академія медичних наук україни

Інститут ГЕМАтології та трансфузіОЛОГІЇ

АМН України

Звір Галина Іванівна

УДК 616-006.441-085

ВПЛИВ ПЛАЗМАФОТОФЕРЕЗУ НА

ІМУНОЛОГІЧНІ ТА КЛІНІКО-БІОХІМІЧНІ ПОКАЗНИКИ У

ХВОРИХ НА Т-КЛІТИННІ ЛІМФОМИ ШКІРИ

14.01.31 - гематологія та трансфузіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата

біологічних наук

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті патології крові та трансфузійної медицини АМН України

Науковий керівник - доктор медичних наук

Новак Василь Леонідович,

завідувач відділення екстракорпоральної гематології,

директор Інституту патології крові та трансфузійної

медицини АМН України

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук,

Мінченко Жанна Миколаївна,

завідувач лабораторії імуногенетики Інституту

клінічної радіології Наукового центру

радіаційної медицини АМН України

- доктор біологічних наук, професор,

Гамалія Микола Федорович,

завідувач відділу клітинної фотобіології та фотомодуляції

росту пухлин Інституту експериментальної патології,

онкології та радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України

Провідна установа - Київська медична академія післядипломної освіти імені

П.Л.Шупика МОЗ України, кафедра гематології та трансфузіології

Захист відбудеться 6 ” лютого 2002 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .612.01 в Інституті гематології та трансфузіології АМН України (04060, м.Київ, вул. М.Берлинського, 12).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту гематології та трансфузіології АМН України (04060, м.Київ, вул. М.Берлинського, 12).

Автореферат розісланий 4 ” січня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Комісаренко В.Г

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Роль імунної системи у патогенезі злоякісних лімфом - одна з найважливіших проблем онкології та гематології. Проте попри чисельні дослідження фенотипу клітин при Т-клітинній лімфомі шкіри, проведені з допомогою імунологічних та імуноцитохімічних методів, отримані дані є суперечливими і не дають чіткого уявлення про гомеостаз хворих при даному захворюванні залежно від важкості та перебігу захворювання, що утруднює прогнозування на основі диференційної діагностики (Бутенко А.К., 2000).

В останні роки все ширшого застосування набувають еферентні методи детоксикації та обробки крові. Серед робіт, присвячених вивченню лікувальної дії ультрафіолетового опромінення, все ще мало досліджень щодо первинних змін крові внаслідок її опромінення. Залишаються невирішеними також такі питання, важливі для розуміння “пускових” механізмів, як зміна кількісних співвідношень клітин УФ-опроміненої крові, характер і ступінь їх морфологічних і функціональних змін, залежність лікувального ефекту від дози УФ, ступінь чутливості клітин і плазми крові до ультрафіолетового опромінення (Ганелина И.Е., Самойлова А.К., 1986; Malane M.S., Gasparro F.P., 1991).

В Інституті патології крові та трансфузійної медицини АМНУ вперше в СНД застосовано метод фотоферезу, який довів свою ефективність у лікуванні гемобластозів, зокрема Т-клітинних лімфом шкіри (ТКЛШ) (Новак В.Л. и соавт., 2001). Суть фотоферезу полягає в тому, що після прийому препарату 8-метоксипсоралену (8-МОП) молекула його проникає в клітинне ядро і проходить між спареними ланцюгами ДНК. Після поглинання одного фотону ультрафіолету А” вона утворює два зв’язки з азотистою основою однієї із ланок ДНК, а після поглинання другого фотону ця ж молекула зв’язує азотисту основу другої ланки ДНК. Утворені зв’язки попереджують реплікацію ДНК (Edelson R., 1991; Malane M.S., Gasparro F.P., 1991).

Для впровадження фотоферезу в практичну медицину визначено умови опромінення ультрафіолетом “А” лейкомаси після прийому 8-МОП. На його основі було розроблено метод плазмафотоферезу (ПФФ). Застосування ПФФ відкрило нові можливості при лікуванні тих хворих, які залишалися резистентними до базової терапії або в яких були протипоказання до її застосування, що робить необхідним вивчення механізмів дії ПФФ та оцінки результатів лікування. Отримані дані свідчать про виражений позитивний вплив плазмафотоферезу на організм хворих з різними стадіями ТКЛШ.

З урахуванням актуальності проблеми проведено вивчення імунологічних, клінічних, біохімічних змін, що дозволить з’ясувати біологічний вплив та ефективність ПФФ при лікуванні ТКЛШ.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Обраний напрямок дослідження безпосередньо пов’язаний з науково-дослідними роботами Інституту патології крові та трансфузійної медицини АМН України “Значення цитокінового профілю у хворих злоякісними лімфопроліферативними захворюваннями для діагностики та прогнозування перебігу процесу з урахуванням імунофенотипічних, цитогенетичних особливостей і епідеміологічних аспектів диференційованого лікування із застосуванням методів еферентної терапії” (шифр 04.97, № держреєстрації: 0197U000988) та “Дослідити особливості перебігу Т-клітинних лімфом шкіри і парапротеїнемічних гемобластозів при патогенетично обгрунтованому лікуванні з використанням еферентних методів.” (шифр 0701 АМНУ; № держреєстрації: 0101U000856).

Мета дослідження. Встановити значення імунологічних та клініко-біохімічних показників у хворих на Т-клітинні лімфоми шкіри для прогнозування перебігу захворювання та оцінки ефективності ПФФ.

Задачі дослідження:

1.

2.

3.

4. У хворих на Т-клітинну лімфому шкіри співставити характер і ступінь змін клінічної картини периферичної крові на різних стадіях захворювання перед плазмафотоферезом та після його застосування для оцінки його ефективності .

Обєкт дослідження: Т-клітинна лімфома шкіри.

Предмет дослідження: біологічні ефекти плазмафотоферезу у хворих на І-ІІІ стадіях ТКЛШ.

Методи дослідження: морфологічні - з метою вивчення загальної картини крові на різних стадіях та під впливом ПФФ; клініко-біохімічні - з метою вивчення змін у метаболічних процесах, функцій печінки та нирок; імунологічні - визначення диференційних антигенів на мембрані лімфоїдних клітин за допомогою моноклональних антитіл (МКАТ), вивчення проліферативної активності лімфоцитів та фагоцитарної активності нейтрофілів периферичної крові, визначення рівня циркулюючих імунних комплексів у сироватці крові.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше з’ясовано діагностичне і прогностичне значення кількісних та якісних змін фенотипу імунокомпетентних клітин, функціональної активності лейкоцитів та клініко-біохімічних показників периферичної крові у хворих на Т-клітинні лімфоми шкіри.

Вперше виявлені відмінності імунофенотипової та функціональної характеристики лімфоцитів периферичної крові хворих на ТКЛШ залежно від важкості захворювання, встановлено залежність cтадії захворювання від ступеня порушень клітинної ланки імунітету та біохімічних зрушень периферичної крові.

Вперше досліджено вплив нового екстракорпорального методу лікування Т-клітинних лімфом шкіри - плазмафотоферезу - на гомеостаз хворих на І-ІІІ стадіях захворювання. Виявлено позитивний біологічний ефект ПФФ на морфологічні, клініко-біохімічні та імунологічні показники периферичної крові хворих на ТКЛШ. Після ПФФ відмічено зниження експресії антигенів CD4, CD5 та зростання експресії CD7, CD8, HLA-DR антигенів, що свідчить про елімінацію пухлинного субстрату та регуляторні зміни у лімфатичній системі; відмічено зростання функціональної активності лімфоцитів та фагоцитарної активності нейтрофільних гранулоцитів, елімінацію циркулюючих імунних комплексів периферичної крові хворих на ТКЛШ. Встановлено, що під впливом ПФФ нормалізуються білковий, азотний, ліпідний, електролітний склад крові та функція печінки.

Вперше проведено порівняльний аналіз досліджуваних показників у хворих на ТКЛШ перед плазмафотоферезом в залежності від стадії захворювання та після його застосування, проаналізовано причини виявлених відмінностей, що дозволяє прогнозування перебігу та оцінку ефективності лікування.

Практичне значення одержаних результатів. Досліджено особливості морфологічних, клініко-біохімічних та імунологічних зрушень периферичної крові у хворих на Т-клітинні лімфоми шкіри залежно від стадії захворювання. Відмічено і проаналізовано позитивні зрушення гомеостазу в результаті застосування плазмафотоферезу. Отримані пошукувачем нові дані щодо зв’язку імунологічних, клініко-біохімічних та морфологічних змін периферичної крові хворих на ТКЛШ зі стадією хвороби можуть бути застосовані в оцінках прогнозу та перебігу захворювання.

На основі співставлення характеру та ступеня змін клінічної картини периферичної крові у хворих на Т-клітинні лімфоми шкіри із стадією захворювання обгрунтована диференційно-діагностична тактика при даній патології. Запропоновано оптимальний комплекс імунологічних досліджень.

Методики досліджень, використані в дисертаційній роботі, застосовуються в Інституті патології крові та трансфузійної медицини АМН України при виконанні НДР для вивчення імунного статусу хворих на ТКЛШ; вони є інформативними і доступними для впровадження в роботу лікувальних закладів.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено аналіз стану та рівня вивченості теми роботи, зібрані дані про обстежених хворих, здійснені вибір і опрацювання методик дослідження, імунофенотипові та функціональні дослідження клітин периферичної крові, статистичний аналіз матеріалу. Виконання біохімічних досліджень здійснено при допомозі Чабан В.Є. Виявлені закономірності сформульовано у висновках.

Апробація результатів дисертації

Матеріали дисертації були оприлюднені та обговорені на 2-ому зїзді онкологів країн СНД з участю вчених Європи, Америки та Азії “Онкологія-2000” (Київ, 2000 р.), на конференції “Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии” (Санкт-Петербург, 2000 г.), на VIII Конгресі світової федерації українських лікарських товариств (СФУЛТ) (Львів, 2000 р.), на ІV з’їзді гематологів та трансфузіологів України (Київ, 2001 р.), на Х з’їзді онкологів України (Крим, 2001), на науково-практичній конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження проф.Склярова Я.П. (Львів, 2001).

Публікації

Результати дисертації опубліковано в 5 статтях у наукових журналах; у 5 тезах з’їздів і конференцій.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 129 сторінках комп’ютерного тексту, з них 108 сторінок тексту, 21 сторінка - список літератури. Робота складається із вступу, 5 розділів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел. Робота ілюстрована 15 таблицями та 12 рисунками. Список літератури складається із 182 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Група хворих на ТКЛШ, у яких вивчали імунологічні та клініко-біохімічні показники периферичної крові, включала 40 чоловік з різною стадією та важкістю захворювання, з них - 27 чоловіків та 13 жінок, віком від 22 до 81 року. Із врахуванням клінічних симптомів та даних морфологічного дослідження шкіри у хворих діагностовано згідно TNM-класифікації (Kerl H., Sterry W., 1987) Т-клітинну лімфому шкіри: І стадію - у 22 хворих, ІІ - у 7, ІІІ - в 11. Усі хворі пройшли обстеження і лікування із застосуванням ПФФ у відділі екстракорпоральної гематології Інституту патології крові та трансфузійної медицини АМН України амбулаторно або в гематологічному відділенні 5-ої міської клінічної лікарні, протягом 1994-2000 р.р. ПФФ застосовувався хворим на ТКЛШ вперше.

Для підтвердження діагнозу ТКЛШ проводили гістологічне дослідження біоптату шкіри. Верифікація діагнозу здійснювалася лікарями-гематологами у відділенні екстракорпоральної гематології.

Хворим на ТКЛШ перед курсом лікування плазмафотоферезом та після його завершення проводили загальноклінічні, біохімічні та імунологічні дослідження крові. Загальноклінічні та біохімічні дослідження полягали у проведенні розгорнутого аналізу крові, клініко-біохімічних досліджень периферичної крові з метою уточнення функціонального стану органів і систем та з’ясування впливу на них ПФФ. Досліджувався комплекс біохімічних показників, прийнятий в клініці для оцінки функціонального стану організму.

Загальний білок, азотисті продукти білкового обміну (сечовина, креатинін, сечова кислота), активність ферментів, показники функції печінки визначали на біохімічному аналізаторі з мікропроцесором “Pointe 180” (США).

Білкові фракції сироватки крові визначали методом електрофорезу на ацетатцелюлозній плівці розміром 99 см при рН=8,6 у веронал-мединаловому або тріс-буфері протягом 15-18 хв на вітчизняному апараті ЕФ-1; денситометрію проводили на аналізаторі фореграм АФ-1 (Україна) при довжині хвилі 610 нм з червоним світлофільтром.

У групу імунологічних методів входили:

1. Визначення популяцій лімфоцитів периферичної крові за допомогою тесту комбінованого розеткоутворення (Логинский В.Е. и соавт., 1981).

2. Визначення диференційних антигенів на мембрані лімфоїдних клітин за допомогою моноклональних антитіл (МКАТ) серії ІКО (Інститут клінічної онкології РОНЦ АН Росії), серії ЛТ (Інститут імунології МОЗ Росії). Визначення лінійних маркерів мононуклеарних клітин проводилось за допомогою пероксидазно-антипероксидазного (ПАП) методу з використанням імунного комплексу пероксидаза-антипероксидаза.

Мононуклеарні клітини виділяли з гепаринізованої венозної крові методом диференційного центрифугування в градієнті щільності фікол-верографіну (=1,077). Облік реакції проводили в імерсійній системі мікроскопа (окуляр-5, обєктив-90). Реакцію оцінювали морфологічно, підраховуючи кількість антигенпозитивних мононуклеарів на 100-200 клітин, використовуючи люмінесцентний мікроскоп Люмам Р-8”.

3. Визначення рівня циркулюючих імунних комплексів у сироватці крові (Логинский В.Е. и соавт., 1983).

4. Визначення проліферативної активності лімфоцитів периферичної крові (Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С., 1981) під впливом ПФФ, яку оцінювали по здатності до бласттрансформації під впливом мітогенів туберкуліну та фітогемаглютиніну (ФГА) (виготовлений на кафедрі цитології та гістології Львівського Державного медичного університету; оптимум дії визначали шляхом внесення різних концентрацій його в контрольні зразки із кров’ю здорових людей).

5. Визначення фагоцитарної активності нейтрофілів периферичної крові під впливом ПФФ за методом Чернушенко Е.Ф., Когосовой Л.С., 1981.

Результати досліджень об’єднували у статистичні сукупності залежно від стадії захворювання і обробляли методом варіаційної статистики з визначенням середнього арифметичного значення і стандартної похибки середнього значення (Мm). При порівнянні статистичних сукупностей використовували критерій Стьюдента-Фішера.

Результати досліджень та їх обговорення.

Дослідження гемограм у хворих на Т-клітинні лімфоми шкіри дозволило з’ясувати особливості загальної картини крові. Встановлено, що перебіг цього захворювання супроводжувався зростанням швидкості осідання еритроцитів, зниженням гемоглобіну, зростанням вмісту лейкоцитів, лімфоцитів, моноцитів, паличкоядерних, сегментоядерних, еозинофільних лейкоцитів. Причому ці зміни носили однонаправлений характер і залежали від стадії захворювання (табл. 1).

В результаті застосування плазмафотоферезу відмічено корекцію морфологічних показників крові у хворих на Т-клітинну лімфому шкіри. Відмічено зниження вмісту лейкоцитів, лімфоїдних клітин, ШОЕ. Так, вміст лейкоцитів вірогідно знизився у порівнянні з даними перед ПФФ на ІІ стадії на 21 %, на ІІІ - на 7 %; ШОЕ знизилась відповідно до стадій на 15 %, 58 % та 6 % (у всіх випадках р0,05) (див. табл.1).

Позитивні зміни після курсу ПФФ відмічено також у лейкоцитарній формулі: відсоток еозинофілів знизився на 27 % у хворих з І та на 20 % з ІІ стадією ТКЛШ, базофілів - на 25 % на І, на 40 % на ІІ та на 67 % на ІІІ стадії захворювання (у всіх випадках р0,05). Кількість лімфоїдних клітин знизилася на І стадії - на 18 %, на ІІ - на 75 %, на ІІІ - на 29 % (у всіх випадках р0,05). Вміст паличкоядерних клітин у периферичній крові знизився у хворих з І стадією на 29 %, з ІІ - на 13 % (у всіх випадках р0,05). Лейкоцитарна формула характеризувалася також зменшенням кількості лімфоцитів. Так, вміст лімфоцитів вірогідно знижувався: на І стадії - на 12 %, на ІІ - на 11 % і на ІІІ - на 14 %. Ці зміни, можливо, пов’язані із зменшенням кількості циркулюючих патогенних Т-лімфоцитів.

Відмічені зміни загальної картини крові після застосування плазмафотоферезу характеризували загальну реактивність організму, що залежала від стадії захворювання, не носячи діагностичного чи прогностичного характеру.

Таблиця 1

Середні показники гемограм у хворих на Т-клітинні лімфоми шкіри під впливом ПФФ

Показ-ники | Контр.

група | І стадія,

n=22 | ІІ стадія,

n=7 | ІІІ стадія,

n=11

До ліку-

вання | Після лі-

кування | До ліку-

вання | Після лі-

кування | До ліку-

вання | Після лі-

кування

Гемогло-бін, г/л | 142

5,1 | 130,84,8

р10,05 | 125,95,1

р0,05 | 125,44,2

р10,05 | 119,84,0

р0,05 | 121,84,5

р10,05 | 108,83,8

р0,05

Еритро-цити, 1012/л | 3,9

0,3 | 4,20,5

р10,05 | 4,10,4

р0,05 | 4,30,3

р10,05 | 3,10,2

р0,05 | 4,10,5

р10,05 | 3,80,3

р0,05

Лейкоцити,

109/л | 6,3

0,8 | 6,10,7

р10,05 | 5,70,5

р0,05 | 7,00,6

р10,05 | 5,50,4

р0,05 | 10,11,0

р10,05 | 7,50,7

р0,05

ШОЕ,

мм/год | 8,5

1,1 | 13,31,4

р10,05 | 11,31,2

р0,05 | 20,01,9

р10,05 | 8,51,2

р0,05 | 17,41,6

р10,05 | 16,31,6

р0,05

Паличкоя-дерні, 109/л | 0,14

0,016 | 0,350,030

р10,05 | 0,230,016

р0,05 | 0,340,042

р10,05 | 0,230,022

р0,05 | 0,540,070

р10,05 | 0,380,030

р0,05

Сегментоя-дерні, 109/л | 3,6

0,370 | 3,570,298

р10,05 | 3,290,302

р0,05 | 4,150,406

р10,05 | 3,250,286

р0,05 | 6,410,595

р10,05 | 4,560,360

р0,05

Еозино-філи, 109/л | 0,19

0,021 | 0,380,042

р10,05 | 0,260,028

р0,05 | 0,670,076

р10,05 | 0,40,033

р0,05 | 0,670,071

р10,05 | 0,530,061

р0,05

Базофіли,

109/л | 0,07

0,006 | 0,370,030

р10,05 | 0,260,022

р0,05 | 0,280,030

р10,05 | 0,130,016

р0,05 | 0,300,020

р10,05 | 0,080,010

р0,05

Моноцити,

109/л | 0,25

0,016 | 0,310,020

р10,05 | 0,220,014

р0,05 | 0,390,030

р10,05 | 0,310,033

р0,05 | 0,660,029

р10,05 | 0,450,069

р0,05

Лімфоцити,

109/л | 1,96

0,122 | 1,840,115

р10,05 | 1,520,085

р0,05 | 1,930,083

р10,05 | 1,350,054

р0,05 | 2,480,110

р10,05 | 1,590,080

р0,05

Лімфо-

їдні, 109/л | - | 0,170,012

р10,05 | 0,130,01

р0,05 | 0,140,013

р10,05 | 0,030,006

р0,05 | 0,350,030

р10,05 | 0,190,015

р0,05

Примітки:

p - достовірність у відношенні з даними до лікування;

р1 - достовірність у відношенні до контролю

Реакція комбінованого розеткоутворення, використана нами для ідентифікації популяцій лімфоцитів периферичної крові хворих на ТКЛШ, не виявила суттєвих відмінностей у вираженості Т-клітинних маркерів на різних стадіях захворювання. Проте у порівнянні із здоровими людьми кількість Е-РУК-клітин (Т-лімфоцити) була нижчою на всіх стадіях захворювання. Відсоток ZС-РУК (В-клітин) перевищував цей показник у здорових людей і зростав у міру наростання патологічного процесу. Кількість нульових лімфоцитів, які не мають ознак Т- чи В-лімфоцитів, оскільки або позбавлені антигенних рецепторів, або рецептори їх блоковані, спадала від І до ІІІ стадії захворювання.

Після курсу плазмафотоферезу вміст Т-лімфоцитів вірогідно зріс на І і ІІІ стадіях, відсоток ZС-РУК (В)-клітин зріс на ІІ стадії захворювання, вираженість маркерів нульових лімфоцитів знизилася на всіх стадіях захворювання.

Т-клітинні лімфоми шкіри характеризуються злоякісним переродженням Т-лімфоцитів, які володіють гелпер/індукторним фенотипом клітинної поверхні (CD4) (Stadler R. Et al., 1998; Seo N. et al., 1998; Siegel R. et al., 2000), тому для імунофенотипування мононуклеарних клітин периферичної крові хворих на ТКЛШ було використано МКАТ, які б виявляли антигени Т-лімфоцитів (СD5, СD7) і їх субпопуляцій (CD4, CD8, СD16), а також антигени клітин В-ряду (CD22, HLA-Dr).

У хворих на всіх стадіях ТКЛШ встановлено зниження експресії СD5, СD7 антигенів порівняно з контрольною групою, що, на нашу думку, обумовлене ослабленням клітинної ланки імунітету. Значне вірогідне зниження експресії антигена СД7 на ІІІ стадії, можливо, пов’язане із втратою деяких маркерів зрілими Т-клітинами при прогресуванні захворювання (табл. 2).

Таблиця 2

Імунофенотип мононуклеарних клітин крові хворих на ТКЛШ

під впливом ПФФ

Кластер

диферен- | Контр.

група | І стадія,

n=22 | ІІ стадія,

n=7 | ІІІ стадія,

n=11

ціації | До ліку-

вання | Після лі-

кування | До ліку-

Вання | Після лі-

кування | До ліку-

вання | Після лі-

кування

CD5 | 64,5

2,8 | 56,00,7

р10,05 | 53,00,6

р0,05 | 62,60,6

р10,05 | 64,00,7

р0,05 | 63,00,8

р10,05 | 50,00,9

р0,05

CD7 | 59,0

2,6 | 52,00,7

р10,05 | 55,00,9

p0,05 | 58,50,6

р10,05 | 59,00,8

p0,05 | 33,00,5

р10,05 | 49,00,8

p0,05

CD4 | 33,0

2,3 | 41,61,1

р10,05 | 28,50,9

р0,05 | 31,21,0

р10,05 | 35,80,8

р0,05 | 39,01,2

р10,05 | 33,31,0

р0,05

CD8 | 20,0

2,5 | 15,30,8

р10,05 | 23,00,9

р0,05 | 16,40,7

р10,05 | 23,01,1

р0,05 | 18,00,8

р10,05 | 26,01,2

р0,05

CD4/CD8 | 1,7

0,2 | 2,70,3

р10,05 | 1,20,1

р0,05 | 1,90,3

р10,05 | 1,60,2

р0,05 | 2,20,1

р10,05 | 1,30,1

р0,05

CD22 | 23,0

1,9 | 15,00,7

р10,05 | 12,00,9

р0,05 | 17,00,8

р10,05 | 18,31,1

р0,05 | 21,01,3

р10,05 | 6,50,8

р0,05

CD16 | 15,5

1,4 | 16,71,1

р10,05 | 11,30,7

р0,05 | 21,51,2

р10,05 | 10,60,9

р0,05 | 8,70,7

р10,05 | 6,00,5

р0,05

HLA-Dr | 27,0

1,2 | 26,01,2

р10,05 | 21,01,0

р0,05 | 24,00,5

р10,05 | 26,50,8

р0,05 | 22,00,7

р10,05 | 26,01,0

р0,05

Примітки:

p - достовірність у відношенні з даними до лікування;

р1 - достовірність у відношенні до контролю.

Важливим критерієм в оцінці імунного статусу хворих на ТКЛШ є визначення вмісту Т-гелперів і Т-супресорів. Встановлено, що у переважної більшості хворих був знижений вміст Т-супресорів і підвищений вміст Т-гелперів порівняно з контролем, що спричинило зростання в порівнянні зі здоровими особами співвідношення Т-гелпери/Т-супресори .

Крім визначення експресії пан-Т-клітинних маркерів, у діагностиці ТКЛШ важливою є також оцінка вираженості В-клітинних маркерів. Вивчення експресії В-лінійноспецифічного антигену СД22 показало зниження кількості СД22+ - клітин у хворих на всіх стадіях ТКЛШ перед курсом ПФФ, причому його експресія зростала із наростанням злоякісності процесу. Одним з найбільш ранніх антигенів клітин мієлоїдно-моноцитарного ряду, який нами досліджувався, був антиген HLA-Dr (Іа антиген). Втрату його вважають несприятливим прогностичним фактором (Матютес Е., Катовски Д., 1993). Кількість HLA-Dr+ клітин була знижена на всіх стадіях ТКЛШ порівняно з контрольною групою.

Застосування плазмафотоферезу зумовлювало зміни фенотипової характеристики імунокомпетентних клітин, які відзначалися високою динамічністю. Так, на І і ІІІ стадіях захворювання після ПФФ спостерігалося вірогідне зниження кількості СD5-позитивних клітин (як відомо, МКАТ проти СD5-антигена реагує з пухлинними клітинами більшості хворих Т-клітинними лімфопроліферативними захворюваннями) на 5 % та 21 %. Зниження загальної кількості Т-лімфоцитів, на нашу думку, можна пояснити зменшенням кількості СД4-позитивних клітин, які складають пухлинний клон лімфоцитів. Експресія антигену СD7 відзначалася вірогідним зростанням порівняно з даними до ПФФ у хворих з І стадією ТКЛШ на 6 % та з ІІІ - на 48 %, що розцінюється нами як позитивний результат застосування плазмафотоферезу.

Після ПФФ відмічено зниження популяції клітин, що експресують антиген гелперних (СD4) клітин, на І та ІІІ стадіях ТКЛШ на 31 % та 15 % (р0,05). Вміст супресорних клітин зростав у хворих на І стадії - на 23 %, на ІІ - 40 %, на ІІІ - на 44 % (р0,05). Зрушення у співвідношенні цих двох функціонально відмінних популяцій клітин спричинили зниження імунорегуляторного індексу у хворих на всіх стадіях ТКЛШ. Відмічені зміни корелювали з позитивним терапевтичним ефектом.

Після ПФФ відмічено вірогідне зниження популяції клітин, що експресують антиген СD22: у хворих з І стадією на 20 %, з ІІІ - на 69 %. Зміни в системі В-лімфоцитів, що виникають в результаті лікування, зумовлені не прямим впливом ПФФ, а є наслідком імунорегуляторних зрушень всередині імунної системи. Вираженість активаційного HLA-Dr-антигену після курсу ПФФ зростала у хворих на ІІ-ІІІ стадіях (на 10 % і 15) та знижувалася на І стадії ТКЛШ (на 19(у всіх випадках р0,05). Відмічене нами зростання HLA-Dr -позитивних клітин є доказом ефективності ПФФ.

Підсумовуючи результати проведених досліджень, можна зробити висновок, що внаслідок пошкоджуючої дії активованих УФА псораленів відбуваються кількісні та якісні зміни фенотипової характеристики імунокомпетентних клітин; існує залежність між стадією Т-клітинної лімфоми шкіри та експресією поверхневих маркерів.

Оцінюючи зміни імунологічного фенотипу мононуклеарних клітин периферичної крові під впливом ПФФ, результати імуноморфологічних досліджень співставляли з клінічною картиною та відповіддю на ПФФ. Отримані результати свідчать про позитивні зміни клітинного імунітету під впливом ПФФ: зменшувалося свербіння та лущення шкіри, еритема, зникали папули, відновлювалися нігтеві пластинки, волосяний покрив на голові, віях, бровах, наставали тривалі ремісії.

Для більш повної характеристики імунної системи хворих, крім кількісних показників, необхідні дані про функціональну активність популяцій та субпопуляцій лімфоцитів, яку ми оцінювали по здатності лімфоцитів до бласттрансформації під впливом мітогенів.

У всіх хворих перед початком лікування відмічено суттєво знижений рівень проліферативної активності лімфоцитів периферичної крові у відповідь на мітогени ФГА та туберкулін, що пов’язане із ослабленням клітинної ланки імунітету. Після плазмафотоферезу мітоген-індукована активність лімфоцитів периферичної крові під впливом ФГА вірогідно зросла на 67 % у хворих з І, на 82 %- з ІІ і на 75 % у хворих з ІІІ стадією ТКЛШ. ПФФ сприяв вірогідному зростанню бласттрансформації і в реакції з туберкуліном (на 32 % на І, на 41 % на ІІ та на 50 % на ІІІ стадії захворювання).

Дослідження фагоцитарної активності нейтрофілів периферичної крові показало, що процент фагоцитуючих лейкоцитів був вірогідно зниженим у хворих з різними стадіями ТКЛШ порівняно з контролем, в той час як вірогідна різниця в залежності від важкості захворювання спостерігалася лише у хворих з ІІІ стадією (у них процент фагоцитуючих лейкоцитів був нижчим в 1,3 та 1,4 раза, ніж на І і ІІ стадіях). Фагоцитарне число було вірогідно збільшеним у хворих з І-ІІ стадіями ТКЛШ в 1,25 та 1,3 рази порівняно з контролем.

Після ПФФ в результаті активації клітинного імунітету рівень фагоцитарної активності вірогідно зростав на всіх стадіях захворювання. Так, процент фагоцитуючих лейкоцитів зріс у хворих з І стадією на 17 %, з ІІ - на 23 %, з ІІІ - на 34 %. Фагоцитарне число після ПФФ вірогідно зросло на І стадії на 23 %, (р0,05) та знизилось на ІІІ стадії ТКЛШ на 11 % (р0,05).

В результаті ПФФ встановлено вірогідне зниження початково підвищеного рівня циркулюючих імунних комплексів у периферичній крові хворих на ТКЛШ.

Як свідчать отримані нами дані, у хворих на ТКЛШ спостерігалися також відхилення біохімічних показників крові (зміна активності ферментів, порушення функції печінки, білкового спектру сироватки крові, азотистих продуктів білкового обміну).

Дослідження рівня загального білка у крові хворих на ТКЛШ показало, що перед проведенням курсу плазмафотоферезу вміст його вірогідно не відрізнявся від даних, отриманих у здорових людей. Вміст глобулінових фракцій (Г) був підвищеним у більшості хворих перед лікуванням, причому відсоток глобулінів у сироватці крові зростав паралельно важкості захворювання (від І до ІІІ стадії). Рівень альбумінів (А), які виконують в організмі транспортну і захисну детоксикаційну функцію, був зниженим у більшості хворих. Це зумовило зниження білкового коефіцієнту крові (А/Г). Такі зміни білкового спектру відповідали важкості захворювання.

Диспротеїнемія, що спостерігалася у хворих на ТКЛШ, розвинулася за рахунок підвищення рівня -глобулінів на І-ІІ стадіях та -глобулінів - на ІІ-ІІІ стадіях захворювання. Виявлені зміни білкового спектру сироватки крові у хворих на ТКЛШ відповідали результатам досліджень інших авторів і в значній мірі відображали важкість захворювання та зростаюче відповідно до його прогресування виснаження компенсаторних можливостей організму.

Застосування ПФФ зумовлювало зниження вмісту загального білка та зміни у співвідношенні білкових фракцій сироватки крові з тенденцією до їх нормалізації. Після ПФФ в результаті детоксикаційного ефекту застосованої терапії (за одну процедуру видаляли 50050 мл плазми з її заміною 0,9 % розчином натрію хлориду) вірогідно знижувався вміст глобулінів (на 129 % та 5відповідно до стадій) з паралельним підвищенням альбумінів, що і зумовлювало зниження рівня загального білка. Після курсу ПФФ відмічено зростання у сторону нормалізації білкового коефіцієнту крові: у хворих на І ст. - на 34 %, на ІІ - на 21 %, на ІІІ - на 9 % (p<0,05).

У результаті плазмафотоферезу відзначено вірогідне зниження рівня -глобулінів у хворих на ІІ та ІІІ ст. ТКЛШ ( на 25 % та на 17 %, p0,05), підвищення їх у хворих на І ст. на 9 %, p0,05; зниження -глобулінів на І та ІІ стадіях (на 13 % та 33 %, p0,05). Вміст глобулінів 1 та 2 знизився після ПФФ у хворих на І та ІІІ стадіях захворювання (1 - на 15 % та 14 %, p0,05, 2 - на 3 %, p0,05, та 8 %, p0,05) і зріс у хворих з ІІ стадією (1 - на 47 % та 2 - на 9 %, p0,05).

Як відомо, кінцевий етап білкового обміну включає в себе біохімічні процеси, що приводять до утворення аміаку, сечовини, сечової кислоти, креатину, глутаміну. Крім того, з сечею постійно виділяються амінокислоти, не використані в процесі синтезу білків. Вплив плазмафотоферезу на азотисті показники білкового обміну у хворих на ТКЛШ ми оцінювали за такими показниками: сечовина, креатинін та сечова кислота. Дослідження цих параметрів проводилося у сироватці крові.

Встановлено характерне переважання у сироватці крові сечової кислоти та креатиніну при нормальних значеннях сечовини. Виявлена азотемія зумовлена, очевидно, надлишковим надходженням у кров продуктів розпаду тканинних білків. Рівень сечовини перед застосуванням ПФФ вірогідно не відрізнявся у хворих з різними стадіями захворювання.

Застосування ПФФ сприяло нормалізації початково підвищених концентрацій креатиніну у хворих на І-ІІ стадіях та сечової кислоти на ІІ стадії захворювання. Після курсу ПФФ відмічено підвищення концентрації сечовини у сироватці крові на І-ІІІ стадіях ТКЛШ - на 6 %, 8 % та 19 % (в усіх випадках p0,05).

Загальною закономірністю злоякісного процесу є зростання активності ферментів катаболізму вуглеводів та анаболізму білків і нуклеїнових кислот. Дослідження активності ферментів у хворих на ТКЛШ є одним із критеріїв оцінки ефективності лікування, ступеня одужання, прогнозу. Так, Базарнова М.А. та Морозова В.Т. вважають, що “відсутність зміни активності ферментів на фоні застосування лікарських та інших способів лікування свідчить про низьку їх ефективність”, а при оцінці ступеня одужання ферменти виявляються більш інформативними показниками у порівнянні з іншими біохімічними тестами. Так, у хворих на ТКЛШ відмічено зростання активності ферментів лактатдегідрогенази (ЛДГ), кислої та лужної фосфатази.

Нами встановлено, що особливості ферментних властивостей сироватки крові полягали у вірогідному підвищенні активності ЛДГ у хворих з ІІ-ІІІ стадіями ТКЛШ, амілази на І та гамаглутамілтранспептидази (-ГТП) на І і ІІІ стадіях ТКЛШ перед початком ПФФ порівняно із контрольною групою. Висока активність ЛДГ у сироватці крові відмічена зарубіжними авторами, які розглядають цей фермент як прогностичний критерій перебігу захворювання. Так, Diamandidou E. et al., аналізуючи прогностичні фактори у хворих з грибоподібним мікозом, а Bernengo M G. еt al. - у хворих із синдромом Сезарі, зазначають, що підвищення активності ЛДГ у поєднанні з деякими іншими параметрами (велика кількість циркулюючих лейкоцитів, клітин Сезарі, CD4+ -клітин, високий показник CD4/CD8, CD7- фенотип клітин Сезарі у хворих із синдромом Сезарі) корелюють з гіршим виживанням.

Після курсу лікування плазмафотоферезом у хворих на ТКЛШ відмічено зміну активності ферментів, зумовлену позитивним ефектом лікування. Так, на всіх стадіях захворювання після лікування відмічено деяке зростання активності амінотрансфераз - аланінамінотрансферази (АЛТ) і аспартатамінотрансферази (АСТ). Відмічені зміни супроводжувалися зниженням активності лужної фосфатази, ЛДГ та гама-ГТП. Активність лужної фосфатази знизилася у хворих на І стадії ТКЛШ на 20 %, на ІІ - на 16 % (р0,05); активність ЛДГ знизилася на І стадії на 33 %, на ІІ - на 36на ІІІ - на 14 % (у всіх випадках р0,05); активність гама-ГТП знизилася після лікування на І стадії на 33 %, на ІІ - на 33 % (р0,05). При аналізі активності амілази відмічено зростання її на ІІ стадії ТКЛШ на 14 % (р0,05) та зниження на ІІІ стадії на 4 % (р0,05).

Як відомо, печінка займає центральне місце в обміні речовин, приймаючи активну участь у процесах, які забезпечують сталу концентрацію і динамічну рівновагу в плазмі крові. Це орган, де продукується загальний обмінний пул для метаболізму білків, жирів і вуглеводів. В результаті обмінних реакцій печінка забезпечує організму 1/7 енергії. Тому вивчення клініко-біохімічної характеристики крові хворих на ТКЛШ проводили, враховуючи показники тимолової, цинксульфатної і сулемової проб.

Перед лікуванням практично на всіх стадіях захворювання відмічено підвищені показники тимолової та сулемової проб у порівнянні з контрольною групою. Застосування ПФФ засвідчило вірогідне зниження цих величин. Так, показник тимолової проби на І стадії ТКЛШ вірогідно знизився на 25 %, на ІІ - на 12 %, на ІІІ - на 22 %; цинксульфатної знизився на І стадії на 12 %, на ІІ- на 19 %, на ІІІ - на 24 %. Показник сулемової проби після курсу ПФФ вірогідно зріс у хворих з ІІ і ІІІ стадіями (на 13 % та 7 %), у хворих з І стадією ТКЛШ цей показник не змінився.

Плазмафотоферез вплинув також на концентрацію деяких електролітів плазми крові. Так, після ПФФ відмічено зниження вмісту у плазмі крові іонів калію, натрію, кальцію, магнію та зростання вмісту хлору, заліза, фосфору. Такі зміни, можливо, пов’язані із видаленням плазми під час ПФФ та заміною її сольовими розчинами, а також перебігом основного захворювання, при якому відбувається перерозподіл мікроелементів як закономірний наслідок патологічного процесу.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1.

2.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

АНОТАЦІЯ

Звір Г. І. Вплив плазмафотоферезу на імунологічні та клініко-біохімічні показники у хворих на Т-клітинні лімфоми шкіри. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.31- гематологія та трансфузіологія. Інститут гематології та трансфузіології АМН України. - Київ, 2001.

В дисертації представлено результати вивчення особливостей клініко-біохімічних, морфологічних, імунологічних показників хворих на Т-клітинну лімфому шкіри (ТКЛШ) в залежності від стадії захворювання та під впливом плазмафотоферезу.

Встановлено, що розвиток ТКЛШ супроводжується характерними, залежними від стадії, імунологічними змінами: зниженням експресії антигенів загальних Т-клітин, супресорів, зростанням експресії гелперних клітин, зниженням проліферативної та фагоцитарної активності лейкоцитів периферичної крові. Застосування ПФФ призвело до зниження експресії CD4, CD5, CD16, CD22 та зростання експресії CD7, CD8 та HLA-Dr антигенів. В результаті ПФФ відмічено вірогідне зростання проліферативної активності лімфоцитів периферичної крові