НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

ЗЛАЦЬКА Анастасія Вікторівна

УДК 633.11:631.523:575

Значення специфічності генетичного матеріалу для успішної інтрогресії у геном м`якої пшениці (на прикладі інтрогресивних ліній Triticum L./T.

03.00.15. – генетика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділенні агроекобіотехнології Інституту агроекології та біотехнології УААН, м.Київ

Науковий керівник: доктор с.-г. наук, професор, академік НАН України та УААН СОЗІНОВ Олексій Олексійович

Інститут агроекології та біотехнології УААН, зав. відділенням агроекобіотехнології.

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук ПАРІЙ Федір Микитич, Інститут цукрових буряків УААН, провідний науковий співробітник лабораторії селекції цукрових буряків.

Кандидат біологічних наук КОЛЮЧА Галина Семенівна, Миронівський інститут пшениці УААН, зав. лабораторією генетики пшениці.

Провідна установа:

Інститут рослинництва імені В.Я. Юр`єва УААН, м. Харків

Захист відбудеться "22"травня 2001 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 в Інституті клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ 143, вул. Акад. Заболотного, 148

Автореферат розісланий "20"квітня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої Ради,

кандидат біологічних наук _________________ НАУМЕНКО В.Д.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність. М`яка пшениця – одна з найважливіших сільскогосподарських культур людства. Головною проблемою сучасної світової селекції цієї культури є недостатня різноманітність її природного генофонду. Збіднення генофонду м`якої пшениці пояснюють специфікою сучасних селекційних програм, які сприяють поширенню однотипних сортів з родоводами, що перекриваються (Жиров, 1989), і глобальною зміною клімату (Farshadfar et al., 1995). Одним із шляхів вирішення цієї проблеми є розширення генофонду м`якої пшениці за рахунок притоку нових генів від споріднених до неї диких видів, генотипи яких є цінним джерелом генів господарсько-важливих ознак (Feldman, Sears, 1981). Розвиток сучасних методів цитогенетики досягнув такого рівня, який дає змогу проводити планомірне перенесення чужинного генетичного матеріалу в геном м`якої пшениці в обсязі цілої хромосоми, її ділянки або певного гена (Sears, 1981; Gale, Miller, 1987). Багато сучасних сортів м`якої пшениці захищені генами стійкості до грибних хвороб та ентомошкідників, які було передано в геном м`якої пшениці від споріднених до неї родів Aegilops, Agropyron, Secale, Haynaldia (McIntosh et al., 1998).

Потреба в проведенні робіт з інтрогресивної гібридизації відчувається у всьому світі. Загальним для усіх експериментів, що пов`язані із включенням в геном м`якої пшениці чужинних генів, є елемент випадковості як у виборі донора гена, так і в тій частині роботи, яка пов`язана з пошуком серед носіїв інтрогресивного матеріалу рослин, що містять потрібний ген (гени). Назріла необхідність розпочати роботи з вивчення можливих зв`язків між успіхом інтрогресивної гібридизації (потрібний ген включився в геном м`якої пшениці і стабільно передається нащадкам) і специфічністю (належність до певної гомеологічної групи та певного геному) чужинного генетичного матеріалу, яка, можливо, і зумовлює в першу чергу шанс гена на таке включення. Отримана інформація може бути корисною при прогнозуванні успіху переносу генів з відомою хромосомною локалізацією від споріднених злаків у м`яку пшеницю.

Як модельний об`єкт дослідження було обрано інтрогресивні лінії T./T.. T. (AbAbGGDD) – штучний гексаплоїдний вид групи timopheevii, який було створено Є.Г. Жировим (1980) в процесі розробки ним шляхів і методів залучення генетичної різноманітності споріднених видів у селекцію м`якої пшениці як амфідиплоїд T. (голозерний мутант T.) i Aegilops tauschii (донор субгеному D м`якої пшениці). Ця пшениця вважається аналогом T. в групі timopheevii і її створення розглядали як спробу змоделювати можливі еволюційні процеси в роді Triticum. Вивчення цієї пшениці і інтрогресивних ліній з її генетичним матеріалом може дати нову інформацію щодо ступеня спорідненості субгеномів м`якої пшениці і близьких до неї видів T. і Aegilops tauschii, дозволить встановити генетичний контроль значної кількості ознак представника групи timopheevii та виявити залежність між специфічністю генетичного матеріалу вида-донора (T.) та вида-реципієнта (T.) і успішністю інтрогресивної гібридизації.

T., як і усі представники групи timopheevii (Якубцинер, 1934; Жуковский, Мигушова, 1969; McIntosh, Gyarfas, 1971; Жуковский, 1971), характеризується резистентністю до ряду грибних хвороб і підвищеним вмістом білка в зерні. Гібриди F1 T. miguschovae з сортами м`якої пшениці були повністю стійкими до збудників борошнистої роси і бурої іржі (Жиров, 1989). Інтрогресивні лінії м`якої пшениці з генетичним матеріалом T. було використано для створення двох нових, стійких до патогенів, сортів м`якої пшениці Фішт і Жировка (Давоян и др., 2000). Однак генотип T. залишається ще дуже мало вивченим. Не вивчено потенційну цінність цього виду як джерела корисних генів, що можуть бути включені до генофонду м`якої пшениці, не досліджено генетичний контроль цих корисних ознак, а також ознак, які можна було б використати як маркери певних господарсько-важливих ознак при вивченні популяцій, що розщеплюються. Результати дослідження дають змогу прогнозувати цінність конкретних інтрогресивних ліній як донорів корисних генів в селекції м`якої пшениці. В зв`язку з цим дослідження набору інтрогресивних ліній, в родоводі яких є T., становить як теоретичний, так і практичний інтерес.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводили за програмою Інституту агроекології та біотехнології "Теоретично обгрунтувати і застосувати на практиці засоби та методи генетики і біотехнології для цілей спрямованого формування генетичної компоненти сталих агроекосистем" (номер держреєстрації 0196UO12975).

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження було виявити можливий зв`язок між геномною і гомеологічною належністю чужинного хроматину та успіхом його включення в геном м`якої пшениці на основі вивчення інтрогресивних гексаплоїдних ліній T./T. і оцінити перспективи їх використання в селекції м`якої пшениці як донора генів корисних ознак. Для досягнення мети було поставлено і вирішено такі завдання:

1) Виконати порівняльне вивчення електрофоретичних спектрів запасних білків та деяких ферментів сортів м`якої пшениці та пшениці Мігушової і ідентифікувати білок-кодуючі гени, що можуть бути використані як генетичні маркери певних хромосом цієї пшениці.

2) Класифікувати інтрогресивні лінії T./T. за ознакою включення в їх геноми чужинного генетичного матеріалу хромосом Ab, G і D геномів, користуючись ідентифікованими генами-маркерами хромосом T..

3) За результатами класифікації інтрогресивних ліній стосовно хромосомної належності чужинного генетичного матеріалу і фенотипічної оцінки ліній за морфобіологічними ознаками встановити хромосомну локалізацію генів, що контролюють ряд морфологічних і фізіологічних ознак пшениці.

4) Виконати генетичний аналіз субгеному D гексаплоїдної пшениці за ознакою вміст білка в зерні і встановити характер успадкування цієї ознаки у високобілкових інтрогресивних ліній.

5) За допомогою фенотипічної оцінки виявити серед ліній носіїв господарсько-цінних ознак і дати характеристику їх цитологічної стабільності.

Об`єкт дослідження. Пшениця.

Предмет дослідження. Залежність успіху інтрогресії чужинного генетичного матеріалу в геном м`якої пшениці від його геномної і гомеологічної належності.

Методи дослідження. Морфологічні методи оцінки (для вивчення морфологічних ознак і ознаки "стійкість до борошнистої роси"). Для визначення вмісту білка в зерні користувалися модифікацією біуретового методу. Вивчення поліморфізму запасних білків і ферментів з метою ідентифікації біохімічних маркерів проводили із застосуванням електрофоретичних методів розділення білків в ПААГ. Виявлення анеуплоїдів серед рослин ліній та вивчення конфігурації хромосомних асоціацій в М1 мейозу проводили, використовуючи стандартні для пшениці цитологічні методики. Статистичну обробку результатів здійснювали із застосуванням методів варіаційної статистики. Для вивчення генетичного контролю ознаки вміст білка в зерні користувалися методами біометричної генетики.

Наукова новизна одержаних результатів. 1. Набір гексаплоїдних інтрогресивних ліній пшениці вперше було використано як модельний об`єкт для вивчення залежності успіху інтрогресивної гібридизації від особливостей генетичного матеріалу вида-донора та вида-реципієнта чужинних включень. 2. Ідентифіковано нові гени, що контролюють синтез ферментів, Est-G1, Est-Ab2, Est-G2, Per-Ab3 або Per-G3, -Amy-G1, Per-Ab4; ідентифіковано і локалізовано на хромосомі 4D ген опушення листкової піхви Hs. 3. Вперше вивчено хромосомний контроль ізозимів бета-амілази, альфа-амілази, зернової і листової естераз, зернової пероксидази у представника пшениць групи timopheevii. 4. Ідентифіковано білок-кодуючі гени, що можуть бути використані як маркери відповідних хромосом пшениці Мігушової, для п`яти хромосом субгеному Ab, п`яти хромосом субгеному G і чотирьох хромосом субгеному D. 5. Встановлено хромосомний контроль п`яти морфологічних ознак, ознак дата виколошування, стійкість до борошнистої роси та вміст білка в зерні пшениці Мігушової, за якими вона відрізняється від м`якої пшениці.

Практичне значення отриманих результатів. 1) В масиві вивчених інтрогресивних ліній T./T. виділено цитологічно стабільні гексаплоїдні лінії, стійкі до борошнистої роси, з високим вмістом білка в зерні і середнім строком цвітіння. 2) 29 інтрогресивних ліній з різним поєднанням цих ознак передано для використання в селекції в Селекційно-генетичний інститут (м. Одеса) і в Миронівський інститут пшениці. 3) Адаптовано методики електрофорезу таких ферментів: кисла фосфатаза, шикіматдегідрогеназа, листкова естераза і алкогольдегідрогеназа. 4) Підібрано і адаптовано методику визначення вмісту білка в зерні, придатну для масового аналізу, що дало змогу провести скринінг інтрогресивних ліній за ознакою вміст білка в зерні та вивчити генетичний контроль цієї ознаки як кількісної з використанням великих за обсягом батьківських та гібридних популяцій.

Особистий внесок здобувача. Автор дисертаційної роботи виконав особисто усі практичні дослідження і аналіз більшості експериментальних даних. В розробці концепції роботи брали участь також співавтори публікацій.

Автор висловлює особливу подяку док. біол. наук Т.К. Терновській за надання рослинного матеріалу, що був використаний у дослідженнях, а також за допомогу у плануванні експериментів та обговоренні їх результатів.

Апробація. Результати дослідження доповідалися на міжнародній науково-практичній конференції "Шляхи раціонального використання земельних ресурсів України" (Чабани, 1995), на міжнародному симпозіумі "Методические основы формирования, ведения и использования коллекций генетических ресурсов растений" (Харків, 1996), на "Международной конференции по генетическим и молекулярно-генетическим маркерам растений и животных" (Ялта, 1996), на міжнародній конференції "Агробиотехнологии растений и животных" (Київ, 1997), на науково-практичній конференції молодих вчених "Інтегративність функцій рослинного організму" (Київ, 1998), на міжнародній конференції "Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва (Харків, 1999) та на EU/Balkan Cereal Biоtechnology Workshop "Tagging and Transforming Cereals to Improve Adaptation and Quality" (Софія, 1999).

Публікації. Результати роботи опубліковано в шести наукових статтях і шести тезах доповідей.

Структура і обсяг роботи. Дисертаційна робота складається із вступу, 8 розділів, висновків і списку літератури. Текст дисертації викладено на 190 сторінках машинопису, має 28 таблиць, 23 рисунки. Список використаних літературних джерел містить 304 назв, з них 188 іноземні.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Матеріали досліджень. Досліджували сорти м`якої пшениці Triticum aestivum (2n=42, AuAuBBDD) Кавказ, Безоста 1, Кальянсона, Альбiдум 114, Аврора, Чайніз Спрінг; синтетичний вид T. Zhirov (2n=42, AbAbGGDD, де субгеном AbAbGG походить вiд T. militinae Zhuk.et Migusch. (2n=28, AbAbGG), а субгеном DD – вiд Aegilops tauschii Coss.subsp. strangulata (Eig) Tzvel. (2n=14)) (Жиров, 1980); 171 лiнiя м`якої пшеницi, які одержано від схрещування T. з сортами Кавказ i Безоста 1 з наступним використанням цих сортів як рекурентних батьків при виконанні беккросів (Жиров, 1989). В нашій роботі ми називаємо їх інтрогресивними лініями, оскільки кожна з них характеризувалася чужинною градацією хоча б за однією з ознак, що нами було вивчено; гібриди F1 від схрещування інтрогресивних ліній T. aestivum/T. з рекурентним сортом Кавказ; нулі-тетрасомні лінії сорту Чайніз Спрінг за хромосомами 2, 3, 4, 6, 7 гомеологічних груп. В кожній такій лінії відсутня певна пара хромосом (нулі-), а її гомеолог з іншого геному представлений двома парами хромосом (тетра). Нулі-тетрасомні лінії створено Е. Сірсом (1966) та передано доктором Б. Гіллом академіку О.О. Созінову; геномно-заміщена форма Авродес (AuAuBBSS), у якої перші два геноми AuAuBB являють собою тетраплоїдний компонент м`якої пшениці сорту Аврора, а її субгеном DD заміщено геномом диплоїдного виду Aegilops speltoides (SS) (Жиров, Терновская, 1984); геномно-доданi форми D346, DAл, DKв, DKc, що мають субгеном AuAuBB вiд лiнiї озимої твердої пшеницi T.durum Desf.var. muticitalicum Dorof. et A. Filat.( МI), а субгеном DD вiд Ae.tauschii Coss. (K-346), сортiв Альбiдум 114, Кавказ, Кальянсона вiдповiдно (Жиров, Терновская, 1987); батьківські та гібридні популяції F1, F2, BC1P1, BC1P2 від схрещування Альбідум 114 х DAл , DAл х Альбідум 114, DKc х DAл, DKв х DKc , DAл х DKв; Triticum boeoticum Boiss. (AbAb).

Методи дослідження. 1) Стійкість до борошнистої роси батьківських форм, інтрогресивних ліній та гібридів F1 від схрещування інтрогресивних ліній з рекурентним сортом Кавказ оцінювали в польових умовах у 1998 і 1999 роках на 3-х стадіях розвитку рослин: стадія виходу в трубку, стадія виколошування та стадія молочної стиглості. Стадії оцінки та градації ознаки було обрано, спираючись на пропозиції Е.Ф. Мигушової, А.М. Ямалєєва (1975). У 1999 році, в зв`язку з посухою, оцінку на стадії молочної стиглості не проводили, бо рослини на цій стадії розвитку мали сухе листя, що ускладнило проведенню оцінки. Було використано такі градації: 0 – рослина стійка, 1 – незначне уражене листя прикореневої зони, 2 – сильне ураження листя прикореневої зони та незначне ураження листя середнього ярусу, 3 – сильне ураження листя прикореневої зони та середнього ярусу, 4 – сильне ураження усього листя рослини, 5 – сильне ураження усієї рослини, в тому числі і колосу.

2) Вміст білка в зерні визначали за методом В.І. Січкаря і інших (1973), що є модифікацією біуретового методу. Для вивчення генетичного контролю ознаки вміст білка в зерні у геномно-доданих форм користувалися методами біометричної генетики (Mather, Jinks, 1971).

3) Електрофорез гліадинів проводили в ПААГ за методикою В. Бжезинського (1989) в модифікації М. Антонюка (1995), глютенінів – у SDS-ПААГ (Laemmli, 1970), ферментів (альфа-амілаза, бета-амілаза, зернова пероксидаза, шикіматдегідрогеназа, листова і зернова естерази, кисла фосфатаза, алкогольдегідрогеназа) – у ПААГ в нативній Tris-гліциновій системі (Davis, 1964) без стартового гелю. Для візуалізації ферментів в гелях використовували розчини: розчин Люголю (альфа- і бета-амілази) (Антонюк, Терновская, 1995), розчин гваяколу (зернова пероксидаза) (Антонюк, 1995), розчин -нафтилацетату та солі fast blue RR (зернова та листкова естерази) (Антонюк, 1995), розчини для гістохімічного виявлення шикіматдегідрогенази (Koebner, Shepherd, 1983), алкогольдегідрогенази та кислої фосфатази (Левитес, 1986).

4) Для вивчення конфігурації хромосомних асоціацій в М1 мейозу у рослин інтрогресивних ліній та їх гібридів F1 з рекурентним сортом Кавказ та між собою пиляки фіксували та забарвлювали у 1% розчині ацетокармiну (Паушева, 1988). Для виявлення анеуплоїдів серед рослин інтрогресивних ліній визначали кількість хромосом в корінцях проростків, використовуючи стандартну для пшениці цитологічну методику (Waninge, 1965).

5) Усі досліджувані нами лінії було оцінено за морфологічними ознаками, що відрізняли T.від сортів м`якої озимої пшениці Кавказ і Безоста 1: колір стиглої колоскової луски, опушення колоскової луски, опушення киля колоскової луски, забарвлення соломини під колосом, форма колосу, остистість, форма плеча колоскової луски, жорсткість колоскової луски, вдавленість основи колоскової луски, опушення вузла соломини, опушення листка, розподіл пігменту на колосковій лусці, опушення колосового стрижня. Для встановлення зв`язків між цими морфологічними ознаками і біохімічними та морфологічними маркерами відповідних хромосом T. користувалися критерієм Пірсона для порівняння двох емпіричних розподілів (Лакин, 1980): порівнювали частоти градацій досліджуваних ознак в загальній популяції інтрогресивних ліній і серед ліній, об`єднаних певним біохімічним або морфологічним маркером. За отриманими результатами цього аналізу робили припущення відносно хромосомного контролю морфологічних ознак, характерних для T. і видів-донорів її субгеномів.

РЕЗУЛЬТАТИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Розділ 3. Характеристика інтрогресивних ліній T. за господарсько-важливими ознаками і цитологічною стабільністю

Стійкість до борошнистої роси. За ознакою стійкості до борошнистої роси було вивчено T., сорти Кавказ і Безоста 1 та 171 інтрогресивну лінію. T. в усі роки і на усіх стадіях оцінки відзначалася високою стійкістю до борошнистої роси, натомість сорти Кавказ і Безоста 1 значно уражувалися цим збудником. За період проведення дослідження 64 лінії з 171 проявили різну ступінь стійкості до борошнистої роси. За реакцією стійкості до цього патогену було сформовано 6 груп стійких ліній (табл. ). Вивчення цих ліній, а також їх гібридів F1 з сортом Кавказ, дозволило зробити висновок, що стійкість ліній зумовлена як домінантними, так і рецесивними генами стійкості різної ефективності.

Таблиця 1. Результати вивчення T.сортів пшениці Кавказ і Безоста та інтрогресивних ліній T. за ознакою "стійкість до борошнистої роси"

Група | К-ть | Стійкість до борошнистої роси

ліній | 1998р | 1999р | Гібриди F1, 1999*

Т** | В | М | Т | В | Т | В

T.miguschovae | 0 | 0 | 0 | 0 | 0

T.aestivum, сорт Кавказ | 1,2 | 3 | 4,5 | 2 | 4

T.aestivum, сорт Безоста 1 | 2 | 3 | 4,5 | 2 | 4

1 | 1 | 0*** | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 1

1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0

2 | а | 3 | 0 | 0 | 2,4 | 0,1 | 0,1 | 0 | 0,1

б | 9 | 0 | 0,1 | 2,3,4 | 0,1 | 0,1 | 2 | 4

в | 2 | 0 | 1 | 0,3 | 0 | 1— | —

3 | а | 6 | 1,2 | 1,2 | 3,4 | 1,2 | 1,2 | 1,2 | 2

б | 5 | 1,2 | 1,2,3 | 3,4 | 1,2 | 1,2 | 2 | 4

в | 3 | 1,2 | 1,2 | 3,4 | 1,2 | 1,2——

4 | а | 9 | 2 | 3,4 | 4,5 | 0,1 | 0,1,2 | 0,1 | 1,2

б | 15 | 2 | 3,4 | 4,5 | 0,1 | 0,1,2 | 2 | 3,4

в | 1 | 2 | 3 | 3,4 | 1,2 | 0,1——

5 | 3 | 0,1 | 0,1 | 0,1,2 | 2 | 3,4 | 2 | 3,4

6 | 6——— | 0,1 | 0,1——

* – F1 між інтрогресивними лініями і сортом Кавказ. ** – стадії розвитку рослин, на яких було виконано оцінку: Т – вихід в трубку; В – виколошування; М – молочна стиглість, *** – градації ознаки стійкості згідно з Е.Ф. Мігушовою і А.М. Ямалєєвим (1975).

Вміст білка в зерні. Вміст білка в зерні оцінювали у T., сортів Кавказ і Безоста та 171 лінії. За результатами оцінки рослинний матеріал утворив 9 груп (рис. ).

Рис. . Результати оцінки інтрогресивних ліній і вихідних форм за ознакою вміст білка в зерні.

Було виявлено 51 лінію, які мали підвищений вміст білка в зерні в порівнянні з рекурентними сортами пшениці, причому 10 з них не відрізнялися за цією ознакою від високобілкової T. (рис. 1).

Оцінка форми зерна у високобілкових ліній показала, що підвищений вміст білка в зерні не пов`язаний з такими негативними ознаками, як видовжена форма зернівки та її щуплість.

За результатами проведеної оцінки стійкості до борошнистої роси і вмісту білка в зерні було виявлено 27 ліній, що об`єднували обидві корисні ознаки.

Цитологічний аналіз інтрогресивних ліній T.Наявність у інтрогресивних ліній господарсько-важливих ознак ще не свідчить про перспективність їх залучення до селекційного процесу. Важливою характеристикою лінії є її цитологічна стабільність. За міру цитологічної стабільності ми обрали кросинговерний потенціал, бо він є мірою повноти коньюгації хромосом (Sybenga, 1965). За цитологічною стабільністю було досліджено 64 лінії, що відзначилися як носії певних господарсько-важливих ознак. В М1 мейозу цих ліній було вивчено конфігурацію хромосомних асоціацій і обраховано кросинговерний потенціал. За цим показником досліджені лінії було розділено на 8 груп (рис. ). Значення кросинговерного потенціалу у сортів Кавказ і Безоста 1 подібні і коливаються в межах 2.27-3.68 (в середньому 2.83). У 92% вивчених нами інтрогресивних ліній значення кросинговерного потенціалу лежить саме в цих межах, тобто за цитологічною стабільністю більшість ліній не відрізняється від рекурентних сортів.

Рис. . Результати групування інтрогресивних ліній за значенням кросинговерного потенціалу.

Наявність у ліній певних господарсько-важливих ознак свідчить, що частина генетичного матеріалу Т. включилася в геном ліній м`якої пшениці. Необхідно було встановити число і характер інтрогресій.

Для з`ясування характеру інтрогресій тестовані лінії було схрещено з рекурентним сортом Кавказ і у гібридів F1 було вивчено конфігурацію хромосомних асоціацій в М1 мейозу. Як діагностичну, розглядали найвищу асоціацію хромосом. Коли при найвищій асоціації хромосом спостерігали тільки біваленти і мультиваленти, вважали, що інтрогресія чужинного матеріалу в геномі ліній представлена хромосомними сегментами; коли у гібрида спостерігали постійну наявність унівалентів в конфігурації з найвищою асоціацією хромосом, вважали, що інтрогресію у ліній представлено цілими хромосомами, якщо є кілька пар унівалентів. Вивчення мейозу у гібридів F1 39 ліній з сортом Кавказ показало, що інтрогресія чужинного генетичного матеріалу Т. в геномі усіх ліній, що було вивчено, представлена транслокаціями (табл. ).

Таблиця 2. Результати вивчення конфігурації хромосомних асоціацій в М1 мейозу у гібридів F1, отриманих від схрещування інтрогресивних ліній з рекурентним сортом Кавказ

Група гібридів | К-ть гібридів групи | Найвища асоціація* | Група гібридів | К-ть гібридів групи | Найвища асоціація*

1 | 19 | 21 II | 4 | 2 | 18 II+3IIo

2 | 13 | 20 II+1IIo | 5 | 2 | 19 II+1 IV, 16 II+3 IІo+1 IV

3 | 2 | 19 II+2IIo6 | 1 | 15 II+5 IІo+2 I

* – Конфігурація хромосом при найвищій їх асоціації в М1 мейозу.

Оцінка цитологічної стабільності ліній необхідна для прогнозування розщеплень в F1 в разі залучення цих ліній до генетичного аналізу.

Розділ 4. Ідентифікація біохімічних маркерів хромосом Triticum miguschovae та їх використання для вивчення інтрогресивних ліній

Для встановлення того, які хромосоми пшениці Мігушової передали генетичний матеріал в геном інтрогресивних ліній, було залучено біохімічні маркери хромосом цієї пшениці. Біохімічні маркери – це продукти експресії білок-кодуючих генів (запасних білків і ферментів). Протягом кількох десятиліть біохімічні маркери успішно використовуються для ідентифікації чужинного генетичного матеріалу представників родів Аegilops, Agropyron, Sеcale, включеного в геном м`якої пшениці (Попереля, Созинов, 1977; Kobrehel, 1978; Koebner, Shepherd, 1986; Koebner et al., 1986; McMillin et al., 1986; Forster et al., 1987; Mujeeb-Kazi, Asiedu, 1990; Schrader, Schmidt, 1992). Придатність деяких біохімічних маркерів для ідентифікації чужинних хромосом в геномі м`якої пшениці було показано і для представників ряду timopheevii (T. timopheevii і Т.) (Калинина и др., 1981; Калинина и др., 1984; Калинина и др., 1987; Gill et al., 1988; Степаненко и др., 1994; Brown-Guedira et al., 1996).

Ідентифікація біохімічних маркерів T.. Для ідентифікації біохімічних маркерів хромосом T. було вивчено електрофоретичні спектри запасних білків (гліадинів та глютенінів) і ряду ферментів цієї пшениці, видів-донорів її субгеномів, сортів Кавказ, Безоста 1 та Аврора. Висновки про маркерну цінність того чи іншого компоненту електрофоретичного спектра робили в результаті порівняння спектрів певного білка T. і сортів Кавказ та Безоста 1. Компонент спектра T.вважали маркерним в тому разі, коли він не перекривався компонентами спектра рекурентних сортів. Припущення стосовно хромосомного контролю маркерних компонентів робили, спираючись на явище гомеології хромосом в підтрибі Triticinae.

Таким чином було ідентифіковано маркерні компоненти хромосом 1Ab (Gli-Ab1), 1G (Gli-G1), 1D (Gli-D1), 6Ab (Gli-Ab2), 6G (Gli-G2), 6D (Gli-D2) в спектрі гліадинів, хромосоми 1G (Glu-G1) в спектрі глютенінів, хромосом 4G (в-Amy-G1) і 4D (в-Amy-D1) в спектрі в-амілази, хромосоми 5G (Shdh-G1) в спектрі шикіматдегідрогенази, хромосоми 4G (Acph-G1) спектра кислої фосфатази, хромосом 3D (Est-D2) і 3Ab або 3G (Est-2), 6D (Est-D4) спектра листової естерази, хромосом 3D (Est-D1) і 3Ab або 3G (Est-1) cпектра зернової естерази, хромосом 7Ab (Per-A4) і 3Ab або 3G (Per-3) спектра зернової пероксидази, хромосоми 4D (Adh-D1) спектра алкогольдегідрогенази. Хромосомний контроль маркерного компоненту 8 спектра б-амілази з`ясувати не вдалося. При дослідженні інтрогресивних ліній можна було також звертати увагу на відсутність в деяких спектрах певних компонентів, характерних для рекурентних сортів: компонент 1 спектра в-амілази (хромосома 5A), компонент 2 і 9 спектра б-амілази (хромосоми 6A і 7А), компоненти 18 (6A) і 20 (6B) спектра листової естерази. Відсутність цих компонентів в спектрах інтрогресивних ліній може бути непрямим доказом інтрогресії хромосом 5Аb, 6Ab, 6G і 7Аb T. в геном цих ліній, бо в спектрах даних ферментів у T. відсутні будь-які зони активності, які б контролювалися цими хромосомами. Для хромосом 2-ої гомеологічної групи, а також 4Ab, 5D, 7G i 7D, біохімічних маркерів знайдено не було.

Залучення біохімічних маркерів для вивчення інтрогресивних ліній T.. Ідентифіковані біохімічні маркери було залучено для дослідження 146 інтрогресивних ліній. Було встановлено, що електрофоретичні спектри досліджених нами запасних білків та ферментів 37 ліній не відрізнялися від аналогічних спектрів рекурентних сортів. В спектрах решти ліній було виявлено компоненти-маркери хромосом T..

При вивченні інтрогресивних ліній за електрофоретичним спектром кислої фосфатази не було виявлено жодної лінії зі спектром кислої фосфатази, який би відрізнявся від спектрів цього ферменту рекурентних сортів. При вивченні ліній за електрофоретичними спектрами алкогольдегідрогенази виявилося, що компоненти-маркери хромосоми 4Dm не мають стабільного прояву за однакових умов проведення електрофорезу та гістохімічного забарвлення гелів і тому є малопридатними для дослідження ліній.

В цілому чужинний генетичний матеріал в межах однієї лінії належав 1 _ 4-м хромосомам T.. Обмін генетичним матеріалом проходив між хромосомами одноіменних субгеномів. Найвищу частоту інтрогресії мали хромосоми субгеному D. Слід відзначити, що під назвою інтрогресія ми розуміємо включення чужинного генетичного матеріалу в будь-якому розмірі (ціла хромосома або її ділянка). Серед інтрогресивних ліній найчастіше спостерігали включення генетичного матеріалу хромосом 3-ї гомеологічної групи T..

Розділ 5. Вивчення інтрогресивних ліній Triticum aestivum/Triticum miguschovae за морфологічними ознаками та зв`язок цих ознак з біохімічними маркерами

Характеристика інтрогресивних ліній T. за морфологічними ознаками. Важливою характеристикою інтрогресивної лінії є її морфотип, тому усі досліджені нами лінії було вивчено за комплексом морфологічних ознак та за ознакою дата виколошування, яка також є дуже важливою характеристикою лінії. З 171 лінії 116 виявилися морфологічно стабільними, у 55 спостерігали мінливість за деякими морфологічними ознаками, яким властива слабка експресивність. Дві лінії не відрізнялися від рекурентних сортів за морфологічними ознаками, а 16 ліній були максимально наближені до сортів Кавказ і Безоста 1 за сукупністю ознак морфології, які було вивчено. Переважна більшість ліній характеризувалася градаціями однієї чи декількох ознак морфології, що притаманні T. miguschovae і видам-донорам її субгеномів. Генетичний контроль морфологічних ознак T. ще ніким не вивчався. Для того, щоб можна було використати ці ознаки як маркери певних хромосом T., необхідно було отримати інформацію щодо їх хромосомного контролю.

Встановлення зв`язків морфофізіологічних ознак з біохімічними маркерами хромосом T. Для з`ясування хромосомного контролю оцінених нами ознак морфології та фізіології T. ми встановлювали їх зв`язки з вже ідентифікованими нами біохімічними маркерами відповідних хромосом цієї пшениці. Було використано критерій Пірсона для порівняння двох емпіричних розподілів (табл. 3).

Таблиця 3. Результати встановлення зв`язку морфофізіологічних ознак з біохімічними маркерами хромосом T.

Ознака | Хромосомний контроль | Ознака | Хромосомний контроль

колір стиглої луски | 1D***, 1Ab*** | опуш. листк. піхви | 4D***

чорний колір кол.луски | 1Ab *** | опуш. краю листкової пласт. | ----

кавовий колір кол. луски | 1D** | жорсткість кол. луски | ----

опушення луски | 1Ab***, 1D** | вдавл. основи кол. луски | 1D**, К8*

опушення киля | ---- | забарв. соломини під кол. | К8*

вузьке плече кол.луски | 5Ab *, 1D* | скверхедна форма колосу | ----

плече луски з виїмкою | ---- | спельтоїдна форма колосу | ----

форма плеча | 1D* | форма колосу з низьк. щільн. | 5Ab*

остистість | 5Ab**,7Ab* | форма колосу | ----

опушення вузла | ---- | розподіл пігменту на кол.лусці | 1D***,К8*,5Ab*

густе опушення вузла | 5Ab* | колір опушення кол.членика | 1Ab ***, 1D*

дата виколошування | 5G***, 6D*** | стійкість до борошнистої роси | 3AbG*,3D*,6D**

високобілковість$ | 5Ab**, 4D* | підвищений вміст білка в зерні$ | ----

*** – Р<0.001, ** – Р<0.01, * – Р<0.05, K8 – маркерний компонент спектра альфа-амілази T., ---- – зв`язку з біохімічними маркерами встановлено не було, $ – ознака "високобілковість" вивчалася на вибірці ліній, що за вмістом білка в зерні не відрізнялися від T. , ознаку "підвищений вміст білка в зерні" було вивчено на лініях, що перевищували за вмістом білка в зерні рекурентні сорти.

Встановлення зв`язків між морфофізіологічними ознаками. При залученні біохімічних маркерів для деяких морфофізіологічних ознак (табл. 3) не було встановлено хромосомну локалізацію генів, що їх контролюють. В зв`язку з цим було проведено роботу з вивчення взаємозв`язків між морфофізіологічними ознаками для з`ясування, за можливістю, хромосомного контролю тих ознак, для яких його не було виявлено при залученні біохімічних маркерів. Необхідно було з`ясувати ще зв`язки між агрономічно-цінними ознаками та ознаками морфології T., а також встановити, чи не пов`язані агрономічно-цінні ознаки, характерні для цієї пшениці, з негативними ознаками, як наприклад, жорстка колоскова луска або спельтоїдний колос. Для встановлення взаємозв`язків між морфофізіологічними ознаками користувалися критерієм Пірсона для порівняння двох емпіричних розподілів. Результати дослідження подано у таблиці 4.

В результаті проведеного аналізу було встановлено зв`язок більшості досліджуваних нами морфофізіологічних ознак з біохімічними та морфологічними маркерами певних хромосом, що дало нам можливість зробити припущення щодо їх хромосомного контролю. Загалом наші висновки стосовно хромосомного контролю більшості досліджених нами ознак морфології та фізіології T. відповідають результатам, отриманим при вивченні інших видів Triticinae (Miller, Reader, 1987; Антонюк, 1995; Pickering et al., 1997; Korzun et al., 1997; McIntosh, 1998; Korzun et al., 1999; Терновская, 1999), що підтверджує явище гомеології хромосом цієї підтриби. Однак було виявлено і відмінності між нашими результатами і результатами інших дослідників: низька щільність колосу знаходиться під контролем хромосоми 5Ab (за нашими результатами), хромосом 6-ої гомеологічної групи видів роду Aegilops (Антонюк, Терновская, 1997) та хромосом 7-ої гомеологічної групи у Triticeae (Miller, Reader, 1987)); розподіл пігменту на колосковій лусці пов`язаний з хромосомами 1D, 5Ab та хромосомою, маркером якої є компонент 8 спектра альфа-амілази T. (результати нашого дослідження) і 2D (Терновська, 1999). Не вдалося з`ясувати хромосомний контроль ознак скверхедна форма колосу та плече колоскової луски з виїмкою. Складними для дослідження виявилися ознаки форма колосу, жорсткість колоскової луски, вдавленість основи колоскової луски, форма плеча колоскової луски, вміст білка в зерні.

Таблиця 4. Результати встановлення зв`язків між деякими ознаками морфології та фізіології інтрогресивних ліній, що характерні для T. та видів-донорів її субгеномів

Ознака | Встановлений звязок з ознаками морфології та фізіології

Опушення киля | Чорний колір колоскової луски (1Ab)*, Опушення колоскової луски (1Ab,1D)**, Вдавленість основи кол. луски (1D, K8)*, Колір опушення кол. стрижня (1Ab,1D)**, Форма колосу (-)*

Опушення краю листк. пластинки | Опушення листкової піхви (4D)*

Жорсткість колоскової луски | Вдавленість основи кол. луски (1D, K8)***, Форма колосу (-)*, Спельтоїдна форма колосу (-)**, Забарвлення соломини (К8)**, Розподіл пігменту на кол. лусці (5Ab,1D,К8)*

Форма колосу | Колір колоскової луски (1Ab,1D)**, Опушення колоскової луски (1Ab,1D)*, Опушення киля (-)*, Жорсткість колоскової луски (-)*, Колір опушення колосового стрижня (1Ab,1D)*

Скверхедна форма колосу | Забарвлення колоскової луски (1Ab,1D)*

Спельтоїдна форма колосу | Жорсткість кол. луски (-)**, Вдавленість основи кол. луски (1D,K8)***, Кавовий колір кол. луски (1D)*, Вузьке плече кол. луски (5Ab,1D)**, Розподіл пігменту на кол. лусці (5Ab,1D,К8)*

Стійкість до борошнистої роси | Підвищений вміст білка в зерні (-)*, Дата виколошування (5G, 6D)**

Дата виколошування | Стійкість до борошнистої роси (3AbG,3D,6D)**, Густе опушення вузла (5Ab)*

Підвищений вміст білка в зерні$ | Стійкість до борошнистої роси (3AbG,3D,6D)*

Високобілковість$—

*** – Р<0.001, ** – Р<0.01, * – Р<0.05, K8 – маркерний компонент спектра альфа-амілази T., ---- – зв`язку встановлено не було, $ – ознака "високобілковість" вивчалася на вибірці ліній, що за вмістом білка в зерні не відрізнялися від T., ознаку "підвищений вміст білка в зерні" було вивчено на лініях, що перевищували за вмістом білка в зерні рекурентні сорти.

Найбільш придатними для використання в якості морфологічних маркерів певних хромосом T. виявилися ознаки чорний колір стиглої колоскової луски (хромосома 1Ab, ген Bg1), кавовий колір стиглої колоскової луски (1D, Rg2), опушення колоскової луски (1Ab, Hg та 1D, Hg1), опушення вузла соломини (5Ab, Hn), опушення листкової піхви (4D, Hs). В цілому, морфологічні маркери доцільно використовувати для ідентифікації належності чужинного генетичного матеріалу до певної гомеологічної групи хромосом і небажано – для з`ясування його належності до певного субгеному.

Важливо відзначити, що не було виявлено зв`язків між дослідженими нами господарсько-важливими ознаками і ознаками, негативними для селекції. Це свідчить про те, що між генами, які контролюють їх прояв немає зчеплення. Це дає підстави розраховувати на те, що можна створити такі лінії м`якої пшениці, які б несли гени високої стійкості до борошнистої роси і високого вмісту білка в зерні і при цьому не мали негативних для селекційного процесу ознак.

Розділ 6. Генетичний контроль ознаки вміст білка в зерні

Для прогнозування можливості використання інтрогресивних ліній з підвищеним вмістом білка в зерні в селекції для покращення цього показника у м`якої пшениці необхідно мати інформацію стосовно генетичного контролю цієї ознаки. Ознака вміст білка в зерні є кількісною, і на її прояв, як і на прояв усіх кількісних ознак, значно впливають умови навколишнього середовища (Clark, 1926; Williams, 1966; Levy et al., 1985; Shah et al, 1989). Вважають, що негативна кореляція між цією ознакою і компонентами структури урожаю є причиною того, що внаслідок інтенсивної селекції м`яка пшениця втратила генетичну різноманітність за цією ознакою (Johnson et al., 1973; Johnson, Mattern, 1977; Bhatia et al., 1984; Nevo et al., 1986; Жиров, 1989; Joppa, Cantrell, 1990). Стосовно генетичного контролю вмісту білка в зерні у м`якої пшениці різними авторами отримані зовсім різні результати. Генетичний аналіз м`якої пшениці за кількісними ознаками ускладнений гексаплоїдною структурою її геному, і тому, щоб максимально зменшити генетичну різницю між компонентами схрещування при гібридологічному аналізі успадкування вмісту білка в зерні пшениці ми використовували геномно-додані форми пшениці, що мали спільні субгеноми ААВВ (МІ) і різні субгеноми D (від сортів м`якої пшениці Кавказ, Кальянсона, Альбідум 114), тобто компоненти схрещування відрізнялися один від одного на диплоїдному рівні.

При досліджені геномно-доданих форм за ознакою вміст білка в зерні нами було виявлено три типи взаємодії між субгеномами гексаплоїдної пшениці: в групі МІ, Кавказ, Dкв форма Dкв містить стільки ж білка, як і лінія МІ, але набагато більше, ніж сорт Кавказ. Можливо, що геном ААВВ сорту Кавказ є супресором гена (генів) субгеному D, який збільшує вміст білка в зерні. В групі МІ, Альбідум 114, Dал форма Dал відзначалася меншим вмістом білка в зерні, ніж сорт Альбідум 114 та лінія МІ. В цьому випадку субгеном D містить супресор генів геномів ААВВ, які відповідні за кількісний вираз ознаки. В групі МІ, Кальянсона, Dкс міжгеномної взаємодії в контролі ознаки не спостерігали. (Рис. 3).

Рис. 3. Вміст білка в зерні у геномно-доданих форм та донорів їх субгеномів

Для отримання більш детальної інформації дослідження було проведено серію схрещувань між геномно-доданими формами. Форму Dал було схрещено з сортом Альбідум 114 як в прямому, так і в зворотньому напрямку. Було отримано 6 гібридних популяцій (P1, P2, F1, F2, BC1ж, BC1ч) від п`яти комбінацій схрещування. Диплоїдний рівень розщеплення, який був забезпечений генетичним складом компонентів схрещування, дозволив використати для аналізу об`єднаний тест Каваллі. В жодній з 5-ти комбінацій схрещування адитивно-домінантна модель не виявилася адекватною для опису генотипічної різниці між батьківськими формами. Було перевірено гіпотезу про взаємодію двох не зчеплених генів, яка і виявилася адекватною в усіх 5-ти комбінаціях схрещування. В 4-х з 5-ти комбінаціях схрещування значущими виявилися великий за абсолютною величиною і негативний за знаком параметр [h] та позитивний за знаком параметр [l]. Це свідчить про участь