АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ

АЗАРСКОВА Маріанна Валеріївна

УДК 616-001.26-06+616-087+612.014.481:612.017.1.

ПРИСТОСУВАЛЬНІ РЕАКЦІЇ ІМУННОЇ СИСТЕМИ У РЕКОНВАЛЕСЦЕНТІВ ГОСТРОЇ ПРОМЕНЕВОЇ ХВОРОБИ У ВІДДАЛЕНОМУ ПЕРІОДІ ПІСЛЯ ОПРОМІНЕННЯ

03.00.01 – радіобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України (директор – доктор медичних наук, професор В.Г. Бебешко).

Науковий керівник: доктор медичних наук Базика Дмитро Анатолійович, завідувач відділу клінічної імунології Інституту клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Мельников Олег Феодосійович, Інститут отоларингології ім. професора О.С. Коломійченка АМН України, завідувач лабораторією імунології і патофізіології;

доктор медичних наук, професор Пінчук Людмила Борисівна, Інститут ядерних досліджень НАН України, провідний науковий співробітник.

Провідна установа:

Українська військово-медична академія, кафедра військової токсикології,

радіології і медичного захисту, Міністерство оборони України, Київ.

Захист дисертації відбудеться 13.05.2002 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.01 при Науковому центрі радіаційної медицини (04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Наукового центру радіаційної медицини, (04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53)

Автореферат розісланий 12.04.2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Л.О. Ляшенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми.. Пристосувальні реакції організму у відповідь на ушкоджуючу дію негативних чинників, зокрема - радіаційного, не супроводжуються автономними змінами окремих фізіологічних параметрів та функцій і являють собою взаємно обумовлену інтегративну відповідь різноманітних функціональних систем (Ю.К. Кудрицький та ін., 1990). Суттєву роль в їх інтеграції відіграє імунна система (ІС) , виступаючи важливим джерелом інформації про стан адаптаційних резервів організму (О.М. Зємсков та ін., 1994). Визначення ранніх порушень імунітету, зумовлених дією несприятливих факторів середовища, має особливе значення з точки зору розробки та здійснення комплексних заходів з охорони здоров'я населення, прогнозування віддалених наслідків дії цих факторів (І.В. Орадовська, 1991 ; В.Г. Бебешко та ін., 1990).

Функційні і морфологічні зміни в ІС , які виникли внаслідок впливу екстремальних факторів аварії на ЧАЕС, являють себе як найближчим часом після опромінення, так і у віддаленому періоді. Віддалені ефекти факторів Чорнобильської катастрофи переважно пов'язують з пошкодженням тимусзалежної ланки ІС ( Д.А. Базика, 1992; М.М. Літвіна та ін., 1994; Н.П. Савіна та ін., 1994) у вигляді змін кiлькостi, субпопуляцiйного складу та функцiонального стану Т-лiмфоцитiв.

Найбiльш значущі вiдхилення з боку iмунної системи спостерігаються в осiб, опромiнених в дозах бiльших, або рiвних 1,0 Гр (О.О. Ярілін, 1990; А.А. Чумак, 1994). В осіб, що зазнали атомного бомбардування, у віддаленому періоді після променевого ураження визначаються порушення функційної активності, метаболізму, рецепторного апарату імунокомпетентних клітин (M. Akiyama, 1995; M. Akiyama et al., 1992; I. Shigematsu et al., 1995). Проте, на японській когорті результати одержано через 35-40 років після опромінення, коли комплекс імунних порушень був вже сформованим і не було можливості дослідити механізми формування цих віддалених реакцій імунної системи. Не можна виключати і селекції радіочутливих пацієнтів на етапах формування віддалених реакцій. Незважаючи на те, що останнiм часом накопичено значний фактичний матерiал, проблема з'ясування визначальних механізмiв впливу радiацiї на iмунiтет, якi сприяють його порушенню у найближчi та вiддаленi термiни пiсля опромiнення, є предметом дискусiй та потребує подальшого розвитку.

У ряді випадків пострадіаційні ефекти в імунній системі можна класифікувати як набутий імунодефіцит (H.J. Evans, 1985; M. Akiyama et all., 1991; А.В. Аклєєв, 1995), тяжкість якого пропорційна ступеню тяжкості променевого ураження. Наявність імунодефіцитного стану створює умови для розвитку вiддалених iмунозалежних патологiчних станiв, клiнiчнi прояви яких реалiзуються збiльшенням частоти iнфекцiйних захворювань, посиленням аутоiмунних процессiв, хронізацiєю соматичної патологiї, в патогенезi якої присутнiй iмунний компонент, можливістю виникнення неопластичних станiв (А.А.Чумак та ін.,1995; В.М. Шубік, 1987; Г.І. Сидоренко та ін., 1992), що вказує на необхідність подальшого комплексного аналізу ІС з визначенням поверхневого фенотипу та вивченням функціональної активності імунокомпетентних клітин (ІКК) у цієї категорії осіб.

Вважаючи імунодепресивну дію факторів аварії довгостроковим біологічним ефектом (Н.О. Артамонова та ін., 1993; Y. Yamada et al., 1990), не можна обмежитися розглядом тільки радіаційного впливу. Необхідно враховувати комплексний вплив іонізуючого випромінювання, психо-емоційного стресу та загального погіршення екологічної ситуації. В даному випадку сумарний ефект несприятливого впливу в значній мірі визначається його складовими, а відповідна реакція організму формується як складний багатокомпонентний процес.

Тривалі зміни параметрів клітинного та гуморального імунітету у осіб, які перенесли гостру променеву хворобу (ГПХ), поєднуються з тривалим та стійким підвищенням тонусу симпато-адреналової та гіпоталамо-гіпофізо-кортикоадреналової систем (О.М. Коваленко, 1998; А.В. Свинаренко та ін., 1996). Відомо, що регуляторні впливи на імунітет значною мірою обумовлені функціями цих систем, і реалізуються шляхом взаємодії циркулюючих в крові гормонів та катехоламінів зі специфічними рецепторами імунокомпетентних клітин. Багато робіт присвячено вивченню ролі глюкокортикоїдів та катехоламінів у регуляції імунної відповіді, диференціюванні лімфоцитів (Hicks et al., 1998). Проте залишилися практично не дослідженими механізми порушень гуморальної регуляції імунітету у осіб, що постраждали внаслідок аварії на ЧАЕС, та внесок цих порушень у формування віддалених ефектів опромінення в ІС.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є складовою частиною комплексного дослідження , проведеного відділом клінічної імунології Інституту клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України в рамках галузевих програм: “Вивчити адаптаційні, компенсаторно-пристосувальні та патологічні механізми імунної недостатності у віддалений період після Чорнобильської катастрофи” (N держреєстрації 0195U003374, шифр теми 237); “Імунологічний моніторинг контингентів, що постраждали внаслідок аварії на ЧАЕС” (N держреєстрації 0196U010101, шифр теми 6.3-96.05).

Мета дослідження. Встановити значення кортизолу та адреналіну, як факторів гуморальної регуляції у пошкодженні субпопуляційної структури та функції імунокомпетентних клітин при імунній недостатності в період формування віддалених ефектів опромінення.

Основні завдання дослідження. 1. Дати характеристику імунної реактивності хворих у віддаленому періоді після променевих уражень, класифікувати пацієнтів в залежності від типу імунних порушень.

2. Вивчити особливості мітоген-залежної активації імунокомпетентних клітин у хворих на ГПХ у віддаленому періоді після опромінення залежно від ступеню захворювання.

3. Провести порiвняльне вивчення впливу адреналiну, кортизолу на поверхневий фенотип та процеси мітогензалежної активації імунокомпетентних клітин у вiддаленому перiодi пiсля опромiнення.

4. Виявити зв'язок мiж наявнiстю змiн гормон-пов'язаних параметрiв клiтинного фенотипу та рiвнем функцiонування iмунної системи.

Об'єкт дослідження: пострадіаційні ефекти в імунній системі.

Предмет дослідження: пристосувальні реакції імунної системи у реконвалесцентів гострої променевої хвороби у віддаленому періоді після опромінення.

Методи дослідження. Для характеристики імунної реактивності у віддаленому періоді після променевих уражень та виявлення типових імунних порушень проведено комлексне дослідження динаміки змін показників ІС у реконвалесцентів ГПХ з визначенням: субпопуляційного складу імунокомпетентних клітин і експресії поверхневого фенотипу методом протічної цитофлюориметрії у прямому імунофлюоресцентному тесті за допомогою панелі моноклональних антитіл серії Leu (Becton Dickinson, США ); соматичних мутацій лімфоцитів за експресією Т-клітинного рецептора; рівнів сироваткових імуноглобулінів (IgA, IgG, IgM); концентрації дрібно- і великодисперсних циркулюючих імунних комплексів. Стан активації лімфоцитів оцінювався за спонтанною та мітоген-індукованою експресією активаційних маркерів (CD25, CD71, HLA-DR). Вивчення впливу адреналiну та кортизолу на реекспресію поверхневго фенотипу та процеси мітогензалежної активації імунокомпетентних клітин проводилося в короткочасній культурі з конанаваліном A. Статистична обробка отриманих даних проводилася методами стандартної варіаційної статистики, кореляційним та регресійним аналізом.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше у віддаленому періоді після впливу іонізуючої радіації охарактеризовано значення таких факторів гуморальної регуляції, як адреналін та кортизол у модифікації антигенної структури клітинної поверхні, синтезу ДНК імунокомпетентних клітин та розвитку імунної недостатності. Встановлено можливість використання кількісних параметрів експресії поверхневого фенотипу імунокомпетентних клітин, як критеріїв оцінки функціонування імунної системи в осіб зі стійкими радіаційно-обумовленими імунодепресіями.

Практичне значення одержаних результатів. Проведене дослідження стало складовою довгострокового імунологічного моніторингу, а наявність стійких проявів функціональної недостатності Т-ланки імунітету була визначальною ознакою при формуванні груп ризику. На базі комплексного вивчення стану імунної системи дано рекомендації з індивідуалізованої корекції імунної недостатності у хворих з порушеннями імунної системи та гуморальної регуляції її функціонування. Визначені особливості рецепції катехоламінів та глюкокортикоідів є базою для розробки рекомендацiй з використання адренотропних та кортикостероідних препаратiв при соматичних захворюваннях.

Впровадження в практику. Матеріали дисертації впроваджені в практику роботи відділу клінічної імунології, відділення радіоіндукованої та загальної професійної патології Інституту клінічної радіології і поліклініки радіаційного реєстру Наукового центру радіаційної медицини АМН України. Впровадження роботи в методичних документах:

1. “Моніторинг імунної недостатності у контингентів, які постраждали внаслідок аварії на ЧАЕС“// Київ:Міністерство України з питань надзвичайних ситуацій та у справах захисту населення від наслідків Чорнобильської катастрофи. МОЗ України. АМН України. Укр. Центр наук.-мед.інформації та патентно-ліценз.роботи, 1998.- 24 с. ( співавтори Д.А. Базика, А.А. Чумак, Н.В. Бєляєва, С.В. Шевченко, Ю.В. Ніколенко).

2. “Профілактика та корекція імунної недостатності у віддаленому періоді після опромінення” // Київ:Міністерство України з питань надзвичайних ситуацій та у справах захисту населення від наслідків Чорнобильської катастрофи. МОЗ України. АМН України. Укр. Центр наук.-мед.інформації та патентно-ліценз.роботи, 1998.- 19 с. (співавтори А.А. Чумак, Д.А. Базика, Ж..М. Мінченко, Н.В. Бєляєва, С.В. Шевченко, В.О. Сушко, О.М. Коваленко, Д.М. Якименко).

Апробація роботи. Основні положення дисертації викладені в доповідях та обговорені на науково-практичній конференції “Актуальные проблемы сохранения здоровья персонала ПО “ЧАЭС” и населения прилегающих к АЭС территорий” (Київ, 1995); науково-практичній конференції з міжнародною участю “Віддалені наслідки опромінення в імунній та гемопоетичній системах” (Київ,1996); науково-практичній конференції молодих вчених, присвяченій десятиріччю Чорнобильської катастрофи (Київ, 1996); конференції, присвяченій 10-річчю відділення гематології ІКР НЦРМ України (Київ, 1997); 2-й Міжнародній конференціі “Віддалені медичні наслідки Чорнобильської катастрофи” (Київ, 1998); 1-ому Національному конгресі України з імунології, алергології та імунореабілітації (Алушта, 1998); XIX міжнародному конгресі міжнародної асоціації з аналітичної цитометрії (Colorado Springs, USA, 1998); науково-практичній конференції присвяченій 75-річчю Інституту мікробіології та імунології Білорусі (Мінськ, 1999); республіканській науково-практичній конференції “Бронхолегенева патологія у учасників ЛНА на ЧАЕС” (Київ, 1999).

За матеріалами дисертації опубліковано 11 друкованих робіт, що відтворюють основні результати досліджень.

Особистий внесок дисертанта. Автором особисто проведено цитофлюориметричні дослідження субпопуляційного складу імунокомпетентних клітин, процесів мітоген-залежної активації в осіб основної та контрольної груп. Самостійно проведено аналіз первинного матеріалу і статистичну обробку отриманих даних, виконано і сформульовано всі структурні підрозділи роботи.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 159 сторінках машинопису, ілюстрована 26 таблицями та 36 рисунками. Робота складається із вступу, огляду літератури, 4 розділів власних досліджень, заключної частини, висновків, практичних рекомендацій і списку використаної літератури, що містить 204 джерела (110 українсько- та російськомовні і 94 – латиницею).

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. В дисертації узагальнено результати дослідження 107 пацієнтів, яким в 1986 р. було встановлено діагноз гострої променевої хвороби. До основної групи увійшли реконвалесценти ГПХ 1-3 ступеню тяжкості та пацієнти , у яких при перегляді діагнозів у 1989 році діагноз ГПХ не було підтверджено через відсутность типового кістково-мозкового синдрому (ГПХ-0). Всі обстежені перебували на лікуванні у відділенні променевої патології Інституту клінічної радіології (ІКР) НЦРМ АМН України. Клінічно-імунологічне дослідження проводили, як складову частину комплексного обстеження хворих, що використовується в ІКР НЦРМ АМН України. Контрольну групу склали 40 практично здорових донорів Київської міської станції переливання крові.

Обстеження проведено в період з 1993 по 1998 рік в динаміці щорічного нагляду. Вік реконвалесцентів ГПХ складав в середньому по групах: ГПХ0 – (35+0.13)р.; ГПХ1 – (34+0.23)р. та ГПХ2-3 – (36+0.46)р. Середні дози опромінення, за даними визначення хромосомних аберацій лімфоцитів (1986), складали у групах – ГПХ0 – (0.28+0.023)Гр; ГПХ 1 – (1.07+0.064)Гр та ГПХ 2-3 – (3.00+0.16)Гр.

Більшість обстежених основної групи до аварії на ЧАЕС були практично здоровими особами. За роки після перенесеної ГПХ спостерігались виникнення та перехід до хронічної фази соматичних захворювань, формування органічної нейросудинної патології. Через 6 років після аварії спектр хронічної соматичної патології у реконвалесцентів ГПХ був сформованим. Хронічна патологія органів дихання (хронічний бронхіт) реєструвалася у 26,9 % осіб в групі з непідтвердженою ГПХ, 23% та 27,3% осіб відповідно у групах ГПХ1 та ГПХ2-3. Захворювання системи травлення у реконвалесцентів ГПХ являли себе у вигляді виразкової хвороби 12-палої кишки та шлунку (ГПХ0 – 25%; ГПХ1 – 19,2%; ГПХ2-3 – 21,2%); хронічного ерозивного гастродуоденіту (ГПХ0 – 48,1%; ГПХ1 – 53,8%; ГПХ2-3 – 48,5%); хронічного персистуючого гепатиту (ГПХ0 – 26,9%; ГПХ1 – 30,8%; ГПХ2-3 – 33,8%); хронічного холецистоангіохоліту/холециститу (ГПХ0 – 36,5%; ГПХ1 – 42,3%; ГПХ2-3 – 45,5%); хронічного коліту з дисбактеріозом ( ГПХ0 – 48,1%; ГПХ1 – 50,0%; ГПХ2-3 – 48,1%) . Сердцево-судинна патологія, – гіпертонічна хвороба, ішемічна хвороба серця, – зустрічалася у 25% реконвалесцентів ГПХ. Органічна нейросудинна патологія у вигляді дисциркуляторної енцефалопатії спостерігалася у всіх обстежених основної групи.

Таким чином аналіз спектру хронічної патології у реконвалесцентів ГПХ не виявив суттєвих відмінностей між групами в залежності від ступеню тяжкості перенесеної ГПХ, тобто вплив супутної хронічної патології на імунну систему в усіх групах обстежених можна вважати однаковим.

Дослідження імунного статусу проводили за рекомендаціями з обстеження осіб, що потерпіли від дії іонізуючої радіації (А.А. Чумак та ін., 1991; В.Г. Бебешко та ін., 1993).

Субпопуляційний склад імунокомпетентних клітин і експресію поверхневого фенотипу вивчали методом протічної цитофлюориметрії у прямому імунофлюоресцентному тесті за допомогою панелі моноклональних антитіл (МКАТ) серії Leu (Becton Dickinson, США) за рекомендаціями виробника. Набори IMK Plus включали МКАТ для двоколірного аналізу, помічені флюоресцеїну ізотіоціанатом (FITC) або фікоеритрином (РЕ), у тому числі комбінації МКАТ anti-CD45 –FITC /anti-LeuM3-PE(CD14) для трьохчасткового диференціювання лімфоцитів, моноцитів та гранулоцитів; anti-Leu4-FITC (CD3) /anti-Leu12-PE(CD19) для визначення загальної кількості Т- та В-клітин; anti-Leu3a-FITC(CD3 ) /anti-Leu2-PE(CD8) для оцінки регуляторних субпопуляцій Т-лімфоцитів; anti-Leu4-FITC (CD3) / anti-HLA-DR-(PE) для виявлення стабільних і активних Т-клітин, та активних В-клітин; anti-Leu4-FITC (CD3) /anti-Leu11-PE(CD16) та anti-Leu19-PE(CD56) для оцінки цитотоксичних Т-лімфоцитів та домінуючої субпопуляції природних кілерів. Соматичні мутації лімфоцитів в локусі Т-клітинного рецептору вивчали за допомогою комбінації МКАТ anti-Leu4-РЕ (CD3) /anti-Leu3a+b-FITC (CD4 ). Контролем слугували мікросфери “Calibrite” (Becton Dickinson, США), помічені відповідно FITC чи PE , та МКАТ до імуноглобулінів миші (FITC + PE).

Дослідження мітоген-залежної активації проведено на мононуклеарних клітинах, виділених з периферичної венозної крові (МПК) у одноступеневому градієнті фікол-верографіну. Суспензію мононуклеарів периферичної крові готували в концентрації 5 х 106 клітин/мл в повному живильному середовищі на основі RPMI-1640 (“SIGMA”, США) з додаванням до 10% ембріональної телячої сироватки (“SIGMA”, США), L-глутаміну – 300 мкг/мл, гентаміцину (“PHARMACHIM”, Болгарія) – 60 мкг/мл, HEPES (“SIGMA”, США). МПК інкубували у присутності конканаваліну А (Кон A) в концентрації 5 мкг/мл протягом 24 годин при температурі 370 С. Для вивчення впливу кортизолу та адреналіну на процеси мітогензалежної активації МПК до суспензії клітин додавали дексаметазон або адреналін в концентрації 10-12 моль/л. Після цього МПК відмивали, ресуспендували у 20 мкл забуференого фізіологічного розчину, та інкубували з МКАТ (Becton Dickinson, США ) до кластерів диференціювання CD3, CD4 (FITC) та активаційних маркерів (АМ) CD25, CD71, HLA-DR (PE). Досліджувалися спонтанна експресія, спроможність лімфоцитів in vitro відповідати на мітоген, вплив кортизолу та адреналіну на процес мітогензалежної активації. Індекс активації (ІА) обчислювався окремо для кожного АМ як відношення відсотку клітин, що експресують АМ спонтанно, до відсотку клітин, що експресують АМ після инкубації з мітогеном.

Цитофлюориметричний аналіз проводили на лазерному протічному цитофлюориметрі FACScan (Becton Dickinson, США ) у лінійному режимі підсилення для показників переднього і бічного світлорозсіювання, та у логарифмічному для інтенсивності флюоресценції у зеленому спектрі (FITC) - перший канал флюоресценції (FL-1), і у червоному спектрі (PE) - другий канал флюоресценції (FL-2). Коефіцієнти електронної компенсації спектрів флюоресценції складали 0,9% для FL-1 та 17,2% для FL-2. Математична обробка первинних даних проводилась за програмою LYSYS II на комп'ютері HP 340 (Hewlett Packard, США).

Концентрацію імуноглобулінів основних класів в сироватці крові визначали методом простої радіальної дифузії (G. Mancini et al., 1965). Визначення рівня циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) проводили в градієнті поліетиленгліколю за В. Гашковою та співавт. (1987).

Статистичний аналіз за параметричними та непараметричними критеріями проводили в електронних таблицях Excel 5.0 та Statistica 5.0 у середовищі Microsoft Windows.

Результати досліджень та їх обговорення. Динамічні дослідження субпопуляційного складу імунокомпетентних клітин та показників гуморального імунітету, проведені у 107 реконвалесцентів ГПХ в період з 1993 по 1998 рр., дозволили охарактеризувати стан імунної реактивності та виявити типові порушення в ІС у віддаленому періоді після променевого ураження.

Вивчення абсолютного та відсоткового вмісту CD3 позитивних клітин у хворих, що перенесли ГПХ, показало в цілому задовільну динаміку відновлення вмісту загальної популяції Т-лімфоцитів протягом періоду спостереження. Вміст CD3+ клітин хвилеподібно варіював за однаковим типом при всіх ступенях ГПХ. Проте, при вивченні показників інтенсивності флюоресценції антитіл до пан-Т-клітинного маркеру CD3, відмічено достовірне зниження його експресії у осіб, що перенесли ГПХ, яке було найбільш виразним у групі ГПХ-2-3 (донори – (427,8+3,22)у.о.; ГПХ0 – (401,6+2,94)у.о.; ГПХ1 – (403,2+4,15)у.о.; ГПХ2-3 – (382,4+3,65)у.о.). Співставлення отриманих результатів з даними обстежень, проведених в період до 1993 року, показує, що відновлення вмісту загальної популяції Т-клітин та Т-хелперів у хворих, які перенесли ГПХ, не супроводжується паралельним відновленням експресії CD3 та CD4 антигенів.

Віддалений період після опромінення характеризувався змінами внутрішньої організації Т-популяції лімфоцитів (табл.1). При аналізі складу CD3+ популяції встановлено, що найменшим коливанням піддається число Т-клітин, що знаходяться в стані спокою та не експресують антигенів, пов'язаних з цитотоксичністю та активацією. Показники вмісту активованих CD3+DR+ клітин характеризувалися значною варіацією, навіть на рівні середніх значень. Зміна гіперактивації Т-ланки у реконвалесцентів ГПХ-2-3 протягом 1995-96 рр., на достовірне зниження вмісту активованих клітин у наступні роки спостереження може свідчити про зростаючу декомпенсацію ІС. Відсоток осіб з проявами Т-клітинної активації був більшим у хворих на ГПХ-0, що можна пояснити наявністю резервів імунної системи у відповідь на персистування хронічної соматичної патології.

Аналіз індивідуальних коливань вмісту субпопуляцій Т-хелперів, Т-супресорів та їх співвідношення у групах осіб з неверифікованою ГПХ та у реконвалесцентів ГПХ-1 показав наявність різноспрямованих змін цих показників всередині груп. У 34% пацієнтів з ГПХ-0 та у 28% пацієнтів, що перенесли ГПХ-1, було відмічено стійке зниження імунорегуляторного індексу (ІРІ). У 18% обстежених з групи ГПХ-0 вміст Т-хелперів зберігався підвищеним протягом періоду спостереження. Стійкий дисбаланс імунорегуляторних субпопуляцій простежувався лише у групі пацієнтів ГПХ-2-3 і був зумовлений не тільки достовірним зниженням вмісту Т-хелперів, але й підвищенням вмісту Т-супресорів. Середні значення співвідношення CD4+/CD8+ та CD3+4+/3+4- лімфоцитів у групі ГПХ-2-3 лишалися достовірно низькими та виходили за нижню межу норми впродовж всього періоду спостереження. Виявлені зміни поєднувалися з високим вмістом клітин з подвійним фенотипом CD4+8+.

Таблиця 1

Вміст CD3+ ,CD4+ , CD8+ клітин периферичної крові та імунорегуляторні індекси у реконвалесцентів ГПХ

Група обстежених Роки обстеження Вміст лімфоцитів*

CD3+19-, 109/л CD3+DR+, 109/л CD4+8-, 109/л CD4-8+, 109/л CD 4+8-/4-8+ CD4+8+, %

Донори 1995-1996 1,45±0,17 0,13±0,04 1,00±0,12 0,54±0,07 1,53±0,13 1,30+0,20

ГПХ 0 1993-1994 1,25±0,04 0,14±0,03 0,69±0,03* 0,55±0,03 1,32±0,15 1,56+0,34

1995-1996 1,42±0,08 0,22±0,03** 0,78±0,05 0,68±0,06 1,24±0,09 1,83+0,25*

1997-1998 1,53±0,16 0,13±0,03# 0,78±0,07 0,71±0,11 1,42±0,10 1,06+0,12

ГПХ 1 1993-1994 1,51±0,13 0,18±0,05 0,90±0,15 0,60±0,09 1,62±0,14 0,79+0,22

1995-1996 1,52±0,10 0,18±0,03 0,85±0,08 0,74±0,08 1,34±0,16 1,50+0,25

1997-1998 1,35±0,14 0,10±0,02## 0,75±0,08 0,62±0,06 1,32±0,08# 1,36+0,23

ГПХ 2-3 1993-1994 1,44±0,19 0,23±0,06** 0,79±0,14 0,70±0,03* 1,11±0,11** 2,56+0,48*

1995-1996 1,59±0,13 0,26±0,06** 0,85±0,08 0,81±0,07* 1,14±0,08* 2,21+0,30*

1997-1998 1,33±0,14 0,09±0,01## 0,70±0,07* 0,68±0,07 1,10±0,07** 1,82+0,41*

Примітки:

1. *– різниця з контрольною групою із ступенем достовірності p<0,05

2. ## - відмінність від показників попередніх років в тій самій групі із ступенем достовірності p<0,01

У віддаленому періоді зберігалися зміни, початково зареєстровані як нагромадження клітин з фенотипом кортикальних тимоцитів, при зниженні загальної субпопуляції Т-хелперів (Д.А.Базика та ін., 1998), що свідчить про сталі порушення диференціювання ІКК на тимічному та посттимічному етапах.

Результати досліджень радіогенного пошкодження імунокомпетентних клітин за вмістом соматичних мутацій Т-лімфоцитів, які втратили пан-мітогенний маркер CD3, показують, що радіаційний мутагенез може бути визначений і через 12 років після радіаційного ушкодження. Кількість варіантних форм лімфоцитів у осіб, які хворіли на ГПХ, лишається підвищеною. Встановлено залежність між вмістом варіантних CD3-4+ лімфоцитів у віддаленому періоді після опромінення та дозою опромінення. Коефіцієнти кореляції між цими параметрами на етапах спостереження 1993-94 рр. і 1995 – 96 рр. складали відповідно - r = 0,61 (n = 21, p<0,05) та r = 0,37 (n= 72, p<0,05). В більш пізні терміни залежність простежувалася в діапазоні доз від 1 до 5 Гр.

Стійку активацію В-лімфоцитів виявлено у хворих після ГПХ-2-3, в яких вміст В-лімфоцитів та експресія на них HLA-DR антигену залишалися достовірно підвищеними і не змінювалися протягом 1993-1998 рр (табл.2).

Таблиця 2

Відсотковий склад субпопуляцій В-лімфоцитів та вміст імуноглобулінів основних класів в периферичній крові реконвалесцентів ГПХ

Група Роки обстеження CD3-19+, % CD3-DR+, % IgA, г/л IgG, г/л IgM, г/л

Донори 7,90±0,66 8,21±0,59 2,00±0,10 11,05±0,32 1,13±0,05

ГПХ 0 1993-1994 6,79±0,68 12,49±2,59 1,98±0,09 12,00±0,36 1,07±0,06

1995-1996 9,12±0,45 10,14±0,42* 2,26±0,13 11,42±0,40 1,05±0,08

1997-1998 8,95±0,57# 11,66±0,64* 1,82±0,10 10,27±0,40 1,11±0,07

ГПХ 1 1993-1994 7,48±1,36 10,25±2,02 1,75±0,16 10,84±0,35 1,17±0,11

1995-1996 8,85±0,97 9,42±1,05 1,97±0,11 10,43±0,45 0,99±0,10

1997-1998 10,80±1,44# 13,25±1,59* 1,82±0,15 9,56±0,34* 1,08±0,07

ГПХ 2-3 1993-1994 10,63±1,21* 11,09±1,23* 1,94±0,12 12,32±0,56 1,06±0,07

1995-1996 10,16±0,77* 11,47±0,79* 1,74±0,11 11,22±0,49 0,84±0,07*

1997-1998 10,22±1,00* 13,29±1,11* 1,84±0,09 10,28±0,34 1,05±0,08

Примітки:

1. * – різниця з контрольною групою із ступенем достовірності p<0,05

2. # - відмінність від показників попередніх років в тій самій групі із ступенем достовірності p<0,05

У групах ГПХ-0 та ГПХ-1 встановлено стійку тенденцію до зростання показників, що в 1997-98 рр. вже не відрізнялися від таких для групи хворих з ГПХ2-3. Збільшення абсолютного та відсоткового вмісту активованих В-клітин в групі ГПХ-0 поєднувалось з підвищенням вмісту імуноглобулінів IgM та IgG, тоді як для реконвалесцентів ГПХ 2-3 більш характерними були прояви гіпоімуноглобулінемії.

Кількісний склад природних кілерів та цитотоксичних лімфоцитів не мав значних розбіжностей як з даними контрольної групи, так і з відомими з літератури даними про їх вміст у здорових осіб відповідного віку.

Таким чином, комплексне дослідження динаміки змін показників ІС за період з 1993 по 1998 рр. у реконвалесцентів ГПХ показало наявність змін імунної реактивності у віддаленому періоді після променевих уражень в залежності від ступеню тяжкості перенесеної ГПХ.

Вивчення індивідуальної динаміки вмісту основних регуляторних субпопуляцій дозволило сформувати групу пацієнтів, у яких значення ІРІ виходили за нижню межу норми протягом всього періоду спостереження та за середніми показниками виявилися вдвічі нижчими порівняно з контролем. Тривалий дисбаланс регуляторних субпопуляцій у групі пацієнтів з неверифікованою ГПХ поєднувався з підвищеним вмістом активованих Т-клітин та цитотоксичних - CD3+16+56+ лімфоцитів. У хворих, що перенесли ГПХ-1, зниження імунорегуляторного індексу супроводжувалось зниженням вмісту CD3+DR+ клітин та ПК, гіпоімуноглобулінемією IgА при незміненій, порівняно з контролем, кількості В - лімфоцитів. У групі ГПХ-2-3 переважали зміни з боку В лімфоцитів - підвищення вмісту CD3-19+ та CD3-DR+ субпопуляцій, що поєднувалося зі зниженою продукцією Ig М.

Встановлено наявність зворотного кореляційного зв'язку між дозою опромінення та відносним вмістом CD3+4+ лімфоцитів-хелперів (r= -0,520), а також між дозою опромінення та ІРІ (r= -0,480). Прямий кореляційний зв'язок встановлено між дозою опромінення та вмістом лімфоцитів-супресорів (r= 0,507).

Регресійний аналіз з використанням поліноміальної моделі показав, що зниження вмісту хелперів нижче нормальних значень було характерним для осіб з дозами понад 2 Гр. Вміст супресорної популяції зростав у дозовому інтервалі до 2,5 Гр, після чого подальшого істотного приросту не спостерігалось.

У пацієнтів зі стійкими депресіями імунітету встановлено збереження залежності “доза-ефект”, про що свідчить наявність зворотного кореляційного з'вязку між дозою опромінення та вмістом лімфоцитів-хелперів та прямого кореляційного з'вязку між дозою опромінення та вмістом супресорів. Стійкий корелятивний зв'язок між вмістом клітин з соматичними мутаціями та дозою опромінення, визначеною методами біологічної дозиметрії, також був характерним передусім для діапазону доз від 1 до 5 Гр. Водночас результати регресійного аналізу з використанням поліноміальної моделі вказують, що у хворих з дозами більшими, за 5 Гр, істотного збільшення абсолютного числа соматичних мутацій не визначалося. Це може пояснюватися звуженням масштабу реагування імунної системи на опромінення при досягненні певної дози, або ж збільшеними темпами елімінації мутантних клітин. При дозах менших, за 1 Гр у пацієнтів із зниженим ІРІ, визначалася тенденція до зниження числа мутантних клітин, що в поєднанні з наведеними нижче даними вивчення проліферативної активності може вказувати на підвищення темпів репарації та відмінності в абслолютному числі лімфоцитів периферичної крові.

Спонтанні рівні експресії таких активаційних антигенів, як CD25, HLA-DR, CD71, також залежали від ступеню ГПХ (табл.3).

У групі ГПХ-0 переважали прояви активації Т-ланки. Підвищення вмісту CD3+DR+ клітин супроводжувалось односпрямованими змінами вмісту CD4+25+ клітин, та поєднувалося з високою експресією рецепторів до ІЛ-2 (CD25), трансферину (CD71) та HLA-DR антигену.

Таблиця 3

Вміст активованих Т-клітин та інтенсивність флюоресценції (Fl) поверхневих антигенів активаційних маркерів

Вміст клітин (%) та інтенсивність флюоресценції (у.о.) за кластерами диференціювання Група обстежених

Донори ГПХ 0 ГПХ 1 ГПХ 2-3

CD3+DR+ клітини,% 5,50+0,84 12,39+0,69* 4,57+1,14 8,86+0,77*

Fl DR+,у.о. 372,4+3,41 389,6+7,60* 379,4+7,60 384,7+4,64*

CD4+25+ клітини, % 2,99+0,35 6,35+1,41* 2,68+1,19 2,70+1,35

Fl CD25+,у.о. 416,1+6,58 441,8+8,63* 423,4+3,05 424,1+7,28

CD3+71+ клітини,% 3,97+0,35 1,75+0,12* 1,63+0,27* 3,02+0,59

Fl CD71+,у.о. 328,2+4,65 346,3+2,48* 353,0+2,95* 327,4+2,15

Примітка.* - різниця з контрольною групою із ступенем достовірності р<0,05

Середні значення вмісту активованих лімфоцитів та експресії АМ в групі ГПХ-1 не відрізнялись від відповідних показників контрольної групи за винятком CD71+ клітин, вміст яких був достовірно зниженим, але супроводжувався підвищенням експресії CD71 антигену. В групі ГПХ-2-3 найбільш помітні зміни виявлено з боку В-клітин. На рівні середніх значень вміст активованих В-лімфоцитів та експресія активаційних маркерів перевищували верхню межу норми.

Оцінка інтенсивності проліферативної відповіді лімфоцитів на мітоген також свідчила про наявність значних відмінностей між групами ГПХ (рис.). Вплив Кон А на вміст CD3+, CD4+ клітин та експресію Т-клітинних антигенів у хворих після ГПХ, виявив відмінності від контрольноі групи або за напрямком змін, або за їх виразністю. Відповідь Т-лімфоцитів на мітоген у осіб, що перенесли ГПХ, залежала передусім від початкового вмісту активованих клітин.

Високий рівень спонтанної активації Т-клітин у пацієнтів після ГПХ-0 зумовив інвертовану відповідь лімфоцитів на мітоген, про що свідчили менші за одиницю індекси активації для всіх АМ, тобто наявність ендогенної активації призводить до виснаження спроможності до відповіді на додатковий антигенний стимул. Для групи ГПХ-1 характерним було уповільненням інтенсивності проліферативних процесів з односпрямованим зниженням кількості позитивних клітин та експресії Т-клітинних антигенів у відповідь на Кон А. У осіб, які перенесли ГПХ-2-3, затримка проліферативної відповіді спостерігалася вже на початкових

Рис. Відсотковий вміст активованих клітин в залежності від послідовності презентації активаційних маркерів на етапах проліферативного циклу

етапах (CD25), це з великою імовірністю свідчило про збереження у віддаленому періоді після опромінення блокування проліферативного циклу Т-клітин в G1-S інтервалі. Низька відповідь на мітогенний стимул може бути пов'язана з дефіцитом синтезу ІЛ-2 та зниженням функціональних резервів Т-клітин.

Таким чином, через 6-12 років після радіаційного ушкодження у реконвалесцентів ГПХ виявляються зміни вихідних рівнів експресії активаційних антигенів та пов'язані порушення процесів мітоген-залежної активації імунокомпетентних клітин. Наявність розбіжності на рівні середньогрупових показників між пацієнтами з різними ступенями тяжкості променевого ураження та поглиненими дозами свідчить про нелінійний характер запуску активаційних механізмів у віддаленому періоді після опромінення з пороговими значеннями включення компенсаторних реакцій в межах 0,8-1,0 Гр. Виснаження клітинних механізмів активації підтверджується комбінацією низької відповіді на мітоген з депресивними змінами в Т-ланці імунної системи у хворих, що перенесли ГПХ 2-3.

Модуляція дексаметазоном та адреналіном відповіді лімфоцитів на мітоген виявила значні порушення чутливості ІКК до стрес-факторів у реконвалесцентів ГПХ. У осіб з неверіфікованою ГПХ під впливом дексаметазону спостерігалася тенденція до зростання експресії АМ всіх стадій активації. Проте, беручи до уваги наявність значної ендогенної активації у цій групі обстежених, можна вважати, що дексаметазон сприяє послабленню дії мітогену на лімфоцити. В групі реконвалесцентів ГПХ-1 пригнічуюча дія дексаметазону була менш виразною порівняно з контрольною групою, а у осіб, що перенесли ГПХ 2-3 ступеню достовірне зниження вмісту активованих клітин було характерним тільки для CD4+25+ популяції.

Аналіз індивідуальної динаміки змін вмісту активованих клітин під впливом дексаметазону та адреналіну у реконвалесцентів ГПХ показав, що у віддалений період після радіаційного впливу визначаються порушення гормональної регуляції імунної відповіді. Основні типи реакцій на мітоген та її модуляцію дексаметазоном та адреналіном включають:

1) Кон A-залежну активацію Т-лімфоцитів та її пригнічення адреналіном та дексаметазоном (типова реакція);

2) дискоординацію спонтанної експресії активаційних маркерів;

3) парадоксальну відповідь на стрес-фактори.

Одним з факторів формування віддалених порушень в ІС у реконвалесцентів ГПХ є тривала активація ГКАС. Гіперкортизолемія в періоді реконвалесценції призводила до зменшення кількості Т-лімфоцитів переважно за рахунок субпопуляції CD4+ хелперних клітин. Зростаючий гіперкортицизм в періоді реконвалесценції та формування середньострокових ефектів опромінення призводили до активації, підсилення проліферації та прискореного дозрівання ІКК, про що свідчить наявність прямої кореляційної залежності між вмістом кортизолу та CD3+HLA-DR+ і CD4+8+ лімфоцитів. Отримані результати можуть відображувати стадію напруження адаптаційних процесів в ІС, спрямованих на компенсацію функційної недостатності ефекторних клітин.

У віддаленому періоді після опромінення гіперкортизолемія асоціювалася зі зниженим об'ємом CD3+HLA-DR+ субпопуляції та не впливала на вміст недозрілих CD4+8+ клітин. В сукупності із закріпленням депресивного впливу гіперкортизолемії на загальний вміст CD3+ лімфоцитів це може бути свідченням переходу до стадії виснаження компенсаторних можливостей імунної системи.

ВИСНОВКИ

У віддаленому періоді після опромінення виявляються порушення чутливості імунокомпетентних клітин до регуляторних впливів адреналіну та кортизолу. Тривала гіперкортизолемія є одним з факторів формування віддалених ефектів опромінення в імунній системі. Визначення особливостей кількісних параметрів експресії поверхневого фенотипу імунокомпетентних клітин і рецепції катехоламінів та глюкокортикоідів може бути використано для підвищення ефективності діагностики радіаційно-обумовлених імунодепресій та слугувати базою для наступної розробки оптимальної стратегії моніторингу та корекції.

1.Імунні депресії віддаленого періоду після опромінення визначаються тяжкістю променевого ураження гострого періоду, поглиненою дозою, вмістом аберантних клітин, що згубили пан-мітогенний рецептор та тривалістю збереження гіперкортизолемії.

2. Тип активаційних змін через 6-12 років після опромінення залежить від ступеня тяжкості перенесеної ГПХ.. Висока спонтанна експресія активаційних маркерів (CD71, CD25, HLA-DR) у пацієнтів з неверіфікованою ГПХ зумовлювала зниження мітоген-залежної активації. В групі хворих, що перенесли ГПХ 1 ступеня, встановлено дискоординацію експресії антигенів різних фаз циклу з нормальним вмістом СD25+ та HLA-DR+ клітин та зниженим - СD71+ клітин, що спричиняє помірне зниження Кон A-індукованої проліферації. У пацієнтів, що перенесли ГПХ 2-3 ступенів тяжкості встановлено зміну гіперактивації Т-ланки на достовірне пригнічення зі зниженням мітоген-залежних активаційних реакцій та виразними депресивними змінами в Т-ланці імунної системи, що свідчить про виснаження клітинних механізмів активації при перевазі гуморальних реакцій.

3. У пацієнтів зі стійкими депресіями імунітету показана наявність зворотнього кореляційного зв'язку між дозою опромінення та відносним вмістом CD3+4+ лімфоцитів-хелперів (r=-0,520), а також між дозою і співвідношенням CD3+4+ до CD3+4- клітин (r = -0,480). Прямий кореляційний зв'язок встановлено між дозою опромінення та відносним вмістом Т- супресорів (r = 0,507), але вміст супресорної популяції зростав лише в дозовому інтервалі від 0,2 до 2,5 Гр.

4. У віддаленому періоді після опромінення на фоні депресії імунної системи зберігається залежність “доза-ефект” між вмістом клітин зі зниженою експресією Т-клітинного рецептора та дозою опромінення в діапазоні поглинених доз від 1 до 5 Гр.

5.Порушення гуморальної регуляції імунної відповіді у віддаленому періоді після опромінення проявляються відсутністю супресивного впливу адреналіну та дексаметазону на процеси реекспресії CD3 та CD4 антигенів та мітогенну відповідь.

6. Причиною пригнічення Т-клітинної ланки з поступовим виснаженням компенсаторних можливостей імунної системи може виступати тривале збереження гіперкортизолемії в періодах реконвалесценції та формування середньострокових ефектів опромінення (перші 5 років).

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. У віддаленому періоді після опромінення імунологічні порушення є складовою частиною пізніх радіаційних ефектів, тому у процесі диспансерного нагляду осіб з високими поглинутими дозами імунологічний контроль необхідний як з діагностичною, так і з прогностичною метою.

2. Окрім стандартної оцінки основних регуляторних субпопуляцій доцільно визначати мутації в локусі Т-клітинного рецептора (ознака низького темпу відновлення імунної системи) та індивідуальну реакцію на адреналін та кортикостероїди, яка повинна враховуватись при лікуванні соматичних захворювань.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ЩО НАДРУКОВАНІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Азарскова М.В. Вплив дексаметазону на процеси мітогензалежної активації лімфоцитів in vitro у віддалений період після опромінення // Український науково-медичний молодіжний журнал. - 1997.- N1-2.- С. 7-9.

2. Азарскова М.В. Особливості адренергічної регуляції активації лімфоцитів in vitro у віддалений період після опромінення // Гематологія та переливання крові. - 1998. - N29. - С. 167-170.

3. Шевченко С.В., Азарскова М.В., Чумак А.А. До питання про варіації структурних та функціональних характеристик імунітету у осіб, що потерпіли внаслідок аварії на ЧАЕС, у віддаленому періоді після опромінення // Український науково-медичний молодіжний журнал .- 1998. - N1. - С. 52-55 .

4. Азарскова М.В. Особливості імунної реактивності у реконвалесцентів гострої променевої хвороби у віддаленому періоді після опромінення // Український науково-медичний молодіжний журнал. – 1999. - N1-2. - С. 21-24.

5. Азарскова М.В. Неспецифическая стимулирующая терапия при пострадиационной иммунологической недостаточности // Сб.статей к 10-летию гематологического отделения ИКР НЦРМ АМН Украины “Современные проблемы радиационной медицины”.-1997.-С 26-29.

6. Чумак А.А., Базыка Д.А., Беляева Н.В.., Азарскова М.В., Минченко Ж.Н., Плескач О.Я., Мищенко Л.П. Иммунологические эффекты у реконвалесцентов острой лучевой болезни – результаты тринадцатилетнего мониторинга // Международный журнал радиационной медицины.- 2000.- N. 1(5).- C.65-82.

7. Азарскова М.В. Митоген-зависимая активация иммунокомпетентных клеток и механизмы гуморальной ее регуляции в отдаленный период после радиационного поражения // Віддалені наслідки опромінення в імунній та гемопоетичній системах: Тез. доп. наук.-практ. конф.- К.,1996.-С.25-26

8. Чумак А.А., Базика Д.А., Мінченко Ж.М., Беляева Н.В., Азарскова М.В., Хромяк В.М., Шевченко С.В. Розробка основ імунологічного моніторингу контингентів, що постраждали внаслідок аварії на ЧАЕС, у віддаленому періоді після опромінення // Наука. Чорнобиль-96: Тез.доп.наук.-практичн.конф. 11-12 лютого 1997. К., 1997.- С.181-182.

9. Базыка Д.А., Беляева Н.В., Азарскова М.В., Чумак А.А. Рецепторные системы лимфоцитов при хроническом облучении // Материалы 2-й Международной конференции Отдаленные медицинские последствия Чернобыльской катастрофы, Киев, 1-6 июня 1998 г..-К.:Чернобыльинтеринформ,1998,- С. 176-177.

10. Bazyka D., Beliaeva N., Azarskova M., Chumak A. CD4+ lymphocytes in early and remote periods after radiation exposure // ISAC XIX International Congress. 28 February - 5 March, 1998.-Colorado Springs, Colorado.- USA, CS45.

11. Азарскова М.В. Митогензависимая активация иммунокомпетентных клеток у пациентов, перенесших острую лучевую болезнь // Инфекция и иммунитет. Материалы респ.науч.-практ. Конф, посв.75-летию БелНИИЭМ. Минск: Белорусское издательское товарищество “Хата”.- 1999.- С.533-534

Азарскова М.В. Пристосувальні реакції імунної системи у реконвалесцентів гострої променевої хвороби у віддаленому періоді після опромінення. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.01 – радіобіологія. – Нуковий центр радіаційної медицини АМН України , Київ, 2002.

В дисертації відображені результати комплексного клініко-імунологічного дослідження 107 хворих, що потерпіли від гострої променевої хвороби. Встановлено значення кортизолу та адреналіну, як факторів гуморальної регуляції у модифікації антигенної структури поверхні імунокомпетентних клітин та розвитку імунної недостатності. В результаті виконання роботи встановлено можливість використання кількісних параметрів експресії поверхневого фенотипу імунокомпетентних клітин як критеріїв оцінки функціонування імунної системи в осіб з стійкими радіаційно-обумовленими імунодепресіями. Дано характеристику імунної реактивності у хворих в віддаленому періоді після променевих уражень. Вивчено особливості мітоген-залежної активації імунокомпетентних клітин, проведено порiвняльне вивчення впливу адреналiну, кортизолу на поверхневий фенотип та процеси мітогензалежної активації. Основні результати роботи знайшли своє практичне застосування при організації довгострокового імунологічного моніторингу та формуванні груп ризику після радіаційного ураження.

Ключові слова: iонiзуюче опромiнення, гостра променева хвороба,