НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна

Артамонов Михайло Вікторович

УДК 577.115.3+577.125.3:616.127+616-005.4

ВПЛИВ N-СТЕАРОЇЛЕТАНОЛАМІНУ

НА ЛІПІДНИЙ СКЛАД МІОКАРДА

ЗА ПОСТІШЕМІЧНОЇ РЕПЕРФУЗІЇ

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України

Науковий керівник – доктор біологічних наук,

член-кор. НАН та АМН України

ГУЛА Надія Максимівна,

зав. відділу біохімії ліпідів

Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

ЛЕВИЦЬКИЙ Євген Леонідович,

головний науковий співробітник

Інституту фармакології і токсикології АМН України;

доктор медичних наук, старший науковий співробітник

МИКОША Олексій Степанович,

керівник лабораторії гормональної регуляції обміну речовин

Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В. П. Комісаренка АМН України

Провідна установа – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії, м. Київ.

Захист відбудеться “ 1 ” липня 2002 року о 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України за адресою: м. Київ, вул. Леонтовича, 9.

Автореферат дисертації розісланий: “ 1 ” червня 2002 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О. В.

Актуальність теми. Робота присвячена актуальній проблемі сучасної біохімії ліпідів і вирішує питання про порушення ліпідного гомеостазу в міокарді за умов ішемії.

Наприкінці 70-х – початку 80-х років в ішемічній зоні міокарда собаки було показано накопичення речовин ліпідної природи – N-ацилетаноламінів (NAE) [Epps1980; Natarajan V., 1981]. Відразу ж було зроблено припущення, що їхнє накопичення може мати певне кардіопротекторне значення [Natarajan V., 1981]. Пізніше було показано широкий спектр біологічної активності цих сполук, досліджено їхні мембранопротекторні та антиоксидантні властивості [Parinandi N. L., 1988; Gulaya1998]. Висловлено припущення, що ці сполуки синтезуються у відповідь на пошкоджуючу дію токсичних факторів [Kondo S., 1998] при розвитку ішемічного [Epps1979], стресового стану [Berdyshev E. V., 2000] тощо. Зауважимо, що питання стосовно кардіопротекторних властивостей NAE залишається мало з’ясованим, жодної роботи, присвяченої дослідженню кардіопротекторної дії цих сполук за умов ішемічного та реперфузійного ушкодження, не було зроблено. Крім того, немає даних про можливість транспорту ендогенних NAE в організмі, проникнення їх у клітини, невивченим є метаболізм екзогенних NAE.

Ішемічне ушкодження тканини виникає як результат недопостачання кисню та поживних речовин до органу внаслідок тромбоутворення, спазму судин, недостатнього кровообігу або пережимання кровоносних судин за хірургічного втручання, під час якого орган вилучається із системного кровообігу. Раптова зупинка вінцевого кровообігу (ішемія) вже через декілька хвилин викликає важкі порушення діяльності серця [Вейсс Ч., 1986], і через 6-10 хв. настає його зупинка. Порушення енергоутворення, падіння вмісту макроергічних фосфатів, зменшення кількості глікогену, одночасне зростання кількості лактату та нуклеотидів [Sollevi A., 1987; Jansson E., 1986], реорганізація фосфоліпідного складу мембран [Post J. A., 1988] та виділення токсичних метаболітів може бути причиною розвитку некрозів та апоптозу [Scarabelli T., 2001].

Після поновлення вінцевого кровообігу реоксигенація збільшує пошкодження серцевого м’яза і, в окремих випадках, закінчується інфарктом міокарда [Oysel N., 1989; Dubost A., 1990]. В період реперфузії внаслідок біохімічних змін, що виникли в ішемізованому серцевому м’язі, підвищується рівень вільних радикалів, продуктів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) [Weisel R. D., 1989; Lazzarino G., 1994] та токсичних продуктів ліпідного обміну, що є однією з головних причин ускладнень під час реоксигенації. Особливу роль відіграє деградація фосфоліпідів мембран кардіоміоцитів та утворення внаслідок цього токсичних для міокарда продуктів. Проблема зменшення впливу токсичних метаболітів, які утворилися під час ішемії-реперфузії, та захисту ліпідних компонентів міокарда від ішемічного та реперфузійного ушкодження є ще далеко не вирішеною. Тому питання можливої кардіопротекторної дії NAE за умов постішемічної реперфузії міокарда є важливим і потребує дослідження.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами

Робота проводилась в рамках наукової тематики відділу біохімії ліпідів Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (тема 2.10.6 за проблемою 2.28.4 “Біохімія тварин і людини”, держ. рег. № 0199U000271 “Роль ліпідів у загальному механізмі розвитку патологічних станів та вивчення протекторної дії природних N_ацилетаноламінів (NAE) та С27-стероїдів”), затвердженої Президією НАН України. Робота була також підтримана грантом Міністерства освіти і науки України № .03/05560.

Мета та завдання дослідження. Метою дослідження було вивчити зміни у ліпідному складі міокарда за умов ішемії з наступною реперфузією, дослідити можливість корекції цих змін, а також охарактеризувати включення N_пальмітоїлетаноламіну (NРE) у ліпіди різних органів щурів in vivo. Для досягнення мети було поставлено наступні задачі: 1) Дослідити включення міченого по 14С N_пальмітоїлетаноламіну (N-[1-14С]-РE) до ліпідів різних органів щурів in vivo. 2) В умовах модельного експерименту на ізольованому серці, що відтворює стан міокарда людини під час індукованої ішемії, вивчити склад фосфоліпідів, вільних жирних кислот (ВЖК) та жирних кислот, пов’язаних із фосфоліпідами та холестеролом, у міокарді щурів за гострої ішемії-реперфузії. Провести дослідження впливу N_стеароїлетаноламіну (NSE) на ліпідний склад та функціональну активність серця за цих умов. 3) Вивчити зміни спектра фосфоліпідів та жирних кислот, естерифікованих у фосфоліпіди та ефіри холестеролу (ЕХ), а також у фракції ВЖК у біоптичних зразках міокарда людини в стані вираженої ішемії та на перших хвилинах реперфузії.

Об’єктом дослідження були довголанцюжкові насичені представники класу N_ацилетаноламінів – NРE та NSE, предметом – тканина серця щурів та людини за умов ішемічного ушкодження.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше вивчено включення N-[1-14С]-РE у ліпіди різних органів щурів in vivo. Показано, що значна частина мітки попадає до складу важливого мітохондріального фосфоліпіду – дифосфатидилгліцеролу (DPG). Уперше показано, що за умов короткочасної індукованої тотальної ішемії міокарда, яка розвивається під час хірургічного втручання, значно зростає кількість вільних поліненасичених жирних кислот (ПНЖК) та ненасичених жирних кислот (особливо арахідонової кислоти) у складі ЕХ, змінюється жирнокислотний склад фосфоліпідів, зменшується кількість ЕХ, зростає кількість лізофосфатидилетаноламіну (LPE). Для цих досліджень використовували матеріал, взятий під час хірургічної корекції дефекту міжпередсердної перегородки (ASD). В умовах модельного експерименту на ізольованому серці щурів, що відтворює умови короткочасної індукованої тотальної ішемії-реперфузії серця людини, показано значні зміни жирнокислотного складу індивідуальних фосфоліпідів, особливо це стосується фосфатидилетаноламіну (РЕ) та DPG. Уперше встановлено, що екзогенний NSE істотно впливає на спектр ацильних залишків, що входять до складу індивідуальних фосфоліпідів, та викликає значне зниження рівня лізофосфатидилхоліну (LPС). Під впливом NSE зменшується кількість ЕХ, що зростала за ішемії-реперфузії, а також рівень вільних ПНЖК n6-ряду. NSE має негативну інотропну дію та виявляє значний антиаритмогенний ефект, що пояснює його кардіопротекторні властивості.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані про зміни ліпідних компонентів у міокарді за умов ішемії, що викликана хірургічною операцією, доповнюють розуміння характеру ураження серця і наступних функціональних зрушень у його діяльності. Представлені дані розкривають деякі механізми ішемічних змін у міокарді; порушень біохімічних процесів у тканині серця за кардіоплегії й окреслюють шляхи усунення цих зрушень.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертації під керівництвом член-кор. НАН та АМН України Гулої Н. М. у відділі біохімії ліпідів Інституту біохімії О. В. Палладіна НАН України проведено визначення жирнокислотного спектру фосфоліпідів міокарда, ВЖК, вільного та естерифікованого холестеролу у біоптатах міокарда людини й тканини серця щурів. Досліджено розподіл N-[1-14C]-РЕ у тканинах щурів in vivo і його включення до ліпідів міокарда. Вивчено можливість корекції змін, що виникають за умов ішемії-реперфузії, із використанням NSE. Біоптати міокарда людини отримані в Інституті серцево-судинної хірургії АМН України під керівництвом завідуючого педіатричним відділенням член.-кор. АМН України Зіньковського М. Ф. під час хірургічного втручання на зупиненому серці. Експерименти по моделюванню ішемії-реперфузії проведені в Інституті геронтології АМН України під керівництвом академіка АМН України Фролькіса В. В..

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи було представлено:

- на міжнародній науковій конференції “Биологически активные соединения в регуляции метаболического гомеостаза”, 28-29 вересня 2000 року, м. Гродно (Бєларусь);

- на 5-ій Пущинській конференції молодих вчених “Биология – наука 21 века”, 16-20 квітня 2001 року, м. Пущіно, Росія;

- на 4-му “Congress on Coronary Artery Disease from Prevention to Intervention”, 21-24 жовтня 2001 року, м. Прага, Чехія;

- на конференціях молодих вчених Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАНУ у 1999, 2000 та 2001 роках.

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи надруковано 6 статей і 4 тези доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 157 сторінках друкованого тексту. Робота складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини (матеріали і методи, результати й обговорення), висновків, списку використаних джерел, що налічує 325 посилань, та додатків. Робота проілюстрована 19 рисунками, 37 таблицями та 13 додатками.

ЗМІСТ РОБОТИ

Першим розділом роботи є огляд літератури, у якому висвітлюється питання щодо впливу ішемії та реперфузії на біохімічні процеси організму ссавців, а також розглядаються біологічні властивості (NAE) та їх попередників – N_ацилфосфатидилетаноламінів (NAРE).

Матеріали й методи досліджень описано у другому розділі. У роботі використано тканину міокарда щурів та післяопераційний матеріал із серця людини. Вивчення розподілу N-[1-14C]-РЕ проводили на щурах.

Для досліджень використовувалися біоптичні зразки, що відбирав хірург під час проведення операції пластики аутоперикардом дефекту ASD. Біоптатами були шматочки міокарда середньою вагою 80 мг, які вимушено забирались хірургом для полегшення доступу до порожнини правого передсердя. Пацієнтами були 12 дітей із середнім віком 11 років. Першу групу дослідних зразків – біоптати тканини вушка правого передсердя перед підключенням штучного кровообігу. Друга група – тканина вушка правого передсердя та міокард стінки правого передсердя в період ішемії. Третя група – тканина вушка правого передсердя в період реперфузії на 3-й хв. після включення вінцевого кровообігу.

Ліпіди з тканин екстрагували за методом Bligh E.Y. & Dyer W.J., [1959]. Розділення ліпідів проводили методом мікротонкошарової хроматографії (МТШХ) на силікагелі у різних системах розчинників. Жирнокислотний аналіз здійснювали методом газорідинної хроматографії на хроматографі Сarlo Erba (Італія) після попереднього метилювання [Christie W.W., 1979]. В якості носія застосовували Chromosorb W/DP із фазою Silar 5 CP.

Для вивчення розподілу екзогенного NРE щурам внутрішньоочеревинно вводили мічений продукт, попередньо синтезований у лабораторії [Маргітич В.М., 1999]. Через 5 хв. тварин декапітували.

Для проведення досліджень в умовах індукованої ішемії міокарда було використано ізольовані серця 48 щурів-самців лінії Вістар у віці 9 місяців. Досліджувані серця було поділено на шість груп: “контроль” – (перфузію проводили протягом 1 год.), “ішемія-реперфузія” – (через 30 хв. після підключення серця до перфузії на 10 хв. припиняли постачання кисню та перфузійного розчину, після чого проводили 20-хвилинну реперфузію), три групи “ішемія-реперфузія+NSE” (також на 30-й хв. перфузії припиняли на 10 хв. постачання кисню та перфузату, з наступною 20-хвилинною реперфузією і з додаванням у перфузат NSE у кінцевій концентрації 10-7 М, 10-6 М, 10-5 М) та “реперфузія+NSE” (також на 30-й хв. перфузії припиняли на 10 хв. постачання кисню та перфузату, з наступною 20-хвилинною реперфузією і з додаванням у реперфузійний розчин NSE у кінцевій концентрації 10-6 М). Відповідно при поданні табличного матеріалу піддослідні групи показано в наступному порядку: “контроль” (початкові дані), “ішемія-реперфузія”, “ішемія-реперфузія + 10-7 М NSE”, “ішемія-реперфузія + 10-6 М NSE”, “ішемія-реперфузія + 10-5 М NSE” та “реперфузія + 10-6 М NSE”.

Вінцеву перфузію здійснювали за Lagendorff O. [1895] з використанням розчину Тірода наступного складу (мМ): NaCl – 118; KСl – 4,7; MgCl2 – 1,0; Na2HPO4 – 1,2; NaHCO3 – 25; CaCl2 – 2,5; глюкоза – 11. Перфузат аерували карбогеном (О2:СО2 – 95:5). Температура розчину – 370 С, рН 7,4. Окрім тканини міокарда у дослідженнях вивчали ліпідний склад перфузійного розчину, який відтікав від ізольованого серця протягом 10 хв. у період реперфузії.

Білок визначали за методом Lowry О.Н. [1951].

Результати досліджень та обговорення

1. Вивчення включення NРE у ліпіди тканин та органів щурів

Через 5 хв. після внутрішньоочеревинного введення щурам N-[1-14С]-РE більша частина мітки залишається неметаболізованою (рис. 1). Проте близько 1/3 NРЕ у печінці, серці та мозку зазнає метаболічних перетворень. Меншу метаболічну активність щодо перетворення мітки виявляють легені, нирки селезінка та діафрагма. Слід підкреслити значний вміст 14С у фосфоліпідній фракції печінки, серця та мозку. Радіоактивність не визначається у пулі вільного холестеролу, а також невелика її кількість (<2%) знаходиться у фракціях ВЖК та ЕХ. Незначний вміст мітки показано у фракції тригліцеридів (ТГ).

Дослідження розподілу радіоактивності по класах індивідуальних фосфоліпідів показало, що близько 50% мітки у серці накопичується у зоні, яка відповідає Rf DPG (рис. 2). У зонах, що відповідають Rf інших фосфоліпідів: фосфатидилхоліну (PC), PE, фосфатидилсерину (PS), сфінгомієліну (SM) та фосфатидилінозитолу (PI) визначено приблизно 10% від визначеної у фосфоліпідах мітки. Близько 7% мітки у печінці та до 3% у мозку знайдено у зоні, яка відповідає Rf NAРE.

Для отримання більш повного уявлення про включення мітки N-[1-14С]-РE у фосфоліпіди ми визначили питому радіоактивність фосфоліпідів досліджуваних органів (рис. 3). Кількість мітки, що припадає на 1 мкмоль DPG у 5-10 разів переважає кількість мітки, що припадає на 1 мкмоль інших фосфоліпідів. Важливо, що у більшість фосфоліпідів включається до 1 нКі (за винятком DPG) мітки, введеної in vivo. Включення мітки N-[1-14С]-РE in vivo свідчить про велику метаболічну активність насичених NAE.

Одним з механізмів метаболічного перетворення мітки може бути амідогідролазне розщеплення NРE з наступним використанням міченого ацильного залишку. Присутність мітки у пулі ВЖК (рис.1) також вказує на відщеплення міченого ацилу. Включення мітки до фосфоліпідів, можливо, є наслідком реацилювання пальмітату. Але з такої точки зору залишається не зовсім зрозумілою істотна різниця поміж включенням мітки до пулу фосфоліпідів та інших ліпідних класів. Якщо припуститися, що відбувається включення ацильного залишку, який вивільняється під дією специфічних до NРE амідаз, до складу інших ліпідних класів, то значний вміст мітки повинен бути знайдений і в інших ліпідних класах, зокрема, ТГ, пул яких у більшості досліджуваних органів є досить значним. Але отримані нами дані не підтверджують це припущення.

Тому ми висловили також і іншу гіпотезу. Не виключено, що введений в організм NРE конденсується з ендогенною фосфатидною кислотою (РА) з утворенням NAРE (рис. 4). А потім мічений ацил зазнає переносу до метаболічно пов’язаних із NAРE інших, більш стабільних, класів фосфоліпідів. За патологічних умов та підвищеної концентрації іонів Са2+, NAРE зазнає гідролізу під дією фосфоліпази D з утворенням NAE та РА. Не виключено, що цей фермент за нормальних умов може працювати у зворотному напрямку (на конденсацію NAE із РА). На користь цього припущення говорять дані про наявність 7% та 3% мітки (для печінки та мозку відповідно) у зоні, що за одновимірної МТШХ відповідає Rf NАРЕ.

NAE відносять до класу аутакоїдів, а для цього класу біологічно активних речовин важливим є наявність внутрішньоклітинної мішені. Відомо, що DPG є одним з основних фосфоліпідів мітохондріальних мембран, і саме цей фосфоліпід є одним із донорів ацилу при ендогенному утворенні NAE [Reddy P.V., 1983]. Тому, імовірно, що саме на мітохондріальні мембрани, які зазнають найбільшого ушкодження за ішемії-реперфузії, може бути спрямована аутакоїдна протекторна дія насичених NAE.

Заключення. Показано, що за внутрішньоочеревинного введення екзогенний NРE із великою швидкістю зазнає включення у різні ліпідні класи. Привертає увагу те, що вже через 5 хв. після введення близько 1/3 мітки визначається у фосфоліпідах печінки, мозку та серця, переважно у DPG. Інші органи щурів, зокрема, селезінка, нирки та легені мають дещо нижчу активність щодо захвату мітки.

2. Вивчення впливу NSE на ліпідний склад міокарда за постішемічної реперфузії

Для вивчення впливу NSE на ліпідний склад міокарда за постішемічної реперфузії було проведено експеримент на ізольованих серцях щурів. За умов ішемії-реперфузії у міокарді ізольованого серця щурів на 14% зменшується відносна кількість DPG (рис. 5). NSE запобігає зменшенню рівня DPG і проявляє, таким чином, певні кардіопротекторні властивості. Крім того, NSE викликає дворазове зменшення кількості LPC, який є надзвичайним кардіотоксичним агентом [Kinnaird A.A., 1988]. Ці дані вказують на кардіопротекторні властивості NSE за умов ішемії-реперфузії.

У роботі було детально проаналізовано жирнокислотний склад основних фосфоліпідів тканини серця щурів. Показано, що основу жирнокислотного спектру DPG, PE, PI, PS, РС та SM становлять пальмітинова (С16:0), стеаринова (С18:0), олеїнова (С18:1n9), лінолева (С18:2n6), арахідонова (С20:4n6) та докозагексаєнова (С22:6n3) кислоти. Крім того, у складі РЕ та особливо РІ і PS спостерігається значний вміст поліненасиченої докозапентаєнової (С22:5n6) кислоти. Підкреслимо, що РС, SM та PI є набагато більше насиченими – в них міститься близько 59% ненасичених жирних кислот порівняно з PS та РЕ, які мають у своєму складі ~65% та ~71% ненасичених жирних кислот відповідно. Найбільш ненасиченим за своїм жирнокислотним складом є DPG. В його складі знайдено близько 84% ненасичених жирних кислот, причому приблизно 79% з них складає С18:2n6.

Дослідження жирнокислотного складу індивідуальних фосфоліпідів міокарда ізольованого серця щурів за ішемії-реперфузії показало, що найбільших змін зазнають РЕ та DPG – фосфоліпіди, які локалізовано всередині клітини (РЕ на внутрішньому листку плазмалеми, а DPG – у мембранах мітохондрій). Так за умов короткочасної ішемії з наступною реперфузією кількість більшості мінорних жирних кислот у складі РЕ зменшується. Зокрема, знижується кількість майже всіх насичених мінорних жирних кислот. При додаванні у перфузат NSE істотних змін за цих умов не відбувається.

Аналізуючи абсолютні кількості жирних кислот, що входять до складу DPG, ми дійшли наступних висновків. Зменшується кількість більшості насичених жирних кислот, зокрема, таких важливих, як С16:0 та С18:0. Якщо до перфузійного розчину додати NSE, відносні кількості деяких мінорних кислот повертаються до вихідного рівня. Проте спостерігається зменшення кількості С20:4n6. Узагальнені дані щодо виявлених змін представлено у табл. 1. Так, у складі DPG більше ніж у двічі зменшується кількість насичених жирних кислот. Вищезазначені зрушення, що відбуваються у групі “ішемія-реперфузія”, викликають тенденцію до зростання індексу ненасиченості t=2,03, p=0,065, n=13. Додавання до перфузійного розчину NSE призводить до зростання цього показника.

За умов постішемічної реперфузії змінюються абсолютні кількості мінорних жирних кислот РС міокарда щурів і одночасно спостерігалось помітне (на 17%) зростання кількості С16:0. Додавання до перфузійного розчину NSE (10-6М), викликає зменшення рівня мінорних жирних кислот і таких важливих, як С18:2n6 та С22:6n3. Одночасно спостерігається істотне зростання кількості С16:0 та С20:4n6.

Цікаво, що постішемічна реперфузія не викликає помітних змін у абсолютних кількостях жирних кислот, естерифікованих до SM. Винятком є зменшення кількості деяких мінорних жирних кислот. За дії екзогенного NAE зменшується кількість С18:2n6.

У жирнокислотному складі РІ за ішемічних умов також не детектуються деякі мінорні жирні кислоти. За введення NSE кількість коротколанцюжкових жирних кислот повертається до вихідного рівня, але зростає кількість жирних кислот n6-ряду – С18:2n6, ліноленової (С18:3n6) та ейкозатриєнової (С20:3n6), а також С22:6n3. У жирнокислотному складі PS відбувається перерозподіл низки мінорних жирних кислот. При додаванні NSE значно зростає відносна кількість С18:0 (на 63%).

Жирнокислотний склад РЕ – фосфоліпіду, який, головним чином, локалізується на внутрішньому листку плазмалеми, в умовах гострої нормотермічної аноксії модифікується значно більше, ніж жирнокислотний склад РС та SM. Це стосується переважно мінорних кислот. Але найбільше потерпає за постішемічної реперфузії жирнокислотний склад DPG. Звертає на себе увагу факт зменшення кількості насичених кислот, особливо С16:0 та С18:0, у складі DPG, що вказує на можливість зростання рідинності мітохондріальної мембрани. Підтвердженням цього припущення є дані табл. 1, які доводять, що зміни жирнокислотного складу DPG викликають зміну коефіцієнта ненасиченості, що може відповідно викликати зрушення функцій, пов’язаних з мітохондріальною мембраною, зокрема окисним фосфорилюванням, переносом електронів. Внаслідок змін, які відбуваються в складі DPG за умов ішемізації, може виникати порушення білок-ліпідної взаємодії. Результатом є ушкодження структури мітохондріальної мембрани, що в свою чергу викликає зміну фізико-хімічних властивостей, порушує функціонування ензимних комплексів (окисного фосфорилювання, протонних та кальцієвих помп тощо). Це веде до тих патогенетичних зсувів, які спостерігаються звичайно у мітохондріях за умов ішемії-реперфузії.

Загалом, NSE доданий до перфузійного розчину, істотно зменшує кількість ПНЖК n6-ряду у складі фосфоліпідів і пригнічує синтез С20:4n6. Загальновідомо, що за оксидативного стресу різко активуються цикло- та ліпоксигеназний шляхи метаболізму С20:4n6. Крім того встановлено істотне підвищення рівня С18:0 кислоти у фосфоліпідах, що, вочевидь, може вказувати на ремоделювання фосфоліпідів насиченою жирною кислотою. Цікавим фактом є те, що під впливом NSE відбувається нормалізація кількості деяких мінорних жирних кислот у складі DPG. Однак, найбільшого впливу NSE зазнає жирнокислотний склад важливих сигнальних фосфоліпідів РІ та РS, а також найбільш вагомий за своєю кількістю – РС.

Вивчаючи фосфоліпідний склад ізольованого серця щурів, ми звернули увагу на наявність N_ацильованих ліпідів. З літературних даних добре відомо, що жирнокислотний склад NAE, виділених із різних джерел тваринного походження, представлений переважно ацильними залишками С16:0, С18:0 та С18:1n9 кислот. Жодних даних про детектування цих сполук у міокарді після короткого періоду ішемії ми не знайшли. Тому вельми цікавим для нас було вивчити жирнокислотний склад NAE, що утворились в міокарді в умовах модельного експерименту. Також важливим було дослідження метаболічного зв’язку поміж виділеним NAE та ацильними залишками, що знаходяться біля аміногрупи попередників NAE – NAРE. Для цього ми провели гідроліз NAРE за допомогою фосфоліпази D, після чого здійснили жирнокислотний аналіз NAE, виділеного із NAРE, та ендогенного NAE, виділеного з міокарда щурів. Отримані дані вказують на подібність жирнокислотного складу NАЕ та N-ацильних залишків NАРЕ, що є свідченням метаболічного зв’язку між NАРЕ та NАЕ. Особливо підкреслимо, що найбільшу кількість жирних кислот, що входять до складу NAE та NAРE, складають С16:0, С18:0 та С18:1n9 кислоти. Цікаво, що значний відсоток складає С20:4n6, кількість якої зазвичай не більше 1-2% від загальної кількості жирних кислот у складі NAE.

Цілком імовірно, що NSE, впливаючи на фосфоліпідний склад міокарда, може мати певний ефект на електрофізіологічні показники серця за ішемії-реперфузії. Так за постішемічної реперфузії спостерігається порушення всіх електрофізіологічних показників функцій міокарда. Внаслідок енергетичного виснаження вже через 10 хв. гострої тотальної ішемії значно знижується кількість серцевих скорочень та показники сили скорочення міокарда (Pmax), зокрема, швидкість скорочення (+dP/dt) (рис. 6). Як описано в літературі, на перших хвилинах реперфузії збільшується концентрація іонів Са2+ у саркоплазмі у зв’язку із виходом його із внутрішньоклітинних депо, спостерігається, так званий, “кальцієвий парадокс” [Pridjian A. K., 1987], який викликає нарощування сили серцевих скорочень після тимчасової зупинки серця – “феномен сходів” та гіперконтрактуру міокарда. Саме з цим феноменом може бути пов’язане різке зростання показників сили скорочень міокарда на перших хвилинах реперфузії (вище контрольних значень) (рис. 6). Це, безумовно, викликає подальше погіршення функціонального стану ішемізованої тканини серця. NSE, введений у перфузійний розчин у концентраціях 10-7 та 10-6 М, попереджає зростання показників швидкості скорочення та швидкості розслаблення міокарда, а за введення NSE в концентрації 10_ М виявляє негативну інотропну дію. Надзвичайно важливим фактом є антиаритмогенна активність NAE, який вірогідно зменшує кількість екстрасистол у міокарді ізольованого серця щурів за умов постішемічної реперфузії.

Певні позитивні зміни при введенні NSE відбуваються у фракції ВЖК тканини перфузованого серця щурів – зменшується кількість С18:1n9, С18:2n6 та С20:4n6 (рис. ). Зменшення кількості вільної С18:1n9 (рис. 7) та ПНЖК n6-ряду під впливом NSE може, вочевидь, віддзеркалювати його кардіопротекторні властивості. Дослідженням показано, що кількість вільного холестеролу за даних умов істотно не змінюється, проте кількість ЕХ у міокарді ізольованого серця щурів за патологічних умов істотно (на 450%) зростає (рис. 7). Таке збільшення кількості ЕХ може бути пов’язане із незначним (невірогідним) зменшенням кількості вільного холестеролу за ішемії- реперфузії. У міокарді ЕХ складають лише долі відсотка від кількості вільного холестеролу, тому незначні коливання рівня останнього можуть супроводжуватись значними змінами кількості ЕХ. Добре відомо, що ЕХ викликають зростання рідинності ліпідного бішару, порушують його структурованість, що може мати додаткові негативні наслідки, які справляє ішемія-реперфузія. NSE викликає концентраційно-залежне зменшення кількості ЕХ, що має важливе терапевтичне значення. Можливе пояснення компенсаторного механізму дії NSE на рівень ЕХ лежить у впливі на локалізовану у саркоплазматичному ретикулумі ацил-CoA:холестерол О-ацилтрансферазу (АХАТ). Вище зазначено (рис. 7), що NSE зменшує кількість вільної С18:1n9, яка є природнім субстратом для АХАТ [Chang T.Y., 1997].

Одним із показників, що характеризують перебіг переважно деструктивних процесів у міокарді за умов постішемічної реперфузії є дослідження ліпідного складу перфузійних розчинів, що відтікають від ізольованого серця. Отримані дані свідчать про те, що у перфузати за умов модельного експерименту попадають продукти метаболізму і деградації ліпідів. У рідині, що відтікає, ідентифіковано всі ліпідні класи, представлені у міокарді: фосфоліпіди, вільний холестерол, ВЖК, ТГ (табл. 2). За умов перфузії у перфузійному розчині в пікомолярних кількостях присутні PC та DPG. Ішемія-реперфузія викликає зменшення кількості фосфоліпідів, зокрема РС. Додавання до перфузату NSE призводить до зменшення DPG.

Серед інших ефектів, що виявляє NSE, зазначимо його концентраційно залежний вплив на деякі фізіологічні та біохімічні показники у міокарді ізольованого серця щурів. Зокрема NSE концентраційно-залежно зменшує кількість ЕХ та кількість ПНЖК n6_ряду у пулах ВЖК та ЕХ. У різних концентраціях NSE по різному виявляє негативну інотропну дію та антиаритмогенні властивості.

Заключення. Таким чином за умов постішемічної реперфузії у міокарді ізольованого серця щурів спостерігається зменшення рівня DPG, значно змінюється жирнокислотний склад РЕ та DPG та майже у 5 разів зростає кількість ЕХ. В умовах вираженої ішемії майже до нуля знижуються всі фізіологічні показники скорочення міокарда. Введення NSE веде до істотного зниження рівня LPC та попереджає зменшення DPG і зростання ЕХ. Вперше показано, що під впливом NSE зменшується кількість вільних ПНЖК n6-ряду, а також вільної С18:1n9, що має позитивний кардіотропний ефект. NSE має негативну інотропну дію. Це значить, що функціональна активність міокарда, яка потерпає від ушкоджуючого впливу гострої ішемії, набуває економного у енергетичному плані режиму. Крім того NSE виявляє значні антиаритмогенні властивості, що підтверджує його кардіопротекторний ефект.

3. Вивчення ліпідного складу біоптичних зразків міокарда дітей за ішемії та реперфузії

Для вирішення поставлених завдань щодо дослідження змін у ліпідних компонентах міокарда за ішемії-реперфузії, ми використовували також модель ішемічного ушкодження тканини серця, що виникає під час хірургічної корекції дефекту ASD. За цих умов значно збільшується кількість РI, який є важливим сигнальним фосфоліпідом (рис. 8). Подібні зміни ми спостерігали у експерименті на щурах, що дає нам змогу проводити певні аналогії між ішемічним ушкодженням міокарда ізольованого серця щурів та ішемією, що розвивається у клінічних умовах. Під час реперфузії кількість РІ повертається до вихідного рівня (рис. 8). Однак треба брати до уваги майже дворазове збільшення кількості LPE, який як і інші лізофосфоліпіди є кардіотоксичним агентом, і здатний спричиняти зміни рідинності сарколемальної мембрани [Fink K.L., 1984], що, в свою чергу, є важливим фактором для біохімічних зрушень та електрофізіологічних аномалій [Akita H., 1986].

За гострої ішемії міокарда спостерігається зростання вмісту насичених жирних кислот у фосфоліпідах (табл. 3), що може призводити до зростання щільності мембран і, можливо, відображає пристосування до ішемічних умов. Одночасно, наслідком ішемізації міокарда є зменшення кількості коротколанцюжкових і зростання кількості довголанцюжкових, зокрема моноєнових ненасичених жирних кислот фосфоліпідів, що можна пояснити активацією фосфоліпази А2 (PLA2) та порушенням процесів реацилювання-деацилювання. За реперфузії до вихідного рівня повертаються показники загальної кількості насичених жирних кислот та моноєнових жирних кислот фосфоліпідів, але, не зважаючи на це, зростає індекс ненасиченості (табл. 3). Зміна цього показника може відображати зменшення мікров’язкості мембран кардіоміоцитів за реперфузії і бути однією із важливих причин порушення білок-ліпідної взаємодії.

Вже через 15-20 хв. ішемії спостерігається багаторазове накопичення вільних ПНЖК, зокрема С18:2n6, тенденція до накопичення С20:4n6 (t=1,98, p=0,06, n=24). Такі зміни можна пояснити активацією PLA2 [Yanagishita T., 1987] (рис. 9А). Відомо, що ВЖК є потужними кардіотоксичними агентами [Wu M.L., 2000]. Нами відмічено накопичення С18:2n6, яка є попередником лейкотоксинів [Dudda A., 1996], та С20:4n6, з якої утворюються ейкозаноїди [Oudot F., 1995]. Привертає увагу те, що під час реперфузії накопичення ВЖК ще збільшується. Слід підкреслити чотириразове підвищення кількості вільних С18:2n6 та С20:4n6 кислот, які складають 40% від пулу ВЖК міокарду. Зміни у фосфоліпідах та ВЖК пов’язані з активацією PLA2, яка викликає деградацію фосфоліпідів – зростає кількість лізоформ (рис. 8), і, відповідно, зростає рівень ВЖК (рис. 9А). Склад жирних кислот ЕХ у міокарді людини та зміни цього складу за ішемії-репрфузії вивчено недостатньо. Тому вельми важливим було з’ясувати зміни, які відбуваються у фракції ЕХ міокарда людей під час тотальної ішемізації тканини серця. За ішемічних умов в міокарді людини зменшується кількість ЕХ (рис. 9Б), що може вказувати на інгібування активності ферментативних систем АХАТ у стані ішемії і, імовірно, є свідоцтвом ущільнення мембрани (ЕХ підвищують рідинність мембрани). Такі зміни можливо відображають адаптивні зміни по відношенню до впливу ішемізації міокарда людини.

За ішемії та наступної реперфузії у фракції ЕХ знайдено зростання відносного вмісту арахідонату, що може бути наслідком його накопичення у фракції ВЖК – відбувається реацилювання вільної С20:4n6 кислоти у ЕХ (рис. 10). Зауважимо, що окиснення арахідонової кислоти у складі ефірів холестеролу може мати певне негативне значення для ішемізованого міокарда.

Заключення. В умовах ішемічного стану в міокарді людини відбувається значне зниження кількості коротколанцюжкових жирних кислот та накопичення довголанцюжкових жирних кислот у складі фосфоліпідів. Одночасно спостерігається зростання кількості ВЖК, зокрема С20:4n6. Крім того, під час ішемії зростає рівень арахідонової кислоти у ЕХ при загальному зменшенні кількості ЕХ. Під час реперфузії накопичуються лізоформи фосфоліпідів та ВЖК, особливо С18:2n6 та С20:4n6.

ВИСНОВКИ

1. Проведені дослідження свідчать про виражені порушення обміну ліпідів і, зокрема, фосфоліпідів, в міокарді людини в умовах гіпоксії з наступною реперфузією. В експерименті на щурах здійснено ретельний аналіз ліпідної складової міокарда з паралельним визначенням функціональних порушень, що викликані гіпоксією тканини ізольованого серця щурів за умов постішемічної реперфузії. Досліджено кардіопротекторну дію N-стеароїлетаноламіну, та його включення у ліпіди різних органів щурів.

2. За умов постішемічної реперфузії ізольованого серця щурів відбуваються зміни у фосфоліпідах, зокрема, зменшується рівень дифосфатидилгліцеролу. Спостерігаються істотні зрушення у жирнокислотному складі фосфатидилетаноламіну, дифосфатидилгліцеролу та фосфатидилінозитолу.

3. В умовах модельного експерименту кардіопротекторний ефект N_стеароїлетаноламіну реалізується у зменшенні кількості лізофосфатидилхоліну, вільних жирних кислот та ефірів холестеролу, що супроводжується негативним інотропним та антиаритмогенним ефектами. Введення N-стеароїлетаноламіну до перфузійного розчину запобігає зменшенню рівня дифосфатидилгліцеролу – важливого мітохондріального фосфоліпіду, що, можливо, є однією з точок кардіопротекторної дії N_стеароїлетаноламіну.

4. Показано, що in vivo мічений N_пальмітоїлетаноламін метаболізує із значною швидкістю, і, вже через 5 хв., близько 1/3 мітки визначається у фосфоліпідах печінки, мозку та серця, переважно у дифосфатидилгліцеролі.

5. В міокарді людини за умов ішемії відбувається значне зменшення кількості коротколанцюжкових та накопичення довголанцюжкових жирних кислот у складі фосфоліпідів. Одночасно значно зростає кількість вільних жирних кислот, зменшується кількість ненасичених жирних кислот ефірів холестеролу, а також спостерігається загальне зменшення кількості ефірів холестеролу.

6. За реперфузії до вихідних значень повертається деякі показники складу фосфоліпідів та кількість ефірів холестеролу. Разом з тим накопичуються лізофосфоліпіди та вільні жирні кислоти. Кількість вільної арахідонової кислоти зростає у 4,5 рази.

СПИСОК РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Артамонов М.В. Модифікація ліпідного складу тканини ізольованого серця щурів N-стеароїлетаноаміном за гострої модельної ішемії-реперфузії. // Укр.Біохім.Журн.-1999.-71(5).-С.132-134.

2. Фролькiс В.В., Артамонов М.В., Жуков О.Д., Клiмашевський В.М., Маргiтич В.М., Гула Н.М. Ліпідний склад та скорочувальна активність ізольованого серця щурів за постішемічної реперфузії та за умов впливу насичених довголанцюжкових N_ацилетаноламінів. // Укр.Біохім.Журн.-2000.-72(1).-С.56-63.

3. Артамонов М. В., Гула Н. М., Клімашевський В. М., Жуков О. Д., Маргітич В. М., Фролькіс В. В. Вплив N-стеароїлетаноламіну на розподіл ліпідів різних класів у тканині серця щурів за умов ішемії-реперфузії. // Укр.Біохім.Журн.-2001-73(1).-С.101-109.

4. Артамонов М.В., Зіньковській М.Ф., Гула Н.М., Маргітич В.М., Клімашевський В.М. Зміни ліпідного складу міокарда в умовах хірургічного втручання з використанням холодової та хімічної кардіоплегії. // Укр.Біохім.Журн.-2001-73(2).-С.123-129.

5. Фролькіс В.В., Артамонов М.В., Клімашевський В.М., Жуков О.Д., Гула Н.М. Зміни жирнокислотного складу фосфоліпідів ізольованого серця щурів за умов постішемічної реперфузії. // Журн. Акад. Мед. Наук.-2001.-7(2)-С.333-346.

6 Артамонов М.В., Жуков О.Д., Маргітич В.М., Клімашевський В.М., Гула Н.М.. Вплив екзогенного N-стеароїлетаноламіну на жирнокислотний склад індивідуальних фосфоліпідів ізольованого серця щурів за умов постішемічної реперфузії. //Укр.Біохім.Журн.-2002-74(2).-C.86-94.

7 Артамонов М.В. Антиокислительное действие N-стеароилэтаноламина на эссенциальные фосфолипиды сердца крыс в условиях постишемической реперфузии. // Материалы международной научной коференции. ч 1. 28-29 сентября 2000. Гродно. Республика Беларусь. С. 21-25.

8 Гулая Н. М., Артамонов М. В., Маргитич В. М., Жуков А. Д. Распределение экзогенных насыщенных N-ацилэтаноламинов (NAE) по липидным классам различных органов крыс in vivo. // “Биология - наука 21-го века”. 5-я Пущинская конф. молодых ученых. 16-20 апреля 2001. С.6.

9 Гулая Н. М., Артамонов М. В., Климашевский В. М., Маргитич В. М. Изменения липидного состава миокарда детей при хирургической коррекции дефекта межпредсердечной перегородки. // “Биология-наука 21-го века” 5-я Пущинская конф. молодых ученых. 16-20 апреля 2001. С. 106.

10 Артамонов М.В., Жуков О.Д., Маргітич В.М., Клімашевский В.М., Гула Н.М. Вплив екзогенного N-стеароїлетаноламіну на жирнокислотний склад індивідуальних фосфоліпідів ізольованого серця щурів за умов постішемічної реперфузії. //Укр.Біохім.Журн.-2002-74(1).-С.135-136.

АНОТАЦІЯ

Артамонов М.В. ВПЛИВ N-СТЕАРОЇЛЕТАНОЛАМІНУ НА ЛІПІДНИЙ СКЛАД МІОКАРДА ЗА ПОСТІШЕМІЧНОЇ РЕПЕРФУЗІЇ - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2002.

Дисертацію присвячено аналізу змін ліпідного складу міокарда людини та щурів за умов ішемії і реперфузії, а також оцінці кардіопротекторної дії екзогенного N_стеароїлетаноламіну (NSE). Досліджено включення мітки N_пальмітоїлетаноламіну (NРE) у ліпіди різних органів щурів in vivo. Показано, що вже через 5 хв. до 1/3 введеної мітки визначається у фосфоліпідах різних органів, переважно у дифосфатидилгліцеролі, тобто екзогенні насичені довголанцюжкові N-ацилетаноламіни (NAE) виявляють значну метаболічну активність і швидко перетворюються в організмі. У модельному експерименті по вивченню кардіопротекторних властивостей NSE за постішемічної реперфузії показано, що введення NSE до перфузійного розчину зменшує кількість лізофосфатидилхоліну, вільних поліненасичених жирних кислот і запобігає зменшенню рівня дифосфатидилгліцеролу та зростанню кількості ефірів холестеролу, яке відмічено за постішемічної реперфузії. NSE проявляє негативну інотропну дію та має антиаритмогенні властивості. У міокарді людини за ішемії з наступною реперфузією відбувається зростання кількості лізофосфатидилетаноламіну, вільних жирних кислот, особливо лінолевої та арахідонової, збільшується вміст арахідонової кислоти у ефірах холестеролу при загальному зменшенні їх кількості, змінюється жирнокислотний склад фосфоліпідів.

Ключові слова: ішемія, реперфузія, N-стеароїлетаноламін, N-([1-14С]-пальмітоїл)-етаноламін, фосфоліпіди, вільні жирні кислоти, холестерол, ефіри холестеролу.

АННОТАЦИЯ

Артамонов М. В. ВЛИЯНИЕ N-СТЕАРОИЛЭТАНОЛАМИНА НА ЛИПИДНЫЙ СОСТАВ МИОКАРДА ПРИ ПОСТИШЕМИЧЕСКОЙ РЕПЕРФУЗИИ - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биохимии им. А.В.Палладина НАН Украины, Киев, 2002.

Диссертация посвящена анализу изменений липидного состава миокарда человека и крыс в условиях ишемии и реперфузии, а также оценке кардиопротекторного действия N_стеароилэтаноламина (NSE) на миокард. Исследовано включение метки N_пальмитоил-этаноламина (NPE) в липиды разных органов крыс in vivo.

Показано, что in vivo NPE со значительной скоростью элиминируется из кровяного русла крыс и уже через 5 мин. около 1/3 введенной метки (в разных органах) определяется в фосфолипидах. При этом наибольшее включение метки в фосфолипиды наблюдалось в печени, сердце и мозге крыс, тогда как в фосфолипиды селезёнки, диафрагмы, легких и почек попадает значительно меньшее количество метки. Преобладающая часть метки во всех исследованных органах включается в дифосфатидилглицерол, который играет значительную роль в митохондриях. Предполагается,