УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА

АРТЕМЕНКО Олексій Борисович

УДК 636.5.082.453.5:611-013.11

НИЗЬКОТЕМПЕРАТУРНА КОНСЕРВАЦІЯ СТАТЕВИХ

І ЕМБРІОНАЛЬНИХ КЛІТИН ПТИЦІ.

03.00.20. – біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

ХАРКІВ – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії клітинної інженерії відділу репродукції птиці Інституту птахівництва УААН.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, академік УААН Сахацький Микола Іванович, директор Інституту птахівництва УААН.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Вишневський Валентин Йосипович, Інститут тваринництва УААН, головний науковий співробітник.

кандидат сільськогосподарських наук Медведовський Олександр Вікторович, Харківський біотехнологічний центр УААН, директор.

Провідна установа: Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН (м.Харків), лабораторія біотехнології та біохімії.

Захист дисертації відбудеться21.05.2002 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 65.356.02 при Інституті тваринництва УААН за адресою: 62404, Харківська обл., Харківський р-н., п/в Кулиничі.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту тваринництва УААН за адресою: 62404, Харківська обл., Харківський р-н., п/в Кулиничі.

Автореферат розісланий 18.04.2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Проніна В.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Традиційний шлях збереження рідкісних порід і популяцій птиці передбачає щорічне відтворення стада, що пов'язано з рядом організаційних, господарських труднощів, великими матеріальними витратами. Так, при розведенні малочисельних порід для запобігання зростанню інбридингу, дрейфу генів необхідне застосування таких трудомістких прийомів, як система ротаційно-панміктичного відтворення, поліспермне осіменіння, підбір пар для спарювання і одержання від кожної з них однакової кількості нащадків, створення в країні мережі дублюючих один одного колекційних господарств. Тому пошук інших, більш дешевих і надійних методів збереження генофонду птиці, є важливим завданням. Таким методом є низькотемпературна консервація геномів. При цьому можливо зберігання генетичної інформації в низькотемпературних банках протягом багатьох років та десятиріч без значних матеріальних і фізичних витрат.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Основні положення дисертації розроблені в лабораторії клітинної інженерії та кріоконсервації генетичних ресурсів Інституту птахівництва УААН при виконанні планових досліджень по розділах: 41.05.01H "Удосконалити методи і прийоми зберігання, використання резервних ліній, місцевих рідкісних порід" (номер державної реєстрації 01870085916) в 1986-1990 рр.; 02.02 "Розробити методи одержання монозиготних близнюків і клонування птиці" (номер державної реєстрації UA01000703P) державної програми України на 1991-1995 рр. "Фундаментальні дослідження"; 01.04.01ф. "Розробити методичні підходи до використання геномів бластодермальних клітин птиці для одержання живих організмів" (номер державної реєстрації 0197V009424) в 1996 - 2000 рр.

Мета і завдання досліджень. Мета роботи полягала в розробці ефективних технологій низькотемпературної консервації геномів птиці, зокрема статевих і ембріональних клітин. На виконання були поставлені такі завдання:

1) удосконалити технологію заморожування сперми гусаків;

2) розробити експрес-метод визначення запліднюючої здатності сперми півнів;

3) розробити технологію заморожування сперми півнів;

4) експериментально обґрунтувати можливість низькотемпературної консервації суспензії ембріональних клітин курей.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розроблені високорезультативні технології низькотемпературної консервації сперми гусаків, півнів, ембріональних клітин курей в облицьованих гранулах і пайєтах. Вперше розроблені лабораторні експрес-методи, які передбачають використання, як флуорохром, тiазiновий червоний i етiдiум бромiд або a-нафтiламiн та дозволяють з високої точністю (коефіцієнт кореляції r=0,97) визначити запліднюючу здатність сперми півнів за 5-10 хвилин. Також розроблені лабораторні тести визначення життєздатності ембріональних клітин курей до і після їх низькотемпературної консервації.

Наукова новизна розроблених технічних рішень захищена авторськими свідоцтвами СРСР на винаходи: 1) №1329780 "Спосіб визначення якості сперміїв"; 2) №1475645 "Спосіб визначення запліднюючої здатності сперміїв птахів"; 3) №1524882 "Спосіб кріоконсервації сперми птиці".

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені технології дають змогу здійснювати низькотемпературну консервацію сперми гусаків і півнів при забезпеченні її запліднюючої здатності на високому рівні. При осіменінні курей розмороженою спермою заплідненість яєць складає 75-85%, у гусей - 85-90%, що майже відповідає показникам, які спостерігаються при природному паруванні птиці цих видів. При кріоконсервуванні ембріональних клітин курей, 80-90% при цьому зберігають життєздатність.

Розроблені технології дозволяють на практиці здійснювати збереження геномів птиці (статевих, ембріональних клітин) в низькотемпературних банках. Такий банк створено при Інституті птахівництва УААН. В нього закладена на зберігання сперма півнів 13 рідкісних порід, популяцій і ліній (7350 спермодоз), а також суспензія клітин 840 ембріонів. Розроблені технології передбачають консервацію сперми гусаків, півнів, ембріональних клітин в облицьованому вигляді, що створює ряд істотних переваг порівняно з іншими відомими технологіями. Зокрема значно покращується маркування зразків, які закладаються на зберігання в крiобанк, а також запобігається їх механічне та мікробне забруднення протягом зберігання.

Розроблені експрес-методи визначення життєздатності статевих та ембріональних клітин дають змогу суттєво прискорити проведення пошукових досліджень по їх низькотемпературній консервації. Таки методи можуть знайти застосування в експериментальній ембріології, крiобiологiї, ембрiоiнженерiї, а також в навчальному процесі по "ембрiологiї" для студентів зооiнженерних, біологічних і ветеринарних факультетів.

Ембріональні клітини, що зберігаються в створеному низькотемпературному банку, можуть бути використані при проведенні досліджень в галузі клітинної інженерії, у клонуванні особин з передбаченими генетичними параметрами. Статеві клітини півнів, що зберігаються в банку протягом 3-9 років, вже були використані в 2001 році при створенні трьох рідкісних популяцій курей (голошийні, падуан, українські вушанки), які передані в колекційне стадо дослідного господарства “Борки” для зберігання.

Особистий внесок здобувача. Дисертант виконав роботу самостійно. Методологія і схема досліджень були розроблені спільно з науковим керівником. Із спільних досліджень і публікацій дисертант використав для оформлення роботи лише особисто виконану частину результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались на наукових конференціях, семінарах, симпозіумах: 2-ій Республіканській науково-технічній конференції молодих вчених, аспірантів і спеціалістів (м. Харків, 1986 р.); Науково-технічній конференції "Проблеми промислового виробництва пташиного м'яса" (Варна, Болгарія, 1987 р.); Міжнародній конференції "Досягнення і перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини" (м. Харків, 1988 р.); Українській конференції з міжнародною участю "Актуальні проблеми сучасного птахівництва" (м. Харків, 1991 р.); Робочій нараді "Консервація генетичних ресурсів" (Пущино, 1992 р.); Українській конференції молодих вчених, аспірантів з питань птахівництва (Борки, 1992 р.); XII-у Міжнародному конгресі по репродукції тварин (Нідерланди, 1992 р.); I-ій Українській конференції по птахівництву (Борки, 1993 р.); 9-у Європейському конгресі по птахівництву (Глазго, Великобританія, 1994 р.); 11-у Міжнародному симпозіумі "Проблеми генетики птиці (Краків, Польща, 1995 р.); 10-у Європейському симпозіумі по водоплавній птиці (Галле, Німеччина, 1995 р.); II-ої Українській конференції по птахівництву (Борки, 1996р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 робіт, в тому числі, одержано 3 авторських свідоцтва на винаходи.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 135 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 22 таблицями і 17 рисунками. Робота складається із вступу, огляду літератури, розділу особистих досліджень, який включає матеріал і методи досліджень, результати досліджень з їх обговоренням, заключення, висновки і практичні рекомендації, списку використаної літератури. Список літератури налічує 203 найменувань.

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження виконані в лабораторії клітинної інженерії Інституту птахівництва Української академії аграрних наук. При цьому використовували гусей великої сірої і рейнської порід, курей порід род-айленд, білий леггорн, юрлівська голосиста, австралорп, голошийна, єреванська, італійська куріпчаста, калiфорнійська смугаста. Годівлю і утримання дослідної птиці проводили за раціонами, розробленими відділом фізіології, біохімії і годівлі птиці Інституту птахівництва УААН згідно із загальноприйнятими нормами.

Сперму від гусаків одержували методом масажу. При її заморожуванні використовували, як контроль, відомий метод технології (Сахацький М.І.,1984). При вивченні можливості заморожування сперми гусаків в облицьованих гранулах в кожній серії досліду використовували по 10 облицьованих гранул, які заморожували зі швидкістю 50°С/хв. до -196°С. При досягненні в процесі охолодження температур -58, -78, -86, -90, -98, -101, -105, -113, -196°С проводили розморожування одного зразка, в якому враховували рухливість і абсолютний показник живучості сперматозоїдів. Одержані дані використовували для удосконалення режиму охолодження сперми гусаків. Для удосконалення режиму розморожування проводили серію лабораторних досліджень, а після цього застосували штучне осіменіння гусок спермою, розмороженою при різних температурах.

Сперму від півнів також одержували методом масажу. Враховували об'єм еякуляту (мл), концентрацію сперматозоїдів (млрд/мл), рухливість (в балах за десятибальною шкалою), кількість клітин з неушкодженими акросомами та мембранами голівок (у відсотках). Концентрацію сперматозоїдів визначали в камері Горяєва або фотоелектрокалориметричним методом. Рухливість сперматозоїдів оцінювали під мікроскопом (х450) в термостолику при 37°С. Визначення кількості сперматозоїдів з цілими і ушкодженими мембранами голівок здійснювали по методу (Halangk W., Bohnensack R., 1982), з використанням розроблених нами флуорохромів етідіум бромід (2,7-дiамiно-10-етил-9-фенiлфенантрiдiум бромiд) та a-нафтіламіну.

Вивчили ефективність використання як флуорохромів таких сполук: акрiдiновий оранжевий, ауромiн 00, кальцеїн, конго червоний, корiфосфiн, метиленовий зелений, a-нафтiламiн, тетразолiєвий синій, тетрациклiн, тiазiновий червоний, примулiн, хiнiн, флуоресцеїн, еозiн. Кращі результати були одержані при використанні етiдiум бромiду і тiазiнового червоного в концентрації 10-6М і 5х10-4 - 5х10-5М відповідно або a-нафтiламiн в концентрації 5х10-4- 5х10-5М в фосфатно-соляному буфері.

Підготовку сперми до заморожування проводили в холодильній камері, а крiоконсервацію в парах азоту з використанням програмного охолоджувача. Температуру контролювали в одному із зразків хромкраплевою термопарою, яку приєднували до самописця Н-306. Враховували такі параметри: час плато кристалізації зразків (t пл.) і швидкість заморожування (°С/хв.). Розморожування сперми здійснювали у водяній бані при +40°С.

При проведенні досліджень по оптимізації складу захисного середовища застосовували, як контроль, відоме середовище (Курбатов О.Д. та інші,1984) та метод оптимального планування експерименту з використанням плану Плакетта-Бауера (Адлер Ю.П. та ін., 1976). При вивченні дії осмотичного тиску захисних середовищ на результативність крiоконсервацiї їх осмолярність доводили до 50, 150, 300, 350, 380, 450 мОсм. Штучне осіменіння курей проводили за режимом: два дні підряд, надалі - один раз в 3-4 дні. При цьому кожній із них вводили по 0,12 мл заморожено-відтаяної сперми, що становило 70 - 90 млн. активних сперміїв. Зібрані по піддослідних групах курей яйця інкубували в інкубаторі "Унiверсал-55". Заплідненість яєць визначали на 7 добу їх інкубування овоскопуванням або при розтині.

Як джерело ембріональних клітин використовували ембріони, одержані з яєць курей. Виділення ембріонів з яєць здійснювали методом Lucas і Jamros (1961) за нашою модифікацією. Оцінювали якість ембріональних клітин по співвідношенню цілих і ушкоджених шляхом фарбування етiдiум бромiдом фірми "Gibco". Підраховували біля 200 - 300 клітин. При заморожуванні ембріональних клітин використовували такі хімічні сполуки: диметилсульфоксид (ДМСО), гліцерин (ГЛ), етиленгліколь (ЕГ), пропiленгліколь (1,2-пропандiол) (ПГ). Кінцева концентрація кожного з цих крiопротекторів становила 10%. Суспензію клітин розфасовували в поліетиленові трубки типу "СЖ" (ТУ 6-19-263-427-87) та охолоджували на програмному заморожувачі ЗСП-1. Розморожування зразків проводили у водяній бані при +40°С.

Статистичну обробку результатів досліджень проводили методом Фiшера-Стьюдента (Плохинский Н.А., 1969).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Удосконалення технології заморожування сперми гусаків.

Мета цих досліджень полягала в такому удосконаленню відомої технології (Сахацький М.І., 1984), яке давало б можливість проводити консервування сперми гусаків у вигляді облицьованих гранул. При проведенні пошукових досліджень в напрямку вивчення різних матеріалів вибір було зроблено на використанні облицювального матеріалу, поліетиленової трубки, яка застосовується в Харківській технології кріоконсервації сперми бугаїв.

Результати досліджень по розробці режиму охолодження сперми гусаків у вигляді облицьованих гранул об'ємом 0,3 мл наведені на рис. 2. Вони свідчать про те, що рухливість сперміїв починає різко знижуватися після охолодження зі швидкістю 50 - 60°C/хв. до температури -90°C і нижче. Але абсолютний показник живучості сперміїв свідчить, що погіршення їх життєздатності починається раніше, при охолодженні до температури -86°C. Тому доцільно застосовувати режим охолодження, який передбачав би перехід з однієї швидкості на іншу при температурі зразків -86°С. Це положення було використано при експериментальному обґрунтуванні режиму охолодження сперми гусаків за двома ступенями: спочатку від 0°С до -86°С - із швидкістю 50°C/хв., потім - до -196°C із швидкістю 8 - 15°C/хв.

Застосування облицювального матеріалу спричинило також проведення досліджень щодо необхідності внесення змін в відомий режим розморожування сперми. За допомогою методу біологічного контролю було визначено, що розморожування необхідно проводити за ступінчастим режимом, а саме: протягом 1 хвилини у водяній бані при 0 - 2°C, а після цього при 40°C до зникнення твердої фази в гранулах. Заплідненість яєць при вживанні такої сперми для осіменіння гусей склала 91,0±2,2 (таблиця 1.).

Таблиця 1. Запліднююча здатність сперми гусаків залежно від температури її розморожування.

№№пп Температура водяної бані при разморо-жуванні, °С Проінку-бовано яєць, шт. Заплідненість яєць, % Вивід гусят, % Виводимість яєць, %

1 100 202 85.1±2.5a 66.3±3.3 77.9±2.9

2 1 хвилина 0 – 2, а після 40 177 91.0±2.2b 72.9±3.3 80.1±3.0

3 контроль (свіжорозве-дена сперма) 208 93.7±1.7 72.1±3.1 76.9±2.9

Примітка: a:b при P<0,05

Отже, внаслідок проведених досліджень експериментально обґрунтовані технологічні прийоми заморожування сперми гусаків в облицьованих гранулах об'ємом 0,3 мл. При вживанні розмороженої сперми для осіменіння гусок забезпечується заплідненість яєць на рівні 85,1 - 91,0 %, вивід гусят - 66,3 - 72,9 %, що відповідає показникам, які спостерігаються при природному спарюванні гусей.

Розробка експрес-методів визначення запліднюючої

здатності сперми півнів.

Для визначення якості сперми найчастіше застосовують такі методи: визначення рухливості і живучості сперматозоїдів, цілісність їх голівок при фарбуванні еозiн-нiгрозiном та іншими барвниками, ряд біохімічних тестів. Але жодний з цих методів не дає можливості об'єктивно визначити її запліднюючу здатність. Це стосується і флуоресцентного методу з використанням етідіум броміду. Цей барвник повільно дифундує через нативні мембрани клітин, але швидко проникає в ушкоджені голівки сперматозоїдів, що призводить до їх інтенсивної люмінесценції. Таким чином, цей метод дає можливість швидко визначити кількість сперматозоїдів з ушкодженими голівками, але не забезпечує точного прогнозування запліднюючої здатності сперми, тому що цей показник залежить більше всього від стану акросом. Тому наші дослідження були спрямовані на пошук флуорохрому, який надав би можливість визначити ушкодження акросом. З вивчених флуорохромів (акрiдiновий оранжевий, ауромiн 00, кальцеїн, конго червоний, корiфосфiн, метиленовий зелений, a-нафтiламiн, тетразолiєвий синій, тетрациклiн, тiазiновий червоний, примулiн, хiнiн, флуоресцеїн, еозiн) саме тіазіновий червоний відповідає таким вимогам. Крім цього, була вивчена можливість використання цього барвника в суміші з етідіум бромідом. Це дало змогу визначати одночасно ушкодження голівок і акросом сперматозоїдів та з високої точністю (коефіцієнт кореляції r=0,93) прогнозувати запліднюючу здатність сперми. Нами експериментальним шляхом визначена оптимальна концентрація тіазінового червоного в цій суміші (0,005 – 0,008%) та етідіум броміду (0,0008 – 0,0015%). Зразки сперми змішують з цим флуорохромом та вивчають під люмінесцентним мікроскопом. При цьому на темно-синьому фоні добре видно того ж кольору, але менш забарвлені, сперматозоїди, які є неушкодженими. При ушкодженні акросоми тіазіновий червоний забарвлює її в світло-салатовий колір. Ще більше ушкодження акросоми, пов'язане з порушенням її морфологічної структури, супроводжується її інтенсивним червоно-коричневим забарвленням. При ушкодженні голівок сперматозоїдів етідіум бромід фарбує їх в яскраво-малиновий колір. Таким чином, розробка флуорохрому та параметрів його використання при роботі зі спермою півнів дала змогу за 5 – 10 хвилин визначати її запліднюючу здатність за станом акросом та голівок статевих клітин.

Подальші дослідження в цьому напрямку дали змогу виявити ще один флуорохром a-нафтiламiн, який ще краще та швидше визначає ушкодження акросом та голівок сперматозоїдів півнів. Цей флуорохром адсорбується на поверхні мембран сперматозоїдів та викликає їх люмінесценцію салатового кольору. Тому сперматозоїди є ніби окреслені за контуром, що дає змогу виявляти будь-які незначні ушкодження всіх його складових частин від акросоми до хвоста. Використання цього флуорохрому дає змогу визначити запліднюючу здатність сперми півнів з високої кореляцією (r=0,97, при Р<0,05) за 3-5 хвилин.

Розробка лабораторних експрес-методів визначення запліднюючої здатності сперми півнів за станом статевих клітин, особливо за станом їх акросом, які є найбільш вразливими частинами, дала змогу суттєво прискорити виконання досліджень по її низькотемпературній консервації.

Розробка технології заморожування сперми півнів.

При заморожуванні сперми півнів зі швидкістю 2 та 10°C/хв ушкодження сперматозоїдів спостерігаються при їх охолодженні до -10 - -30°C (табл.2). Кількість сперматозоїдів з неушкодженими мембранами голівок при цьому не перевищує 25 - 40%. Але всі вони мають ушкоджені акросоми. Такі ушкодження в цій температурній зоні пов'язані з перебуванням клітин в жорстких умовах. Так, внаслідок виморожування води спостерігається підвищення концентрації електролітів і інших речовин, зміна іонної сили розчину, рН і осмотичного тиску. Це призводить до лiотропного руйнування, надлишкової дегідратації, порушення іонного балансу клітин. Всі ці фактори особливо небезпечні для акросом, в яких знаходяться гiдролiтичні ферменти в неактивній формі. Заморожування сперми із швидкістю 40°C/хв теж викликало ушкодження клітин внаслідок різких осмотичних змін і внутрішньоклітинного кристалоутворення.

Таблиця 2. Життєздатність сперматозоїдів півнів залежно від глибини та швидкості заморожування.

Проведе-но заморо-жування до °С Лінійна швидкість заморожування, °C/хв.

2 10 40

кількість клітин з неушкодженими кількість клітин з неушкодженими Кількість клітин з неушкодженими

голівками, % акросо-мами, % голівками, % акросомами, % голівками, % акросо-мами, %

0 92,3±0,3 92,0±1,4 92,9±0,5 93,0±1,4a 89,0±0,6a 92,0±1,4a

-5 85,5±1,0a 82,0±1,4 86,0±1,0a 86,0±2,1 82,5±0,9 51,0±5,1b

-10 78,1±1,2b 80,0±1,8a 75,0±1,3b 82,0±1,4b 78,8±1,2b 24,0±2,1c

-15 58,2±1,2c 37,0±2,9b 58,7±1,5c 33,0±2,2c 73,2±1,1 22,0±1,4

-20 44,0±2,2 12,0±1,4c 48,7±1,5 7,0±1,4 67,1±1,0c 12,0±1,4

-30 25,0±2,1 0 40,6±1,4 0 46,6±1,2 0

Примітка: a:b, b:c при P<0,05

Як свідчать наведені в таблиці 2 дані, охолодження сперми півнів з будь-якою лінійною швидкістю призводить до ушкодження акросом у всіх клітин вже при -30°С. Ці та інші наші дослідження дали змогу виявити три критичні зони, які найбільш небезпечні при охолоджуванні сперми півнів до -196°С, а саме: від 0°С до початку процесу кристалізації; в межах –16 - -22°С та –80 - -90°С. Такі обставини свідчили про необхідність розробки ступінчастого режиму охолодження. Найкращі результати були одержані при охолодженні сперми півнів від 0°С до початку процесу кристалізації зі швидкістю 3°С/хв та витримуванні на плато кристалізації протягом 1 –3 хвилин. На рис. 3 та 4 наведені результати експериментів, які свідчать про те, що сперму півнів необхідно охолоджувати від початку процесу кристалізації до –16 - -22°С зі швидкістю 30°С/хв, а потім до -80°С - -90°С – зі швидкістю 70°С/хв., після цього зразки слід занурювати в рідкий азот для швидкого охолодження до -196°С.

Життєздатність сперматозоїдів при їх заморожуванні в значній мірі залежить і від складу кріозахисного середовища. Тому наші дослідження були направлені також і на удосконалення відомих середовищ, що використовуються для заморожування сперми півнів. Для цього нами був використаний план Плакетта-Бауера (Адлер Ю.П. та інші., 1976). Це дало можливість визначити, що компоненти по різному діють на

Рис. 3. Життєздатність сперматозоїдів півнів залежно від швидкості їх заморожування від точки кристалізації до -30°С.

Рис. 4. Дія швидкості охолодження сперми півнів від –16 - -22°С до -95°С на

життєздатність статевих клітин.

показники якості сперматозоїдів. Компонентами, які покращують їх рухливість, являються гліцин, глюкоза, сульфат марганцю, полiвiнiлпiрролiдон, а тими, які знижують, - iнозiт і цитрат калiю. Позитивно впливають на зберігання голівок сперматозоїдів протамiн сульфат, ПВП і овомукоїд, негативно - гліцин. Введення в склад захисного середовища глюкози, iнозiту, протамiн сульфату, ацетата магнiю і овомукоїду сприяє підвищенню збереженості акросом сперматозоїдів в процесі заморожування-відтавання. Це дозволило виділити компоненти захисного середовища, які сприяли виживанню сперматозоїдів при заморожуванні, та швидко розробити нове захисне середовище під назвою С-2 такого складу (г%): глутамат натрію – 2,85, глюкоза – 0,50, інозіт – 0,25, ацетат магнію – 0,07, ацетат калію – 0,50, полівінілпірролідон – 0,20, протамін сульфат – 0,028. Осмотичність цього середовища складає 350 – 400 мОсм. Захисну функцію воно набуває при додаванні до його складу диметілформаміду.

В цілому розроблена нами технологія заморожування сперми півнів здійснюється в такій послідовності. Свіжоодержану сперму півнів розводять середовищем С-2 без кріопротектора у співвідношенні 1 : 1 при температурі 20 - 25°C та зберігають в холодильнику (4°C) протягом 40 - 45 хвилин. Після цього сперму ще раз розводять середовищем С-2 з крiопротектором у співвідношенні 2:1. Як кріопротектор, використовують диметiлформамiд в кінцевій концентрації 7%. Зразу після другого розведення спермою заповнюють поліетиленові трубки (пайєти) типу "СЖ", які заморожують за такої програмою: зі швидкістю 3°C/хв до початку кристалізації, витримують протягом 1 - 3 хвилин на плато кристалізації, після цього зі швидкістю 30°C/хв до -16 - -22°C, 70°C/хв до -80 - -90°C, а потім занурюють в рідкий азот. Розморожування зразків здійснюють на водяній бані при 40°C. Штучне осіменіння курей розмороженою спермою здійснюють дозою 0,12 мл з частотою один раз в три - чотири дні. При цьому пайєту вводять в статевий шлях курей на глибину 2-3 см. Ця технологія забезпечує заплідненість яєць на рівні 75 - 85%, вивід курчат -70 - 75%.

Розроблена технологія низькотемпературної консервації сперми в пайєтах була використана нами для накопичення сперми півнів рідкісних порід в низькотемпературному банку генів, що створений при Інституті птахівництва УААН. На даний час в цьому банку зберігається сперма півнів дев'яти рідкісних порід.

Слід наголосити, що сперма півнів рідкісних порід нами не тільки була накопичена в низькотемпературному банку, але й вжита при відновленні зниклих порід, а до селекціонованих ліній було застосовано “прилиття крові” від курей німецької селекції. Після використання заморожено-відталої сперми заплідненість яєць склала 80,2%, виводимість курчат – 90,2%. Дев'ятирічне зберігання не виявляє негативного впливу на відтворювальні якості консервованої сперми. Так, завдяки цьому запасу сперми, який зберігався 9 років, колекційне стадо курей дослідного господарства “Борки” в 2001 році було поновлено ще трьома рідкісними породами: голошийна, падуан, українська вушанка.

Експериментальне обґрунтування можливості низькотемпературної консервації суспензії ембріональних клітин курей.

Для проведення досліджень використовували ембріональні клітини, одержані з ембріонів, які знаходяться на стадії кінця бластули - початку гаструли. На цій стадії розвитку ембріону його клітини ще зберігають тотiпотентні властивості (Marzullo G., 1970) та є легкодоступні, тому що знаходяться в свіжознесеному яйці. Дослідження були розпочаті нами з удосконалення методу контролю життєздатності цих ембріональних клітин. Вони показали, що для визначення життєздатності ембріональних клітин доцільно застосовувати 1-10 мкМ розчин етiдiум бромiду на фосфатно-соляному буфері. При цьому дуже важливо, щоб підготовка препарату для мікроскопування не перевищувала 1 хвилини, а на розподіл 100 – 200 клітин на нормальні та ушкоджені було витрачено не більше 5 хвилин. Це пояснюються тим, що етідіум бромід забарвлює не тільки ушкоджені ембріональні клітини, але й нормальні. Різниця полягає тільки в швидкості його проникнення в клітини. Так, в ушкоджених клітинах він з'являється зразу ж та викликає їх яскраву малиново-червону люмінесценцію при 580 – 610 нм. З нормальних клітин (життєздатних, неушкоджених) він фарбує 2% з них тільки через 10 хвилин. Таким чином, при загальних витратах часу на одне визначення не більш 5 – 7 хвилин, цей метод гарантує об'єктивний розподіл ембріональних клітин в суспензії на життєздатні та ушкоджені (в %).

Наявність такого об'єктивного та швидкого методу сприяла прискоренню досліджень по низькотемпературному консервуванню ембріональних клітин. В таблиці 3 наведені дані по вивченню дії кріопротектору на життєздатність ембріональних клітин.

Таблиця 3. Вплив деяких кріопротекторів на чисельність життєздатних ембріональних клітин в суспензії (в %) від їх загальної кількості

Кріопро-тектор Тривалість періоду еквілібрації, години

0 1 3 5 24 48

Контроль 86,8±2,5 86,8±2,6 85,2±2,2 83,4±1,8 78,0±2,8a 76,7±0,7c

Гліцерин 84,1±2,5 85,1±2,2 80,5±3,3 81,7±2,5 61,9±4,1a 53,2±1,7e

ДМСО 84,3±3,0 81,7±2,7 79,1±2,6 78,1±3,3 70,2±2,0 65,4±2,6d

ПГ 81,9±3,9 78,6±3,1 76,7±3,0 75,0±3,7 57,5±4,0b 27,0±4,4f

ЕГ 83,0±3,3 80,4±4,3 78,0±4,8 76,4±4,1 60,1±3,0b 45,3±2,2g

Примітка: a:b, при P<0,05 c:d:e:f:g при P<0,01

Аналіз наведених в таблиці 3 експериментальних даних свідчить про те, що при експозиції ембріональних клітин з крiопротекторами до 5 годин чисельність життєздатних з них залишається на високому рівні. Після 24-годинної експозиції спостерігається вірогідне (при Р<0,05) зниження кількості життєздатних клітин у присутності гліцерину, етиленгліколю і пропiленгліколю. Ці дослідження свідчать про доцільність використовування, як кріопротектора, ДМСО. При його введенні крапельним методом чисельність життєздатних клітин в суспензії зростає і стає такою ж, як і в контролі.

В таблиці 4 наведені експериментальні дані щодо двохступінчастого режиму заморожування ембріональних клітин. Для цього клітини спочатку заморожують до приведеного в таблиці показника температури, а потім їх занурюють в рідкий азот. До заморожування кількість життєздатних клітин в суспензії складала 93,6±0,4%. Попереднє охолодження суспензії зі швидкістю 1, 3 або 10°С/хв до -10°С з послідуючим занурюванням в рідкий азот, як свідчать дані в таблиці 4, спричиняє загибель значної кількості ембріональних клітин. Значно кращі результати одержані при охолодженні суспензії клітин зі швидкістю 1°С/хв до -30°С з наступним занурюванням в рідкий азот.

Таблиця 4. Чисельність життєздатних ембріональних клітин в суспензії (в %) залежно від швидкості і глибини охолодження.

Температура, до якої проведено попереднє охолодження, °С Швидкість охолодження суспензії клітин, °С/хв.

1 3 10

-10 20,3±3,7b 15,7±0,9 26,7±2,9

-20 74,3±3,5b 62,3±2,2b 42,3±2,9

-30 88,0±1,5a 77,0±2,5c 34,7±6,5

-40 84,3±2,3a 76,3±1,5c 51,3±4,5b

-50 73,7±3,2b 67,3±1,8b 45,0±6,9

-60 83,0±1,7 70,3±1,5 30,0±4,6

-70 84,0±3,5 66,3±1,2 30,7±2,6

-80 83,0±2,0 74,7±4,3 36,3±5,9

Примітка: a:b при P<0,05, a:c при P<0,1

Наші наступні дослідження в цьому напрямку дали змогу експериментально обґрунтувати можливість низькотемпературної консервації суспензії ембріональних клітин курей. Для цього суспензію ембріональних клітин, підготовлену відомим методом (Терещенко О.В. та ін., 1993), поміщають у фосфатно-сольовий буфер з осмотичністю 285 – 310 мОсм при температурі 20°С. За два прийоми загальною тривалістю 10 хвилин крапельним методом до цієї суспензії додають диметилсульфоксид до кінцевої концентрації 10%. Після цього суспензією заповнюють пайєти, які охолоджують зі швидкістю 1°С/хв до температури -30°С. Дуже корисним при цьому, для підвищення життєздатності ембріональних клітин, є ініціація процесу кристалоутворення при -6°С шляхом дотику до верхньої частини кожної з них охолодженого в рідкому азоті металевого предмету, наприклад пінцету. Після охолодження пайєт до -30°С їх необхідно негайно занурити в рідкий азот для швидкого охолодження до -196°С. Затримка цього процесу до 3 – 6 хвилин приводить до зниження життєздатності ембріональних клітин. Для розморожування пайєти занурюють у водяну баню при 40°С до появи рідкої фази в законсервованій суспензії. Після цього суспензію з пайєт переносять у пробірку, розбавляють в 5 – 10 разів розчином фосфотно-сольового буферу без кріопротектора (ступінчасто за 5 –10 прийомів), визначають життєздатність клітин та використовують для біотехнологічних досліджень та робіт. Здійснення перелічених вище технологічних прийомів в розробленій нами послідовності гарантує одержання при заморожуванні - розморожуванні чисельністі життєздатних ембріональних клітин в суспензії на рівні 80 – 90%.

ВИСНОВКИ

1. Розроблений комплекс технологічних прийомів низькотемпературної консервації геномів птиці у вигляді статевих та ембріональних клітин для їх використання при проведенні біотехнологічних досліджень та робіт, в тому числі при конструюванні особин з передбаченими генетичними параметрами, в селекції, генетиці, репродукції, а також для збереження та відновлення малочисельних та зникаючих порід та популяції.

2. Флуоресцентний метод дозволяє швидко (за 3 –10 хвилин) та з високою точністю (коефіцієнт кореляції r=0,93– 0,97) оцінювати запліднюючу здатність сперми півнів за станом акросом при визначенні його за допомогою таких флуорохромів, як a-нафтіламин або суміш тіазинового червоного та етідіум броміда.

3. При заморожуванні сперми півнів з лінійною швидкістю спостерігається масове ушкодження акросом сперматозоїдів в трьох температурних зонах (від 0°С до початку кристалізації; -16° - -22°С та –80 - -90°С), якого можна уникнути шляхом застосування ступінчатого режиму охолодження.

4. Одержання не менше, ніж 30 – 50% життєздатних сперматозоїдів після кріоконсервації та високих показників відтворювання (заплідненість яєць 75-85%, вивід курчат 70-75%) забезпечується при заморожуванні сперми півнів за ступінчастим режимом (спочатку зі швидкістю 3°C/хв до початку кристалізації, а після експозиції на плато кристалізації протягом 1 - 3 хвилин зі швидкістю 30°C/хв до -16 - -22°C, 70°C/хв до -80 - -90°C з послідуючим занурюванням в рідкий азот), розморожуванні при 40°C та використанні для штучного осіменіння курей в дозі 0,12 мл та з інтервалом один раз в три - чотири доби.

5. Відомий кріопротектор диметилформамід найкраще здійснює захисну функцію відносно сперматозоїдів півнів при додаванні його до середовища С-2 (г%: глутамат натрію – 2,85, глюкоза – 0,50, інозіт – 0,25, ацетат магнію – 0,07, ацетат калію – 0,50, полівінілпірролідон – 0,20, протамін сульфат – 0,028, вода тощо) до кінцевої концентрації 7% та при застосуванні двохетапного режиму розбавлення сперми.

6. Сперма гусаків зберігає високу запліднюючу здатність (заплідненість яєць 85,1 – 91,0%, вивід гусенят 66,3 – 72,9%) після ії низькотемпературної консервації в облицьованих гранулах об'ємом 0,3 мл за ступінчастим режимом (зі швидкістю 50°С/хв від 0°С до -86°С, а потім зі швидкістю 8 - 15°С/хв до -196°С) під захистом диметилформаміду в кінцевий концентрації 10% та при вживанні захисного середовища В-26.

7. Низькотемпературна консервація суспензії ембріональних клітин курей в пайєтах можлива з високою результативністю (життєздатність зберігають до 80 – 90% клітин) під захистом диметилсульфоксиду в фосфатно-сольовому буфері за умови його ступінчастого введення при температурі 20°С до кінцевої концентрації 10% та при охолодженні зі швидкістю 1°С/хв до -30°С з послідуючим занурюванням в рідкий азот.

ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ

1. Для поповнення низькотемпературних банків генетичної інформації, необхідної при виконанні досліджень та робіт в галузі біотехнології, генетики, селекції, репродукції, збереження та відновлення рідкісних порід, доцільно використовувати розроблені нами методи кріоконсервування сперми гусаків, півнів та ембріональних клітин курей в облицьованих гранулах та пайєтах, які відрізняються від відомих технічних рішень новизною, високою результативністю, дозволяють маркувати та зберігати зразки без забруднення протягом тривалого періоду (роки, десятиріччя).

2. Для визначення життєздатності ембріональних клітин та запліднюючої здатності статевих клітин птиці за 3 – 10 хвилин слід використовувати флуоресцентний метод з вживанням рекомендованих нами флуорохромів, а саме: етідіум броміду, суміші тіазинового червоного та етідіум броміду, a-нафтіламину.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Сахацкий Н.И., Терещенко А.В., Артеменко А.Б. Экспресс-метод оценки оплодотворяющей способности замороженно-оттаянной спермы с.-х. птицы // С.- х. биология. - 1987. - N 12. -С. 77-80. (автором особисто розроблено 50%).

2. Сахацкий Н.И., Терещенко А.В., Артеменко А.Б. Усовершенствование способа определения качества спермиев // Птицеводство: Межвед. темат. науч. сб./ УНИИП, 1989. - Вып.42. – С. 23-27. (автором особисто розроблено 50%).

3. Артеменко А.Б., Терещенко А.В., Новиков А.Н., Линник Т.П. Криоконсервирование спермы петуха // Птицеводство: Межвед. темат.науч. сб./ УНИИП, 1990. - Вып. 43. - С. 14-17. (автором особисто виконано 50%).

4. Сахацкий Н.И., Терещенко А.В., Артеменко А.Б. Технология замораживания спермы петухов // Птицеводство. - 1991. - N 5. - С.10-11. (автором особисто розроблено 50%).

5. Терещенко А.В., Артеменко А.Б., Тагиров М.Т., Белецкая А.В., Сахацкий Н.И. Низкотемпературная консервация бластодермальных клеток эмбрионов кур // С.-х. биология. - 1993. - N 6. - C. 53-58. (автором особисто виконано 80%).

6. Линник Т.П., Терещенко А.В., Артеменко А.Б Влияние белковых добавок к криозащитной среде на сохранность спермиев петуха при криоконсервировании // Проблемы криобиологии. - 1996. - N 2. - С.35-39. (автором особисто виконано 33%).

7. Линник Т.П., Грищенко В.И., Артеменко А.Б., Терещенко А.В. Влияние осмотичности криозащитной среды на сохранность спермиев петуха при криоконсервировании // Проблемы криобиологии. - 2000, - N 2, - С.86-93. (автором особисто виконано 30%).

8. Линник Т.П., Грищенко В.И., Артеменко А.Б., Терещенко А.В. Влияние длительного низкотемпературного хранения спермы петухов на ее оплодотворяющую способность // Проблемы криобиологии. - 2000, - N 3, - С.64-71. (автором особисто виконано 50%).

9. А.с. 1329780 СССР. МКИ А61Д 7/02. Способ определения качества спермиев / Терещенко А.В., Сахацкий Н.И., Артеменко А.Б. – №4035697/30-15; Заявлено 24.03.86; Опубл. 15.08.87; Бюл. N 30. - 3 c. (автором особисто розроблено 50%).

10. А.с. 1475645 СССР. МКИ А61D 7/02. Способ определения оплодотворяющей способности спермиев / Терещенко А.В., Сахацкий Н.И., Артеменко А.Б. - № 4241244/30-15; Заявлено 07.05.87; Опубл. 30.04.89; Бюл. N 16. - 3 c. (автором особисто розроблено 50%).

11. А.с. 1524882 СССР. МКИ А61D 7/02. Способ криоконсервации спермы птиц / Сахацкий Н.И., Терещенко А.В., Новиков А.Н., Линник Т.П. Артеменко А.Б. - № 4395197/30-15; Заявлено 22.03.88; Опубл. 30.11.89; Бюл. № 44. - 4 c. (автором особисто розроблено 40%).

12. Sakhatsky N.I., Andreyev V.I, Artemenko A.B. Technology of goose sperm low temperature conservation // 10-th European symp. on waterfowl: Preliminary proc. (march 26-31,1995). - , Halle (Salle), Germany. - 1995. - P.226-228. (автором особисто виконано 50%).

Артеменко О.Б. Низькотемпературна консервація статевих і ембріональних клітин птиці. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. – Інститут тваринництва УААН, Харків, 2002.

Дослідження виконані в напрямку удосконалення відомих та розробки нових технологій низькотемпературної консервації статевих клітин гусаків та півнів, а також ембріональних клітин курей в облицьованих гранулах та пайєтах. Розроблено технології низькотемпературної консервації сперми гусаків та півнів, що гарантують при їх застосуванні для штучного осіменіння гусей одержання заплідненості яєць на рівні 85,1 – 91,0%, курей - 75 - 85%. Доказана висока ефективність використання флуоресцентного методу для визначення запліднюючої здатності сперми півнів за умовами вживання флуорохромів, що характеризують стан акросом сперматозоїдів, а саме суміші: тіазінового червоного та етідіум броміду або a-нафтіламіну. З використанням цих технології та запасу сперми, що зберігалась в генетичному банку протягом 3 – 9 років, відновлено 3 рідкісних породи курей. Розроблена технологія консервації суспензії ембріональних клітин курей, яка забезпечує збереження життєздатності у 80-90% клітин після їх кріоконсервування, а також флуоресцентний метод визначення їх життєздатності.

Ключові слова: біотехнологія, кріоконсервування, низькотемпературний банк, статеві клітини, ембріональні клітини.

Артеменко А.Б. Низкотемпературная консервация половых и эмбриональных клеток птиц. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20 – биотехнология. – Институт животноводства УААН, Харьков, 2002.

Исследования выполнены в направлении усовершенствования известных и разработки новых технологий низкотемпературной консервации половых клеток гусаков и петухов, а также эмбриональных клеток кур в облицованных гранулах и пайеттах для долговременного хранения в генетических банках и использования в работах в области биотехнологии, генетики, селекции, репродукции, сохранении и восстановлении редких пород. Разработан ряд технических решений, отличающихся новизною и высокой результативностью. В частности, технология низкотемпературной консервации спермы гусаков в облицованных гранулах предусматривает использование защитной среды Б-26 совместно с диметилформамидом в конечной концентрации 10%, ступенчатых режимов охлаждения и размораживания. Это гарантирует при ее применении для осеменения гусей получение оплодотворенности яиц на уровне 85,1 – 91,0%, вывода гусят 66,3 – 72,9%.

Доказана высокая эффективность использования флуоресцентного метода для определения оплодотворяющей способности спермы петухов при условии применения флуорохромов, характеризующих состояние акросом сперматозоидов, а именно, смеси тиазинового красного с этидиум бромидом или a-нафтиламина. Разработана технология низкотемпературного консервирования спермы петухов в пайеттах, которая предполагает использование защитной среды С-2 в соединении с диметилформамидом в конечной концентрации 7%, ступенчатых режимов ее разбавления и охлаждения, некоторых других приемов, которые обеспечивают получение при осеменении кур оплодотворенности яиц 75-85%, вывода цыплят 70-75%. При этом были определены температурные зоны, в которых при охлаждении с линейными скоростями, спермии получают максимальные повреждения. Использованный для разрапботки защитной среды план Плакетта-Бауэра позволил определить, что компоненты по разному влияют на показатели качества сперматозоидов. Это позволило выделить компоненты защитной среды, способствующие сохранению половыми клетками способности к оплодотворению. Был оптимизирован состав защитной среды и ее осмотическое давление.

С использованием этой технологии и запаса спермы, хранившегося в генетическом банке на протяжении 3 – 9 лет, восстановлены три редкие породы кур (голошейные, падуан, украинские ушанки), которые переданы для дальнейшего размножения и использования в коллекционное стадо.

Экспериментально обоснована возможность низкотемпературного консервирования суспензии эмбриональных клеток кур. Разработана технология, обеспечивающая сохранение жизнеспособности у 80 – 90% эмбриональных клеток после их криоконсервирования в пайеттах под защитой диметилформамида в фосфатно-солевом буфере при условии его ступенчатого ввода при температуре 20°С до конечной концентрации 10% и при охлаждении со скоростью 1°С/мин до -30°С с последующим погружением в жидкий азот, а также флуоресцентный метод определения их жизнеспособности.

Ключевые слова: биотехнология, криоконсервирование, низкотемпературный банк,