ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ НАН УКРАЇНИ

Звягінцева Тетяна Володимирівна

УДК 616.5-001.27-002-003.9-092

ЗАПАЛЬНО-РЕПАРАТИВНІ ЯВИЩА В ПАТОГЕНЕЗІ

МІСЦЕВИХ ПРОМЕНЕВИХ ПОШКОДЖЕНЬ ШКІРИ

14.03.04 – патологічна фізіологія

А в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Харківському державному медичному університеті МОЗ України

Науковий консультант: | доктор медичних наук, професор

Клименко Микола Олексійович,

Харківський державний медичний

університет, завідувач кафедри

патологічної фізіології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор, Лауреат Державної премії України Середенко Михайло Михайлович, Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України, завідувач відділу по вивченню гіпоксичних станів

доктор медичних наук, професор, член-кор. АМН України Єльський Віктор Миколайович, Донецький державний медичний університет ім.М.Горького, завідувач кафедри патологічної фізіології

доктор медичних наук Чаяло Петро Петрович, Інститут експериментальної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України, завідувач лабораторії радіаційної біохімії

Провідна установа:

Національний медичний університет ім.О.О.Богомольця МОЗ України, кафедра патологічної фізіології

Захист відбудеться 26 червня 2001р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 016.15.02 при Інституті фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України (01024 Київ, вул.Богомольця, 4)

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України (Київ, вул.Богомольця, 4)

Автореферат розісланий 23 травня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Сорокіна-Марина З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Розширення області застосування іонізуючого випромінювання веде до збільшення числа променевих уражень, зокрема, місцевих променевих пошкоджень. Місцеві променеві пошкодження можливі у осіб, професійно зв'язаних з джерелами іонізуючого випромінювання, в аварійній ситуації і, особливо часто, як результат променевої терапії у онкологічних хворих. Удосконалення радіотерапевтичних програм і засобів радіопротекції, модернізація променевих технічних засобів, як показує клінічна практика, не виключає променевих реакцій і пошкоджень здорових тканин і, більш того, призводить до появи нових форм місцевих пошкоджень і загальних реакцій на опромінення.

Шкіра – перший бар'єр на шляху будь-якого виду іонізуючого випромінювання і тим або іншим чином відповідає на його вплив. За даними різних авторів, променеві пошкодження шкіри відзначаються більш, ніж у половини хворих, що звертаються за медичною допомогою внаслідок отриманої променевої терапії [Бардычев М.С. и соавт., 1985-1995; Иваницкая В.И. и соавт., 1989; Толстых П.И. и соавт., 1999]. Вже в процесі радикального курсу променевої терапії виникають шкірні променеві реакції. Це стосується в першу чергу близькофокусної рентгенотерапії, електроно – і нейтронотерапії. Менш виражені променеві пошкодження при використанні тільки гама-терапії, але і в цьому випадку до кінця курсу у 56% хворих розвивається вологий епідерміт [Курсова Л.В. и соавт., 1997]. Міжнародний симпозіум “Реакції нормальних тканин в радіотерапії і онкології” (Марбург, Германія, 2000) назвав променеві реакції і пошкодження шкіри головним ефектом нормальних тканин на опромінення, який погіршує якість життя.

Проблема променевих пошкоджень шкіри особливо актуальна для України. Події квітня 1986р. продемонстрували всьому світу реальність і небезпеку для живих організмів променевого впливу. Аварія на Чорнобильській атомній електростанції ускладнила радіоекологічну обстановку, і є всі підстави прогнозувати збільшення кількості онкологічних захворювань і, отже, комплексних способів їхнього лікування, 70-80% з яких включають променеву терапію.

Особливості променевих пошкоджень шкіри, порівняно з її пошкодженнями іншої етіології, – тривалий латентний період, торпідний, персистуючий перебіг, рецидиви, взаємоперехід і комбінація нозологічних форм, стійкість до терапії, яка проводиться. Низька ефективність терапії променевих пошкоджень шкіри, особливо важких форм – променевих виразок і фіброзів, є результатом недостатніх знань про механізми розвитку цих уражень, спроби розглядати променеві пошкодження шкіри поза зв'язком з загальними законами пошкодження і загоювання. В поглядах на сутність місцевих променевих пошкоджень шкіри до останнього часу панують дещо локалістичні уявлення про особливі критичні, паренхіматозні та (або) судинні, структури, які несуть відповідальність за весь різноманітний комплекс променевих пошкоджень. Це не узгоджується з сучасними уявленнями про шкіру як складний багатокомпонентний орган [Ярмоненко С.П. и соавт., 1992; Лушников Е.Ф., 1995; доповідь робочої групи комітету Міжнародної комісії по радіологічному захисту, 1996]. Найбільш важкі прояви променевих пошкоджень шкіри – променева виразка, променевий фіброз – розглядаються окремо від загальних законів раньового процесу. Згідно з сучасними уявленнями, загоювання ран становить собою єдність процесів запалення, регенерації і фіброзу, що, за своєю суттю, є нерозривними компонентами цілісної тканинної реакції на пошкодження, кінцевою метою якої є ліквідація пошкодження тканини з мінімальними за даних умов функціональними порушеннями [Саркисов Д.С., Серов В.В., 1995; Шехтер А.Б., 1995; Толстых П.И. и соавт., 1999].

Найменш вивчена запальна фаза місцевих променевих пошкоджень шкіри, не надана її чітка оцінка – особливостей, характеру і впливу на регенерацію, як і зворотного взаємозв'язку регенерації з запаленням. В основному вивчаються наслідки дії іонізуючого випромінювання, вживаються спроби, частіше марні, за допомогою різноманітних медикаментозних і хірургічних дій стимулювати процес загоювання, розглядаючи променеві виразки без зв’язку з загальними закономірностями загоювання ран. Тільки в останні роки Міжнародна комісія з радіологічного захисту (1996), узагальнюючи світовий досвід вивчення радіаційних ефектів в шкірі, відійшла від концепції розподілу променевих пошкоджень шкіри на не зв'язані між собою форми, визнала їхній взаємозв'язок і ідентифікувала реакції шкіри на променеве пошкодження згідно з вагомими патофізіологічними підставами. Ці загальні ключові висновки потребують розкриття конкретних механізмів відхилення репаративних процесів при променевих пошкодженнях шкіри від звичайного ходу загоювання ран. Оцінка променевих пошкоджень з загальнопатологічних позицій припускає, що це усього лише одна з форм, нехай достатньо специфічна і своєрідна, раньового процесу і повинна підпорядковуватися основним закономірностям запалення і репарації. Дане припущення вимагає встановлення особливостей запальних і репаративних явищ при місцевих променевих пошкодженнях шкіри.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках Державного конкурсного пріоритетного базового фінансування наукової і науково-технічної діяльності Міністерства охорони здоров'я України “Механізми променевих уражень, шляхи запобігання і корекції” (1998-2000) на кафедрі патологічної фізіології Харківського державного медичного університету (номер державної реєстрації 0198U002625). Здобувач – один з авторів проекту і головний виконавець.

Робота виконана також згідно з планом науково-дослідних робіт Харківського державного медичного університету МОЗ України, тема “Закономірності і механізми запалення в опроміненому організмі” (1997-2000, номер державної реєстрації 01896866). Здобувач – один з авторів і відповідальний виконавець теми.

Мета дослідження – закономірності і роль запально-репаративних явищ в патогенезі місцевих променевих пошкоджень шкіри, розробка на цій підставі нових підходів до консервативної терапії місцевих променевих пошкоджень шкіри.

Завдання дослідження:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Об’єкт дослідження – патогенез місцевих променевих пошкоджень шкіри.

Предмет дослідження – запально-репаративні явища.

Методи дослідження – використовувались фотометричні методи визначення дієнових кон'югатів (ДК), малонового діальдегіду (МДА), активності каталази (Кат), супероксиддисмутази (СОД), сіалових кислот (СК), гексуронових кислот (ГУК), оксипроліну; флюорометричні методи визначення шиффових сполук (ШС); хемілюмінесцентні методи визначення спонтанного та ініційованного випромінювання рідин; гістохімічні методи визначення активності гідролаз, сульфгідрильних (SH) груп; морфологічні, морфометричні, гістохімічні методи оцінки вогнища пошкодження, імуноморфологічні методи для диференціювання імунних клітин, клітин-носіїв антигенів і імуноглобулінів; імунологічні показники активності фагоцитозу, лімфоцитотоксичних антитіл до аутоантигенів шкіри, методи ідентифікації Т-лімфоцитів і оцінки їх функціональної активності, активності комплементу, рівня гемолізинів, циркулюючих імунних комплексів (ЦІК); методи підрахунку загальної кількості лейкоцитів крові, каріоцитів в кістковому мозку, лейкоцитарної формули і мієлограм; статистичні, параметричні та непараметричні, методи обробки результатів досліджень.

Наукова новизна отриманих результатів. Доведено, що ерозивно-виразковий процес, що виникає під впливом локальної променевої дії, становить собою різновидність раньового процесу і протікає за законами, властивими запаленню і загоюванню. Встановлені особливості запально-репаративних явищ при місцевих променевих пошкодженнях шкіри і внесок неспецифічної компоненти до суми явищ, що спостерігаються. Показано, що в числі ефектів, створюваних локальним опроміненням, існують неспецифічний компонент, властивий пошкодженням і іншої етіології, і специфічний, пов'язаний безпосередньо з дією іонізуючого випромінювання. Відокремлювальною особливістю раньового запалення, викликаного променевим фактором, є надмірна активація процесів ПОЛ, джерелом яких є не стільки перекисне окиснення в фагоцитарних реакціях, як при механічній дії, скільки пошкодження мембранних структур. Один з механізмів лавиноподібного наростання ПОЛ при променевому пошкодженні шкіри – різке падіння АО ресурсів і АО активності ферментів. Отримані нові дані про закономірності активації гідролаз при променевих пошкодженнях шкіри. Показано, що їхня активність знаходиться в залежності від стадії і ступеня важкості променевих пошкоджень шкіри. Одним із механізмів активації гідролаз, окрім взаємопов’язаних активації ПОЛ і пошкодження мембран, є зменшення концентрації біоенергетичних і пластичних субстратів у вогнищі ураження. З’ясовані закономірності реакцій усіх ланок системи крові – вогнища, периферичної крові, кровотворної тканини – при раньовому процесі в цілому і променевому пошкодженні шкіри, зокрема. Встановлено, що загальним, неспецифічним, в реакції системи крові є реакції кістковомозкового кровотворення і периферичної крові на пошкодження як на фактор стресу, з притаманними стресу елементами гіперплазії мієлоїдної тканини, активацією окремих паростків гемопоезу, що при променевому впливі ускладнюються зниженням загальної кількості мієлокаріоцитів. Специфічні відзнаки виявлені у вогнищі і складаються з домінування альтеративного і ослаблення інфільтративного компонентів, лейкоцитарної інфільтрації, розрегульованості клітинних і тканинних взаємодій, різкого пригнічення імунологічних реакцій, субпопуляцій Т-хелперів, Т-супресорів, антигенпрезентуючої функції шкіри, порушення загальної кінетики загоювання. Показано, що при променевих реакціях і пошкодженнях шкіри, поряд з ушкоджуючим характером змін, у вогнищі розвиваються і явища захисно-пристосувального характеру, які виявляються у тому рахунку і на морфологічному рівні: у вигляді гіперпродукції меланіну, гіперпроліферації епітелію і ендотелію. Розроблені принципово нові підходи до консервативної терпії місцевих променевих пошкоджень шкіри, вдосконалені методи і способи їх корекції, які грунтуються на місцевому застосуванні біоенергетичних і пластичних субстратів і поширюють арсенал консервативної терапії.

Практичне значення отриманих результатів. Проведені дослідження дозволили довести першочергову роль особливостей променевого запалення у процесі загоювання при місцевих променевих пошкодженнях шкіри, встановити і пояснити доклінічні прояви процесу. Отримані дані поширюють уявлення про раньовий процес в цілому і механізми його окремої форми – променевої виразки. Результати досліджень стали фундаментом розробки нових підходів до лікування променевих пошкоджень шкіри на основі місцевого застосування біоенергетичних, субстратвмістких лікувальних препаратів, що вдосконалює і поширює патогенетичну консервативну терапію місцевих променевих пошкоджень. Вони відкривають можливості подальшого пошуку ефективних протипроменевих засобів. Практичним результатом роботи стала розробка засобу лікування місцевих променевих пошкоджень шкіри (спільно Харківським державним медичним університетом і Харківським науково-дослідним інститутом медичної радіології ім.С.П.Григор’єва), на яке отримано авторське свідоцтво №1761147. Спосіб пройшов випробування і отримав заключення Київського науково-дослідного інституту онкології і Московського науково-дослідного рентгенрадіологічного інституту про можливість використання в практичній медицині. При виконанні дисертації винайдено новий радіопротектор, на який отримано патент Російської Федерації (№ 2049469), розроблено пристрій для фіксації лабораторних тварин (Пат. України № 422К), способи прогнозування наслідків радіаційних пошкоджень шкіри (Пат. України № 98010227 та № 98115811), лікування променевих реакцій і пошкоджень шкіри (Пат. України №97094685, Рішення про видачу Пат. України №99116342).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведений патентно-інформаційний пошук, проаналізована література, аргументована робоча гіпотеза дослідження, визначені мета, завдання, методичні рішення, здійснена розробка моделей і деяких методів дослідження. Самостійно проведені експерименти, оброблені отримані результати, проведено їхній аналіз і узагальнення, сформульовані висновки, написані і оформлені всі розділи дисертації. Визначення активності гідролаз, вмісту сульфгідрильних груп при місцевих променевих пошкодженнях шкіри здійснено на базі лабораторії патоморфології шкіри (зав. - докт. мед. наук, проф. Г.С.Цераїдіс) Харківського НДІ дерматології і венерології, морфологічних і імуноморфологічних змін шкіри після механічної і променевої дій – на базі кафедри патологічної анатомії (зав. – докт. мед. наук, проф. А.Ф. Яковцова) і морфологічної лабораторії ( зав. – докт. мед. наук, проф. Г.І. Губіна-Вакулик) ЦНДЛ Харківського державного медичного університету, показників імунологічної реактивності – на базі Харківського міського імунологічного центру (зав. - докт. мед. наук Т.І. Коляда), клінічна частина досліджень виконана на базі Харківського науково-дослідного інституту медичної радіології ім. С.П. Григор’єва ( директор – докт. мед. наук, проф. М.І. Пилипенко).

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися і обговорювалися на І Установчому Міжнародному Конгресі з патофізіології (Москва, 1991), Всесвітньому Проміжному Конгресі з клінічної і експериментальної патофізіології (Софія, 1997), ІІІ Міжнародному Конгресі з патофізіології (Лахті, Фінляндія, 1998), Міжнародному симпозіумі “Реакція нормальних тканин в радіотерапії і онкології” (Марбург, Германія, 2000), ІІ Національному Конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Київ, 1996), ІІІ Національному Конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Одеса, 2000), Українській науковій конференції з міжнародною участю “Мікроциркуляція та її вікові зміни” (Київ, 1999), Пленумі науково-медичного товариства патофізіологів України (Чернівці, 1998), XV з'їзді фізіологів України (Донецьк, 1998), І Російському Конгресі з патофізіології з міжнародною участю (Москва, 1996), ІІ Російському Конгресі з патофізіології з міжнародною участю (Москва, 2000), Всесоюзному симпозіумі з міжнародною участю “Патогенез хронічного запалення” (Новосибірськ, 1991), науково-практичній конференції хірургів України (Харків, 1995), науково-практичній конференції “Структурно-функціональні одиниці і їхні компоненти в органах вісцеральних систем в нормі та патології” (Харків, 1991), науковій конференції ХМІ “Актуальні питання сучасної медицини” (Харків, 1991), науковій сесії ХДМУ “Актуальні проблеми сучасної медицини” (Харків, 1991, 1995), ювілейних читаннях, присвячених 130-річчю кафедри гістології, цитології і ембріології ХДМУ (Харків, 1997), засіданнях Харківського товариства патофізіологів (Харків, 1997-2000).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 58 наукових робіт, з них 30 статей у фахових журналах, 1 авторське свідоцтво, 6 патентів на винаходи, 20 тез доповідей на конгресах, конференціях, симпозіумах за спеціальністю.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 299 сторінках тексту, набраного на комп’ютері, і складається зі вступу, огляду літератури, опису експериментальних моделей і методів дослідження, шести розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списка використаних літературних джерел, що складається з 372 джерел. Зміст роботи проілюстровано 51 таблицею і 36 рисунками (обсяг 15 сторінок).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Експериментальна частина дослідження виконана на 1120 щурах Вістар масою 180-220 г і 440 морських свинках масою 300-350 г. Моделями променевого пошкодження були: сухий епідерміт області спини чи задньої кінцівки (в залежності від задач дослідження), що викликався одноразовим локальним рентгенівським опроміненням на установці РУМ-17 в дозі 30 Гр; вологий епідерміт і променева виразка, для отримання яких величину поглиненої дози збільшували до 70-90 Гр; крім того застосовували комбінацію місцевого опромінення в дозі 30 Гр з загальним одноразовим опроміненням в дозі 6.5 Гр [Звягінцева Т.В. 1998, 1999]. Моделлю механічного пошкодження була шкірна рана, що викликалась видаленням ділянки шкіри площею 397,614,2 мм2 тієї ж локалізації, що і променеве пошкодження [Ліпшиць Р.У., Звягінцева Т.В.,1997].

Під спостереженням знаходилися 148 хворих з променевими реакціями і пошкодженнями шкіри різноманітного ступеня тяжкості. Променева терапія проводилася з приводу різних онкологічних та неонкологічних захворювань: рак шкіри різної локалізації, рак молочної залози, рак щитовидної залози, лімфогрануломатоз підм’язових, пахових лімфовузлів, тімома, екзема, кератома стопи, ангіома шкіри обличчя.

Про стан прооксидантно-антиоксидантних систем судили за вмістом у вогнищі пошкодження, плазмі і еритроцитах первинних – ДК [Карпищенко А.И., 1997], проміжних – МДА [Львовская Е.И., Волчегорский И.А., 1991] і кінцевих – ШС [Барабой В.А.,Орел В.Э., Карнаух И.М., 1991] продуктів ПОЛ; активністю ключових АО ферментів – Кат [Королюк М.Н., Иванова Л.И., Майорова И.Г., 1988] і СОД [Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.В., 1990]; спонтанною та ініційованною хемілюмінесценцією [Барабой В.А., Чеботарев Е.Е., 1984], вмістом SH груп [Пирс Э., 1962].

Для визначення активності гідролаз використовувались гістохімічні методи дослідження. Активність ацетилхолінестерази (АХЕ) визначали методом Келле, аденозинтрифосфатази (АТФ-ази) – методом Вахштейн і Мейзель, кислої і лужної фосфатаз (КФ і ЛФ) – методом Гоморі [Пирс Э., 1962].

Підрахунок загальної кількості каріоцитів у кістковому мозку стегна і мієлограм, загальної кількості лейкоцитів у вогнищі і крові, клітинного складу вогнища пошкодження і лейкоцитарної формули здійснювали за стандартними методами [Груздев Г.Н., 1988].

Для з'ясування морфологічних особливостей променевих реакцій і пошкоджень зрізи шкіри після відповідної обробки забарвлювали гематоксилін-еозином, пікрофуксином за Ван-Гізоном, Шифф-йодною кислотою на ДНК за Фельгеном- Росенбеком, на РНК – за Браше [Пирс Э., 1962].

Імуноморфологічні дослідження проводили на парафінових зрізах, непрямим методом Кунса [Brosman M., 1979]. Імунні клітини диференціювали за допомогою моноклональних антитіл виробництва США (Сhemicon), а також серії ИКО-НПО Медбіоспектр до різних типів клітин. Типували наступні клони клітин: СD3, CD4, CD8, CD22, CD11b, клітини з HLA-Dr-антигеном. Клітини-носії IgM, IgA, IgG і С-3 фракції комплемента визначали прямим методом Кунса з люмінесцуючими антисироватками (виробництва НДІ ім. М.Ф.Гамалеї, Москва). Препарати вивчали в люмінесцентному мікроскопі МЛ-2 з використанням світлофільтрів: ФС-1-2, СЗС-24, БС-8-2, УФС-6-3.

Комплексний морфометричний аналіз тучноклітинної популяції шкіри здійснювали роздільно в субепідермальних і глибоких відділах [Липшиц Р.У., Цераидис Г.С., Звягинцева Т.В., 1984] в препаратах, забарвлених толуїдиновим синім з урахуванням кількості тучних клітин, цитограм, індексу насиченості гепарином, вмісту дегранульованих клітин, відносної частоти форм дегрануляції [Линднер Д.П. и соавт., 1980].

У якості тестів неспецифічної реактивності використовували показники фагоцитозу нейтрофілів відносно Staphilococcus aureus – відсоток клітин, що вступили в фагоцитоз – індекс Гамбургера (ІГ), фагоцитарный індекс; середнє число бактерій, що знаходилися внутрішньоклітинно – індекс Райта (ІР), фагоцитарне число; відношення кількості вбитих мікробів до загального числа мікробів, фагоцитованих нейтрофілами – індекс завершеності фагоцитозу, індекс перетравлювання (ІП) [Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С., 1978]; загальної активності комплемента, гетерофільних гемолізинів [Резникова Л.С., 1967]. Досліджували рівень ЦІК [Караулов А.В., 1999]; для визначення специфічності деяких видів аутоантитіл в крові щурів ідентифікували Т-лімфоцити за допомогою реакції розеткоутворювання з еритроцитами морської свинки, визначали вміст лімфоцитотоксичних антитіл, антитіл до шкірної тканини за реакцією зв'язування комплемента. Ідентифікацію Т-лімфоцитів в крові пацієнтів проводили шляхом реакції розеткоутворювання з еритроцитами барана, визначення їхньої функціональної активності з використанням реакції бласттрансформації лімфоцитів [Фримель Т., 1999].

Корекція місцевих променевих пошкоджень шкіри здійснювалася на основі місцевих лікувальних заходів і, поряд із звичайними заходами, включала підшкірне або внутрішньом’язове введення (в залежності від глибини ушкодження) лікарських речовин по периферії вогнища на межі між пошкодженою і нормальною шкірою за розробленою методикою [Звягінцева Т.В., Звягинцева М.В., 1992-1997]. У якості лікарських речовин використовували 1% розчин натрію аденозинтрифосфату, церебролізин, румалон, андекалін, лідазу, аплікації 50% розчином димексиду. Місцева терапия хворих проводилася на тлі класичної гемостимулюючої, десенсибілізуючої, загальнозміцнюючої терапії.

Для оцвнки ефективності місцевої консервативної терапії, яка проводилася, окрім загальноприйнятих клінічних критерієв загоювання визначали спеціальні, що рекомендують для прогнозування виходів та ефективності лікування місцевих променевих пошкоджень, – дослідження ГУК в добовій сечі, СК в крові [Меньшиков В.В. и соавт. 1987], екскрецію оксипроліну з добовою сечею [Пильв И.И., Титаев А.А., 1963].

Результати досліджень обробляли стандартними, параметричними і непараметричними, методами варіаційної статиститки на комп’ютерах типу ІВМ з використанням відповідних пакетів прграм.

Результати дослідження і їх обговорення. Передусім досліджувався внесок процесів вільнорадикального окиснення до розвитку запалення і раньового процесу взагалі. Передумовою для цих досліджень послужили: 1. Провідна роль ПОЛ при променевій хворобі і поодинокі дані про активацію процесів ПОЛ при локальному опромінюванні внутрішніх органів. 2. Концепція медіаторної функції продуктів ПОЛ, що склалася в останні роки, при запаленні, алергії, стресі [Барабой В.А.,Сутковой Д.А., 1997; Серов В.В., Пауков В.С., 1995], що дозволяє розглядати їх як медіатори патології загалом. 3. Першочергова роль кисень-залежного механізму у знищенні мікробів при запаленні і його значення у запальній альтерації тканин.

Показано, що розвиток раньового процесу, викликаного механічною і радіаційною діями, супроводиться активацією процесів ПОЛ у вогнищі пошкодження і периферичній крові. При дії механічного фактора зростання вмісту первинних (ДК) і вторинних (МДА) продуктів ПОЛ має короткочасний, а кінцевих (ШС) – епізодичний характер, спостерігаючись в основному протягом запальної фази раньового процесу. Зростання показників ПОЛ має місце в зоні пошкодження, де вміст ДК збільшується на 1-у і 7-у доб (185% і 125% відповідно від вихідного), МДА – тільки на 1-у доб (125%), ШС лише на 7-у доб (128%). У зоні, прилеглій до пошкодженої, зміни у вмісті первинних і кінцевих продуктів ПОЛ знаходяться в межах фізіологічних коливань, а концентрація вторинних продуктів нижча, ніж у контролі, протягом першого тижня (70% від початкової). Концентрація ДК в плазмі наростає на 1-у доб (на 71% вище початкової), в еритроцитах – на 1-у, 7-у, 15-у доб (на 33%, 46% і 59% більше початкової відповідно), вміст МДА в плазмі збільшений протягом тижня, в еритроцитах – протягом 15-и діб, досягаючи максимума в обох випадках на 7-у доб (на 69% вище початкової в плазмі і на 103% – в еритроцитах).

При радіаційній дії відмічається прогресуюча активація ПОЛ у вогнищі і периферичній крові, яка починається в доклінічній стадії і досягає апогею на час формування виразки. При цьому збільшується вміст не тільки первинних і вторинних продуктів ПОЛ, але й кінцевих в порівнянні з виявленим після механічної дії у відповідні строки, що свідчить про перехід процесу до розряду безповоротних [Барабой В.А. і співавт., 1994]. Примітний той факт, що, на відміну від механічного пошкодження, активація процесів ПОЛ має поширений характер, на користь чого свідчить зростання вмісту продуктів ПОЛ у зоні, що не попала до поля опромінювання, але безпосередньо до нього прилегла. Показники ПОЛ в периферичній крові у тварин після радіаційної дії також вищі, ніж після механічної, ще в латентному періоді, і залишаються на високому рівні до кінця спостереження, тобто в періоди сухої, вологої десквамації, формування виразки. Збільшення вмісту первинних і вторинних продуктів ПОЛ характеризується двофазністю, причому друга фаза є інтенсивнішою. Концентрація ДК більш усього зростає на 1-у і 7-у доб (перевищуючи вміст ДК у щурів після локального механічного пошкодження в плазмі на 42 і 65%, в еритроцитах – на 61 і 60% у відповідні строки) і повторно – на 30-у доб. Вміст МДА досягає вершин на 1-у доб (збільшення в плазмі на 33 %, в еритроцитах – на 105% в порівнянні з механічним пошкодженням) і 30-у доб (збільшенням в плазмі на 105%, в еритроцитах – на 107%).

Як відомо, оцінка стану ПОЛ не може бути достатньою без урахування активності АО-системи, яка в нормі контролює і обмежує ПОЛ, а міра розгортання процесів ПОЛ при патології залежить від резервів АО-системи [Барабой В.А., Орел В.Є., Карнаух И.М. 1991; Барабой В.А., Сутковой Д.А., 1997]. Тому з метою з'ясування механізмів активації ПОЛ при механічному і променевому пошкодженнях паралельно досліджували активність ключових АО ферментів – Кат і СОД – у вогнищі і еритроцитах периферичної крові.

Показано, що активність АО ферментів при механічному і променевому пошкодженні у вогнищі і периферичній крові має якісно різний характер: відмічається їхня активація внаслідок механічної дії і пригнічення внаслідок променевої.

Активність Кат після механічної травми зростає на 7-у і 15-у доб в зоні пошкодження (132 і 143% від початкової) і не змінюється – в прилеглій зоні. Відповідність за часом і локалізацією в зонах вогнища процесів ПОЛ і стану АО ферментів дозволяє вважати, що активація ферментативної АО-системи – найважливіший механізм контролю і обмеження наростання ПОЛ при раньовому процесі, виникаючому внаслідок механічної дії. Потужність АО-систем при механічному пошкодженні підтверджується відсутністю наростання первинних і кінцевих, і навіть деяким зниженням концентрації вторинних продуктів ПОЛ в зоні, прилеглій до пошкодженої. Активність Кат після променевого пошкодження нижча, ніж в контролі, і, тим більше, ніж у щурів після механічної травми, особливо в зоні опромінювання, з досягненням мінімальних величин на 30-у доб. Первинне різке посилення активності СОД у вогнищі (7-а доб), що спостерігається при опромінюванні і також стрімке падіння активності фермента підтверджує швидке витрачання АО резервів. Активність Кат і СОД в крові у ході механічного пошкодження не змінена, променевого – знижена.

Істотно, що кінетика показників ПОЛ і АО-ферментів в периферичній крові повторює таку у вогнищі, але є тривалішою і з більшою амплітудою коливань, як при променевій, так і механічній діях.

Відомо, що активація ПОЛ при загальному опромінюванні розвивається безпосередньо після дії іонізуючого випромінювання, а згодом спостерігаються коливання змісту продуктів ПОЛ, які залежать від АО-систем [Барабой В.А. і співавт., 1992-1997]. Отже, друга фаза збільшення продуктів ПОЛ при локальному опромінюванні, ймовірно, зумовлена недостатністю АО-систем, високою швидкістю витрачання АО резервів. Це підтверджується даними, отриманими нами при вивченні хемілюмінесценції сироватки крові, які зафіксували зниження потенційної здатності систем організму підтримувати прооксидантну-антиоксидантну рівновагу. Звичайно друга хвиля посилення ПОЛ співпадає з періодом клінічних проявів променевої хвороби. Дана особливість виявлена нами і при локальному опромінюванні шкіри.

Далі було піддане уточненню питання про джерела збільшеного утворення активних форм кисню (АФК) при раньовому процесі. З даних літератури відомо, що у вогнищі запалення вільнорадикальне ПОЛ може значно активуватися [Кузин М.И., Костючонок Б.М., 1990; Серов В.В., Пауков В.С., 1995]. Генерація АФК у процесі фагоцитозу –– один з механізмів деструкції мікроорганізмів і клітин-мішеней. Показане збільшення активності мієлопероксидази, яка бере участь в утворенні вільних радикалів кисню, перекису водню, галоїдів у вогнищі запалення асептичної рани, а також в циркулюючих у периферичній крові нейтрофілах, еозинофілах, моноцитах в ранні строки після пошкодження. Ці дані послужили передумовою для дослідження лейкоцитарной реакції вогнища і фагоцитарной активності лейкоцитів периферичної крові після механічного і променевого пошкоджень шкіри.

Як і очікувалось, розвиток механічної рани супроводжувався характерною для запалення акумуляцією лейкоцитів у вогнищі з домінуванням в запальному інфильтраті на 1-у доб після нанесення рани поліморфноядерних лейкоцитів, а потім, на 3 і 7-у доб, – макрофагів.

Лейкоцитарна реакція шкіри на опромінювання відрізняється крайньою мізерністю. Деяка кількість макрофагів і нейтрофілів виявляється лише через тиждень після опромінювання. Негустий інфільтрат (макрофаги, лімфоцити, поліморфноядерні лейкоцити) з домінуванням макрофагів спостерігається на 15 – 21-у доб і є реакцією на вогнище деструкції, що сформувалося внаслідок локального опромінювання шкіри.

Абсолютна кількість лейкоцитів периферичної крові знижується в обох групах через добу, залишаючись на низькому рівні протягом 3-х діб у щурів, підданих механічному впливу; у опромінених тварин лейкопенічна фаза продовжується до кінця досліджень. При цьому лейкопенія розвивається в основному за рахунок зменшення кількості лімфоцитів і, в меншій мірі, - моноцитів.

В обох групах динаміка показників фагоцитарної активності нейтрофілів має фазний характер і багато в чому схожа. Ранній етап лейкопеніченої фази (3-я доб) співпадає за часом зі зниженням ІГ і ІР, і одночасним збільшенням ІП, особливо у опромінених тварин, що може відображати компенсаторну реакцію на зниження кількості фагоцитів і тимчасове падіння поглинаючої активності, ІР в обох групах на 7-у доб має тенденцію до збільшення, а на 15-у доб –– повертається до показників, близьких до початкового рівня.

Таким чином, має місце зв'язок динаміки фагоцитарной реакції і активації процесів ПОЛ при механічній рані. Активація ПОЛ спостерігається в запальній стадії раньового процесу і загалом відповідає класичній картині активації вільнорадикальних процесів при запаленні. Разом з тим отримані дані свідчать про те, що загоювання рани повторним натягненням супроводжується більш тривалою активацією процесів ПОЛ, ніж при загоюванні асептичної рани первинним натягненням.

З підсумків цього етапу досліджень витікає, що при рані, викликаній дією механічного чинника, джерелом утворення продуктів ПОЛ є стимуляція лейкоцитів, перекисне окиснення в фагоцитарних реакціях, за рахунок чого реалізується бактерицидний ефект як елемент захисної реакції організму. Додатковим чинником посилення вільнорадикальних процесів (особливо на ранньому етапі) може бути пошкодження самої тканини шкіри, мембран паренхіматозних, епітеліальних клітин і їхніх органел (як і у інших випадках стресу). Однак, незважаючи на посилену генерацію АФК і гідроперекисних ліпідів, АО система є достатньою для стабілізації рівня ПОЛ, і взагалі реакція не виходить за рамки захисної.

Різке зменшення лейкоцитарної інфильтрації вогнища променевого пошкодження з майже повною відсутністю мікрофагів, при схожості фагоцитарної активності нейтрофілів периферичної крові у щурів з механічним і променевим пошкодженнями, не може пояснити надмірного і тривалого збільшення продуктів ПОЛ перекисним окисненням у фагоцитарних реакціях. У цьому випадку залишається версія різкої активації ПОЛ в процесі радіаційного пошкодження шкіри внаслідок розвитку реакцій радіаційного посилення, передусім в мембранах. Відомо, що одним з результатів деструкції біомембран є вивільнення гідролаз. Тому на наступному етапі роботи досліджували активність АХE і фосфатаз (АТФ-ази, КФ та ЛФ), які вважаються до того ж метаболічними індикаторами променевого ураження, фіксуючими стан біоeнергетичних процесів [Серкиз Я.И., Пинчук В.Г., Пинчук Л.Б. і співавт., 1992], а також вміст SH-груп, що є надійним критерієм окиснювально-антиоксидантного гомеостазу [Граевский Е.Я., 1969; Куна П., 1989; Барабой В.А., Белошицкий П.В., Красюк А.Н. і співавт., 1994], у вогнищі променевого ураження.

Показано, що розвиток порівняно легкого ступеня променевого пошкодження – сухої десквамації (сухого епідерміту) – супроводжується фазовими змінами активності АХЕ, АТФ-ази і кількості SH-груп в різних структурних елементах шкіри щурів. Між цими змінами існує негативна кореляційна залежність. Виявляється залежність між активністю АХЕ, АТФ-ази, кількістю SH-груп і клінічним перебігом променевого епідерміту. Максимальні зміни показників мають місце в період ранньої (1 – 2-а доб) і основної (15 – 25-а доб) еритематозной реакції, а їх нормалізація відбувається в міру вщухання процесу. Отримані результати дозволяють констатувати, що навіть при порівняно легкій формі променевого пошкодження шкіри в різних структурних елементах шкіри – ендотелії судин, нервових волокнах, базальних клітинах епідермісу, епітелії волосяних фолікулів – мають місце ферментні зсуви. Особливої уваги заслуговують виявлені зміни активності гідролаз, кількості SH-груп в життєздатних шарах епідермісу: базальному шарі, який містить клоногенні клітини [Potten C.S. et al., 1983], і епітелії волосяних фолікулів, де локалізується 50-60 % усіх базальних клітин [Osanov D.P. et al.,1983].

Волога десквамація (вологий епідерміт) і променеві виразки у щурів супроводжуються більш значною активацією АХЕ, АТФ-ази, зниженням кількості SH-груп в епідермісі, судинах, нервових волокнах і епітелії волосяних фолікулів задовго до формування виразок, в “латентному", клінічно спокійному, періоді, і також мають фазний характер.

При співставленні показників активності ферментів в шкірі при її променевих пошкодженнях різного ступеня тяжкості (сухій десквамації і вологій десквамації, яка переходить до виразки) спостерігається різна міра активації гідролаз. При сухій і вологій десквамації виявляється двофазна активація ферментів, відповідна клінічним проявам. Перша фаза відмічається у тварин обох груп на 1 – 2-у доб і відповідає ранній еритематозній реакції. За нею слідує “латентний" період, який супроводжується деяким зниженням активності гідролаз. При вологій десквамації активність ензимів в цей період відповідно не знижується до рівня контролю. Наступний період основної еритематозної реакції характеризується другою фазою активації гідролаз, що особливо виражена при важких ступенях променевого ураження, якими є волога десквамація і покриття виразками.

Рівень SH-груп змінюється в напрямі, протилежному активації ферментів. Їх кількість досягає мінімуму при вологій десквамації і покритті виразками на 1 – 2-у і 15 – 30-у доб, не повертаючись до вихідних значень.

У доповнення до дослідження активності АТФ-ази і АХЕ визначали активність КФ і ЛФ, у виразці, що сформувалася, у іншого біологічного виду - морських свинок, де також виявлені однотипні зміни показників активності усіх ферментів. У зоні некрозу ферменти і SH-групи не виявляються, по краях виразки активність гідролаз різко збільшена в усіх структурних елементах шкіри, вміст SH-груп – знижений. По мірі віддалення від краю пошкодження активність ферментів, вміст SH-груп наближаються до початкових значень.

Таким чином, встановлені загальні закономірності порушень метаболічних процесів при виникненні і розвитку місцевих променевих пошкоджень шкіри у різних біологічних видів, у тому рахунку у морських свинок – тварин, дуже близьких до людини за радіочутливістю і структурою АО систем. Це виявляється в односпрямованих змінах активності ферментів і кількості SH-груп в різних структурних елементах шкіри - епітеліальних, нервових, судинних, а також в запальному інфільтраті, які корелюють зі ступенем тяжкості, а також фазами ураження. Зміни активності гідролаз, які співпадають за тяжкістю променевого ураження, локалізацією в зонах вогнища і параметрами часу з активацією ПОЛ, свідчать на користь мембранних механізмів активації вільнорадикального окиснення при місцевих променевих пошкодженнях шкіри протягом латентного періоду, сухої, вологої десквамації, променевої виразки. Зниження кількості SH-груп у вогнищі підтверджує встановлене нами при вивченні АО ферментів пригнічення і виснаження АО потенціалу, що є найважливішим механізмом обмеження лавиноподібного наростання ПОЛ, і вихід процесу до розряду “некерованих". Ефект зниження кількості SH-груп свідчить також про руйнування білків, амінокислот, пуринових і піримідинових основ, РНК, ДНК, тобто про дефіцит пластичних і енергетичних субстратів у вогнищі променевого ураження. Це може бути ще одним з механізмів пригнічення АО системи, оскільки амінокислоти беруть участь у синтезі АО сполук, у тому рахунку і АО ферментів. У модельних системах доведено, що зниження концентрації субстратів, у свою чергу, призводить до зростання активності ферментів [Эйдус Л.Х., 1996; Короленко Т.А., 1990]. Одним з підтверджень цьому є активація гідролаз при променевих ураженнях шкіри. Відмічена неспецифічність і універсальність цього феномену відносно природи ушкоджуючого агента, пов'язана з самими загальними і фундаментальними властивостями клітини, до числа яких відносяться неспецифічна регуляція ферментної активності низькомолекулярними лігандами і розподіл цих речовин в клітині: зростання активності ферментів при зниженні концентрації органічних речовин, домішок, субстратів.

Загалом отримані дані свідчать про переважання процесів катаболізму при променевому запаленні і розвитку виразки. Відомо, що у вогнищі механічної рани також має місце активація катаболічних процесів, внаслідок активації гідролаз у вогнищі в певні, досить короткі, проміжки часу після пошкодження, що пояснюють певною ферментною специфічністю [Кузин М.И., Костючонок Б.М., 1990]. Цей процес закінчується для більшості ферментів через 24-48 год, і на зміну йому приходять анаболічні процеси [Кузин М.И., Шимкович Л.Л., 1990; Саркисов Д.С., 1987; Чомаков М., 1972; Raеkallio J., 1970]. Звертає увагу однотипність змін різних ферментів при променевих пошкодженнях шкіри, що підтверджує втрату ними здатності каталізувати специфічні реакції [Куна П., 1989].

Як уже вказувалося, вогнище променевого запалення відрізняється мізерністю лейкоцитарної інфильтрації. Однак картина променевого запалення була б далеко неповною при вивченні тільки периферичної ланки системи крові – лейкоцитів вогнища і лейкоцитарної реакції периферичної крові, - без урахування центральної ланки – кістковомозкового кровотворення.

Але раніше було піддане вивченню питання про клітинні реакції кісткового мозку при шкірній рані, викликаній механічною дією. Це питання становить самостійний інтерес, оскільки в літературі є переважно свідчення про стан лейкопоезу при нераньовому запаленні [Клименко М.О., і співавт., 1991-2000].

Показано, що розвиток раньового процесу супроводжується неоднозначною реакцією кровотворної тканини: фазовими змінами загальної кількості клітин (ЗКК) в кістковому мозку стегна зі збільшенням на 1-у доб (в 1,4 раза вище початкової), зниженням на 3-ю, 7-у і 15-у доб (в 3,9, 2,3 і 1,7 разів відповідно) і відновленням на 30-у доб; збільшенням числа ретикулярних клітин, недиференційованих бластів, активацією гранулоцитопоезу, зниженням кількості лімфоїдних клітин. При цьому зміни з боку недиференційованих клітин, гранулоцитів і, меншою мірою, моноцитів також мають фазний характер. Перша фаза посилення гемопоезу відмічається на 1-у – 3-ю доб, друга – на 7 – 15-у доб.