармакологічні властивості останнього. На моделях термічної (тест із зануренням хвоста) та хімічної ("оцтовокислі корчі") ноцицептивної стимуляції мишей встановлено, що внутрішньошлункове введення одночасно з ПА композиції "Метавіт", не призводить до зниження анальгезуючої активності ПА. Більше того, на моделі хімічної ноцицептивної стимуляції спостерігалось посилення фармакологічної ефективності ПА при сумісному застосуванні з "Метавітом" у дозі 50 мг/кг.

Аналіз даних літератури та результати власних досліджень дозволили розробити гіпотетичну схему патогенезу токсичної дії ПА (рис. 5) та визначити основні ланки комбінованої фармакологічної корекції його біотрансформації, яка зумовлює гепатотоксичну дію.

Рис. 5 Схема патогенезу токсичного ураження печінки парацетамолом та основні напрямки фармакотерапевтичної корекції

ВИСНОВКИ

1. Композиція "Метавіт" (ЕД50), введена внутрішньошлунково одночасно з парацетамолом (1/2 ЛД50), на відміну від метіоніну, попереджує зростання анілін-п-гідроксилазної активності, маркера цитохрому Р-450 2Е1, у постмітохондріальній фракції печінки щурів, що свідчить про інгібування утворення гепатотоксичного метаболіту парацетамолу - N-ацетил-п-бензохіноніміну.

2. Гостре отруєння щурів парацетамолом, введеним ізольовано та в комбінації з етанолом, призводить до зниження рівня цитохрому Р-450 на 40-50 % та зростання його вмісту на 35 % за умов хронічної дії етанолу. Композиція "Метавіт" в значній мірі попереджує зміни рівня цитохрому Р-450, в той час як метіонін на моделі експериментального алкоголізму виявився неефективним.

3. Уведення "Метавіту" за різних моделей отруєння парацетамолом, що супроводжується зниженням вмісту глутатіону на 20-47 %, викликає вірогідне збільшення вмісту глутатіону в печінці щурів відносно контролю. Метіонін, введений одночасно з парацетамолом на моделі алкоголізму поступався досліджуваній композиції.

4. За умов токсичної дії парацетамолу зростає швидкість аскорбатзалежного та НАДФH-залежного утворення МДА (відповідно на 35 % та 60 %) в постмітохондріальній фракції, збільшується вміст супероксиданіону та гідроперекисів (в 2,5 та 2,3 рази відповідно) в мітохондріях печінки щурів. "Метавіт" та метіонін при одночасному введенні з парацетамолом попереджують підвищення зазначених показників, що свідчить про наявність у них антиоксидантних властивостей.

5. "Метавіт" та метіонін запобігають порушенню НАДH- та сукцинатцитохром с-редуктазної активності мітохондрій печінки щурів, отруєних парацетамолом.

6. За умов гострого отруєння парацетамолом, яке призводить до гіперферментемії, "Метавіт" сприяє зниженню аланін- та аспартатамінотрансферазної активності сироватки крові майже в 2 та 1,5 рази, відповідно, не поступаючись метіоніну, що вказує на гепатопротекторні властивості "Метавіту".

7. При гострому отруєнні мишей парацетамолом, введеним в шлунок ізольовано, в комбінації з етанолом та за умов хронічної дії етанолу, захисний індекс "Метавіту" складає відповідно 3,05, 2,83 та 2,0.

8. "Метавіт" на моделях хімічної та термічної ноцицептивної стимуляції мишей не знижує анальгезуючу активність парацетамолу.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Вплив композиції "Метавіт" на процеси детоксикації в печінці щурів, отруєних ацетамінофеном / співавт. В. М. Коваленко, О. С. Волошина, Ю. М. Пархоменко // Современные проблемы токсикологии. - 1999. - №4. - С. 36-39.

2. Особливості функціонування ферментів дихального ланцюга мітохондрій печінки щурів за умов отруєння парацетамолом та коригування вітамінною композицією "Метавіт" / співавт. І. С. Блажчук, В. М. Коваленко, Г. М. Шаяхметова, В. Л. Сингаєвська, Ю. М. Пархоменко // Ліки. - 1999. - №5-6. - С. 71-74.

3. Дослідження антиоксидантних і гепатопротекторних властивостей композиції "Метавіт" за умов гострого отруєння ацетамінофеном / співавт. В. М. Коваленко, Г. М. Шаяхметова, Ю. М. Пархоменко // Современные проблемы токсикологии. - 2000. - №1. - С. 53-56.

4. Вплив композиції "Метавіт" на процеси детоксикації парацетамолу у щурів за умов хронічної дії алкоголю / співавт. Коваленко В. М., Волошина О. С., Пархоменко Ю. М. // Львівський медичний часопис. – 2000. - №1. – С. 104-107.

5. Вплив композиції Метавіт на механізми токсикогенезу парацетамолу в комбінації з етиловим спиртом / співавт. Коваленко В. М., Шаяхметова Г. М., Волошина О. С., Донченко Г. В. // Медична хімія. – 2000. - №4. – С. 31-35.

6. Актопротекторні та детоксикуючі властивості оригінальної композиції адаптогенної дії / співавт. В. О. Охріменко // Міжнародний медичний конгрес студентів і молодих вчених, Тернопіль, 6-8 травня 1998. - С. 74-75.

7. Дослідження механізмів біотрансформації парацетамолу в печінці щурів за умов його передозування / співавт. В. М. Коваленко // Науч. конф. “Актуальные проблемы токсикологии”, Киев, сентябрь 1999. - С. 33.

8. Вплив композиції "Метавіт" на процеси біотрансформації парацетамолу у щурів за умов хронічної дії алкоголю / співавт. В. М. Коваленко, О. С. Волошина // I Українська конференція молодих вчених присвячена пам’яті академіка В. В. Фролькіса, Київ, 31 березня - 1 квітня 2000. - С. 24-26.

9. Вплив композиції "Метавіт" на І фазу біотрансформації парацетамолу, введеного щурам в комбінації з етиловим спиртом / співавт. В. М. Коваленко, Г. М. Шаяхметова, О. С. Волошина // Всеукраїнська науково-практична конференція молодих вчених, Київ, 16-17 жовтня 2000. – С. 18.

10. Біохімічні показники гепатопротекторної ефективності Метавіту при введенні парацетамолу щурам з експериментальним алкоголізмом // Науково-практична конференція молодих вчених “Актуальні проблеми фармакології та токсикології”, Київ, 7 грудня 2000. – С. 8-9.

АНОТАЦІП

Вороніна А. К. Експериментальне обґрунтування зниження токсичності парацетамолу шляхом модуляції його метаболізму в печінці. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.06 - токсикологія. - Інститут фармакології та токсикології АМН України, Київ, 2001.

Дисертаційна робота присвячена експериментальному обґрунтуванню зниження токсичності парацетамолу шляхом впливу на його біотрансформацію. Показано, що експериментальна композиція "Метавіт", до складу якої входить метіонін, а також ряд вітамінів та Zn у вигляді мікроелементу, уведена щурам та мишам внутрішньошлунково спільно з токсичними дозами парацетамолу, комбінації останнього з етанолом та на фоні алкоголізму здатна знижувати загальну гостру токсичність та гепатотоксичну дію анальгетика шляхом корекції механізмів його метаболізму в печінці, перевищуючи ефективність метіоніну.

Зменшення токсичної дії анальгетика відбувається завдяки зниженню залежного від цитохрому Р-450 2Е1 утворення реактивних метаболітів ПА, активації процесів кон’югації з глутатіоном, зменшенню інтенсивності вільнорадикального окиснення в печінці, нормалізації мітохондріального дихання.

Ключові слова: парацетамол, "Метавіт", метіонін, гепатотоксичність, печніка, цитохром Р-450 2Е1, глутатіон, анілін-п-гідроксилаза, мікросоми, мітохондрії, вільнорадикальне окиснення, вітаміни.

Воронина А. К. Экспериментальное обоснование снижения токсичности парацетамола путем модуляции его метаболизма в печени. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.06 - токсикология. - Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев, 2001.

Диссертационная работа посвящена экспериментальному обоснованию снижения токсичности парацетамола путем влияния на его биотрансформацию.

Несмотря на то, что ПА считается безопасным фармакологическим средством, за последние 10 лет накоплено достаточное количество данных о его токсичности не только при передозировке, но и применении в терапевтических дозах на протяжении длительного времени, использовании больными алкоголизмом, диабетом, различными типами гепатита и др. Это обуславливает актуальность поиска путей снижения токсичности ПА.

Целью настоящей работы было экспериментальное обоснование снижения токсичности ПА путем модуляции процессов его биотрансформации в печени.

Результаты исследований, проведенных с использованием различных моделей индукции цитохрома Р-450 2Е1, свидетельствуют о том, что экспериментальная композиция "Метавит", в состав которой кроме общепринятого антидота при отравлениях парацетамолом входит витаминный комплекс, включающий преимущественно витамины группы В, a-токоферола ацетат и цинк в виде микроэлемента, способна в значительной степени предотвращать токсическую биотрансформацию ПА с участием монооксигеназных ферментов, зависимых от цитохрома Р-450, а, следовательно, снижать интенсивность образования высокореактивного метаболита - N-ацетил-п-бензохинонимина, который обуславливает проявление гепатотоксичности анальгетика.

Изучение особенностей функционирования второй фазы детоксикации с участием глутатионовой системы выявило снижение содержания восстановленного глутатиона в гомогенате печени крыс при введении токсических доз ПА изолировано или за 3 часа до этилового спирта на 30 %, а при алкоголизме – в два раза по сравнению с интактной группой. В связи с этим, обнаруженная нами способность композиции "Метавит" сохранять содержание глутатиона в острых экспериментах на уровне интактных животных, и существенно предупреждать его снижение при введении ПА крысам, у которых предварительно моделировали алкоголизм, является важным фактором влияния исследуемой композиции на процессы детоксикации в печени.

Поддержание пула восстановленного глутатиона при одновременном введении с ПА "Метавита" способствовало сохранению глутатион-S-трансферазной активности на уровне, способном обеспечить эффективное выведение токсических продуктов первой фазы биотрансформации ПА.

Кроме того, показано, что применение "Метавита" согласно данных содержания супероксиданионов и гидроперекисей в митохондриях, а также интенсивности индуцированного образования МДА в постмитохондриальной фракции предупреждало активацию свободнорадикального окисления в печени крыс, а также способствовало повышению в среднем на 30 % активности каталазы и глутатионредуктазы – в печени по сравнению с контролем.

Проведенные исследования выявили способность композиции "Метавит" предупреждать нарушение активности ферментов дыхательной цепи митохондрий печени при всех модельных факторах токсического действия ПА. По результатам исследования активности АлАТ и АсАТ, а также величины массового коэфициента печени композиция проявила высокие гепатопротекторные свойства, которые подтверждены данными морфологических исследований.

Кроме того, показано, что "Метавит" проявил способность в значительной степени снижать острую токсичность ПА. При внутрижелудочном введении анальгетика на уровне летальных доз самостоятельно, последовательно в комбинации с этанолом или на фоне алкоголизма мышей защитный индекс "Метавита", введеного одновременно с ПА, составил соответственно 3,05, 2,83 и 2,0.

На моделях химической и термической ноцицептивной стимуляции показано, что композиция "Метавит", введенная совместно с ПА, не оказала отрицательного влияния на его анальгезирующую активность.

Таким образом, на примере композиции "Метавит" продемонстрировано, что наличие полифункциональных свойств – способность ингибировать процессы генерации высокотоксичных метаболитов, в том числе свободнорадикальной природы, активировать механизмы их элиминации – позволяет целенаправленно влиять на биотрансформацию ПА с целью снижения его токсичности, не оказывая отрицательного влияния на фармакологическую эфективность ПА.

Результаты проведенных исследований позволили определить основные звенья комбинированной фармакологической коррекции биотрансформации ПА, обуславливающей его гепатотоксическое действие.

Ключевые слова: парацетамол, "Метавит", Метионин, гепатотоксичность, печень, цитохром Р-450 2Е1, глутатион, анилин-п-гидроксилаза, микросомы, митохондрии, свободнорадикальное окисление, витамины.

Voronina A. K. Experimental evidence for acetaminophen toxicity attenuation via modulation of its metabolism in liver. - Manuscript.

This dissertation is designed for obtaining a scientific degree: “Candidate of Biological Sciences”. Speciality – Toxicology (14.03.06). Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, 2001.

This dissertation was designed to obtain evidences for acetaminophen toxicity attenuation via modulation of its biotransformation. The ability of the “Metavit” composition being superior to methionine alone, containing methionine, some vitamins and Zn microelement, co-administered to both rats and mice intraventricularly with analgesic in toxic doses, combination of the latter with ethanol and under alcoholism to decrease acetaminophen general acute toxicity and analgesic hepatotoxicity by correcting acetaminophen metabolism in liver was shown.

Analgesic toxicity was attenuated due to decrease in cytochrome P-450 2E1-dependent acetaminophen reactive species formation, increased conjugation with glutathione, and decrease in lipid peroxidation rates as well as normalization in mitochondrial respiration.

Key words: acetaminophen, “Metavit”, hepatotoxicity, cytochrome Р-450 2E1, glutathione, methionine, microsomes, aniline-p-hydroxylase, mitochondria, free radical oxidation, vitamins.