НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО НАН УКРАЇНИ

БУРЛАКА АНАТОЛІЙ ПАВЛОВИЧ

УДК:616-006-084:618.19:616.36:591.044:612.014.482

РОЛЬ РАДИКАЛЬНИХ ФОРМ КИСНЮ І ОКСИДУ АЗОТУ В МОЛЕКУЛЯРНИХ МЕХАНІЗМАХ КАНЦЕРОГЕНЕЗУ

04.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ — 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Науковий консультант – доктор медичних наук, професор Сидорик Євген Петрович, Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу біофізики канцерогенезу;

Офіційні опоненти: – доктор біологічних наук Смірнова Ірина Адріанівна, Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу механізмів лейкозогенезу; – доктор медичних наук Баглей Євген Ананійович, Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя МОЗ України, завідувач лабораторії канцерогенезу, тератогенезу та токсикології репродуктивної функції; – доктор біологічних наук Зінченко Валентина Андріївна, Інститут онкології АМН України, провідний науковий співробітник лабораторії експериментальної онкології і променевої патології.

Провідна установа — Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика         МОЗ України, кафедра онкології, м. Київ.

Захист відбудеться “ 9 ” жовтня “ 2002 р. о 13 годині 30 хвилин на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (03022, Київ, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР НАН України

Автореферат розісланий “ 7 ” вересня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук Бородай Н.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Завдяки дослідженням вітчизняних і зарубіжних вчених (E.J.1985; Ch.1985; P.1996; B.H.1999; Є.П. Сидорик, 1991—2001) отримано дані, які розкривають важливі молекулярні механізми канцерогенезу стосовно взаємодії електрофільних інтермедіатів хімічних канцерогенів з нуклеофільними центрами ДНК, зокрема з атомами азоту та кисню в молекулі гуаніну, а також відзначено важливість порушень оксидного стану в патогенезі пухлинного росту. Згідно із сучасними уявленнями, радикальні форми кисню (РФК) та оксиду азоту (NO) є ключовими чинниками уражень при дії на організм агентів фізичної і хімічної природи. Встановлено, що РФК, які генеруються в мембранах клітин, можуть взаємодіяти з пуриновими основами ДНК та запускати тим самим молекулярні механізми канцерогенезу на стадії ініціації. В той же час деякі важливі аспекти молекулярних механізмів канцерогенезу, спричиненого агентами хімічної і радіаційної природи, щодо ролі РФК залишаються недостатньо вивченими. Ґрунтовних досліджень потребують також питання, пов'язані з вивченням кількісних та якісних кінетичних характеристик молекулярних переносників електронів мембран клітин, зокрема цитохрому Р-450, який генерує супероксидні радикал-аніони, а також залізосірчаних білків електронтранспортної системи мембран мітохондрій у зв'язку із здатністю NO активувати або гальмувати активність цих систем.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана за програмою НДР Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології (ІЕПОР) ім. Р.Є. Кавецького НАН України у відділі біофізики канцерогенезу за такими темами: “Вивчити молекулярні переносники електронів енергетичної і детоксикуючої систем мембран клітин при пухлинному процесі в умовах його регуляції” (1986—1990 рр. Шифр теми 2.28.3.2.; 2.28.3.4; № держреєстрації 01.86.0047143); “Вивчити різні форми цитохрому Р-450 і радикалів кисню в мембранах ендоплазматичного ретикулуму клітини при хімічному канцерогенезі та в умовах антиканцерогенних дій” (1991—1993 рр. Шифр теми 2.2.5.117; № держреєстрації 01.9.10016737UA01001502Р); “Вивчити кінетичні закономірності стійкості окисного статусу клітин шляхом оцінки активності ферментативних антиоксидативних систем і радикальних форм кисню в різних органах і компонентах крові при хімічному канцерогенезі” (1994—1996 рр. Шифр теми 2.2.5.194; № держреєстрації 0194U017023); “Вивчити молекулярні переносники електронів в детоксикуючій та енергетичній системах органів та компонентах крові при тривалій дії іонізуючої радіації низької інтенсивності в зв'язку з аварією на ЧАЕС” (1997—1999 рр. Шифр теми 2.2.5.199; № держреєстрації 0197U006229); “Дослідження біологічних маркерів NO—Hb, 8-oxoG (8-oxodG) і металовмісних білків біофізичними методами у дітей і дорослих в умовах дії іонізувальної радіації в малих дозах в зв'язку з аварією на ЧАЕС” (2000—2002 рр. Шифр теми 2.2.5.217).

Мета роботи та завдання дослідження. Мета — дослідити механізми формування у клітинах органів пошкоджень, спричинених РФК (О2., .ОН) та NO при хімічному канцерогенезі, індукованому 7,12-ДМБА і НДЕА, та за тривалого впливу іонізувальної радіації низької потужності, визначити молекулярні маркери оксидних пошкоджень клітинних структур, які свідчать про ініціацію канцерогенезу під час дії на організм хімічних і фізичних чинників.

Для досягнення цієї мети потрібно було виконати такі завдання:

1. Визначити швидкість генерування супероксидних радикал-аніонів і вміст гідроксильних радикалів у печінці та нирках тварин за канцерогенезу молочних залоз і печінки, індукованого відповідно 7,12-диметилбензантраценом (7,12-ДМБА) і нітрозодіетиламіном (НДЕА), та за умов постійного впливу іонізувальної радіації низької потужності.

2. Визначити активність супероксиддисмутази (СОД) і каталази в печінці, нирках та еритроцитах при канцерогенезі молочних залоз і гепатоканцерогенезі та за умов перманентного впливу іонізувальної радіації.

3. З'ясувати зв'язок між вмістом окисненої та відновленої форм цитохрому Р-450 і швидкістю генерування супероксидних радикал-аніонів у мембранах ендоплазматичного ретикулуму клітин печінки при канцерогенезі молочних залоз і гепатоканцерогенезі та під дією на організм іонізувальної радіації низької потужності.

4. Дослідити формування комплексів оксиду азоту з цитохромом Р-450 і залізосірчаними білками N-типу в органах тварин при гепатоканцерогенезі і канцерогенезі молочних залоз та за умов постійного впливу іонізувальної радіації низької потужності.

5. Визначити молекулярні маркери взаємодії РФК і оксиду азоту з нуклеофільними центрами ДНК і гемовими білками за умов дії на організм агентів хімічної та радіаційної природи.

6. Дослідити зміну рівнів молекулярних маркерів 8-гідроксо-2ў-дезоксогуанозину (8-oxodG) і 8-оксогуаніну (8-oxoG) оксидної модифікації ДНК під дією на організм агентів радіаційної природи.

7. Вивчити антирадикальну та антиканцерогенну дію флавоноїдів і меланінових пігментів як уловлювачів РФК та з'ясувати можливість їх застосування для профілактики уражень під впливом на організм агентів хімічної та радіаційної природи.

Об'єкт дослідження. Щурі-самиці розведення віварію ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН України, у яких індукували пухлини молочних залоз; щурі-самці, у яких індукували пухлини печінки; щурі-самиці, які 0,5—2 роки утримувались у віварії в м. Чорнобилі і споживали корм, забруднений радіонуклідами (200—250 Бк/доба); щурі — самці та самиці, яких утримували на стандартному раціоні у віварії ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України, кров і сеча дітей, котрі постраждали внаслідок аварії на ЧАЕС (за офіційними дозиметричними даними, еквівалентна доза опромінення не перевищувала 5 сЗв).

Предмет дослідження. Вільнорадикальні механізми формування порушень у клітинах під дією на організм канцерогенних агентів хімічної та фізичної природи.

Методи дослідження. Електронний парамагнітний резонанс (ЕПР) у режимі низькотемпературної стабілізації біологічних зразків (4,2—77 К), метод спінових уловлювачів, хемілюмінесценція, спектрофотометрія, спектрофлуориметрія, тонкошарова хроматографія, методи експериментальної онкології та радіобіології.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено провідну роль РФК в молекулярних механізмах хімічного канцерогенезу, індукованого поліциклічним ароматичним вуглеводнем (ПАВ) і нітрозаміном, а також в умовах постійного впливу іонізувальної радіації низької потужності. Виявлено загальні ланки молекулярних механізмів канцерогенезу, які формуються під дією на організм агентів хімічної і радіаційної природи внаслідок порушень прооксидантно-антиоксидантної рівноваги, змін співвідношення між швидкістю утворення супероксидних радикал-аніонів, вмістом гідроксильних радикалів і рівнем активності ферментативних антиоксидантних систем, в результаті чого активується вільнорадикальне окиснення в мембранах клітин. Визначено молекулярні маркери ініціації канцерогенезу під впливом агентів хімічної та радіаційної природи. Вперше показано, що малі дози іонізувальної радіації низької потужності значно підвищують швидкість генерування О2. в електронтранспортних ланцюгах мембран ендоплазматичного ретикулуму клітин, як і хімічні канцерогени.

Практичне значення отриманих результатів. Знайдено молекулярні маркери оксидних пошкоджень клітинних структур, які є критеріями ризику ініціації канцерогенезу внаслідок дії на організм хімічних і радіаційних агентів. Розроблено технології реєстрації РФК за допомогою спінових уловлювачів на спектрометрі ЕПР, запропоновано методи виявлення оксидних модифікацій гуанінів у молекулі ДНК, які можна застосовувати в клінічній практиці. Підтверджено, що визначення комплексу NO—Hb у крові дітей, які зазнали комбінованого (зовнішнього та внутрішнього) впливу малих доз іонізувальної радіації низької потужності, може слугувати молекулярним тестом дії на організм іонізувальної радіації. На прикладі застосування флавоноїдів і меланінів доведено, що розроблені та експериментально апробовані моделі можна використовувати для оцінки антиканцерогенних та антирадикальних властивостей.

Особистий внесок здобувача. Автор обґрунтував тему і мету дослідження, спланував завдання дисертаційної роботи та запропонував підходи до їх вирішення, виконав дослідження, проаналізував матеріали та сформулював висновки. Застосував розроблену ним разом з співробітниками Інституту біохімічної фізики ім. М.М. Емануеля РАН (Москва) методику прямої реєстрації рівнів супероксидних радикал-аніонів у клітинах. Самостійно проводив експерименти по індукції пухлин молочних залоз і печінки, здійснював забір біологічного матеріалу у тварин, дослідження біофізичними методами. Самостійно проаналізував одержаний матеріал і сформулював концепцію ініціації канцерогенезу РФК.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались та обговорювались на І Всесоюзному біофізичному з'їзді (Москва, 1982); Четвертій Міжнародній науково-технічній конференції з проблем ліквідації наслідків аварії на Чорнобильській атомній електростанції (підсумки 8-річної роботи) (Зелений Мис, 1994); ІХ з'їзді онкологів України (Вінниця, 1995); IV Міжнародній науково-технічній конференції (Чорнобиль, 1996); І з'їзді онкологів країн СНД (Москва, 1996); конференції “Медична реабілітація потерпілих внаслідок Чорнобильської катастрофи” (Трускавець, 1996); симпозіумі “Діагностика та профілактика негативних наслідків радіації” (Київ, 1997); Всеросійській конференції з міжнародною участю “Проблемы противоопухолевой защиты” (Москва, 1998); ІІ Міжнародній конференції “Віддалені наслідки Чорнобильської катастрофи” (Київ, 1998); Міжнародній конференції “Радиоактивность при ядерных взрывах и авариях” (Москва, 2000); ІІ з'їзді онкологів країн СНД (Київ, 2000); International conference “Modern problems of radiobiology, radioecology and evolution” (Москва, 2000); Міжнародній конференції “Наукові, технічні та соціальні аспекти закриття Чорнобильської АЕС” (Славутич, 2000); конгресі педіатрів з міжнародною участю (Київ, 2001); Х з'їзді онкологів України (Ялта, 2001); 3rd International conference “Health effects of the Chornobyl accident: result of 15-year follow-up studies” (Київ, 2001); ІІІ національному конгресі ревматологів України (Дніпропетровськ, 2001); ІІІ науково-практичній конференції “Проблеми онкогенетики: наукові та прикладні аспекти” (Київ, 2002).

Публікації. Основні результати викладено у 44 публікаціях, в тім числі у 2 монографіях (окремі розділи), 19 статтях у провідних фахових журналах та 23 тезах і матеріалах конференцій і з'їздів. Отримано патент України на метод оцінки токсичних порушень в енергетичній та детоксикаційній системах печінки, нирок та інших органів.

Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 248 сторінках і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, 10 розділів власних досліджень, обговорення результатів, заключної частини, висновків і списку використаних джерел з 154 назв, з них 134 іноземних. Робота ілюстрована 11 таблицями і 75 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МатеріалИ та методи дослідження

Робота виконана на експериментальних тваринах (1240 щурів) і клінічному матеріалі (212 зразків крові та сечі дітей) з використанням сучасних високоінформативних біофізичних методів дослідження, а саме: ЕПР в режимі низькотемпературної стабілізації біологічних об'єктів при температурі 4,2—77 К, спінових уловлювачів, хемілюмінесценції, а також біохімічних, онкологічних і радіобіологічних.

Дослідження хімічного канцерогенезу проведено на щурах-самицях в статево зрілому віці розплоду віварію ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України, які утримувались на стандартному раціоні. Пухлини молочних залоз у щурів-самиць статевозрілого віку індукували внутрішньовенним введенням 7,12-ДМБА фірми “Fluka et Busch” (Швейцарія) одноразово в дозі 3,5 мг/100 г маси тіла і тричі з інтервалом в 1 тиждень по 2 мг/100 г маси тіла в складі водно-жирової емульсії. Гепатоми у щурів-самців викликали введенням НДЕА рer os зондом з розрахунку 2 мг/100 г маси тіла в 0,5 мл води 5 разів на тиждень упродовж 40 діб.

Віддалені наслідки впливу аварії на ЧАЕС вивчали на щурах, які утримувались протягом 2 років у віварії в м. Чорнобилі і споживали корм, забруднений радіонуклідами (200—250 Бк/доба), зокрема 134Cs, 137Cs, 90Sr, 239Pu, 241Am. Контрольну групу тварин утримували на стандартному раціоні у віварії ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Паралельно було проведено дослідження на клінічному матеріалі крові та сечі дітей з клініки кафедри педіатрії № Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця МОЗ України. У зразках крові дітей і тварин визначали молекулярний маркер віддалених наслідків впливу опромінювання радіонуклідами — комплекс нітрозогемоглобіну (NО—Hb). Використовували венозну кров, яку досліджували як у нативному стані, так і після взаємодії з NO. Кров стабілізували гепарином або цитратним буфером рН 5,6. Нативну венозну кров досліджували методом ЕПР в режимі низькотемпературної стабілізації при 77 К на виявлення в ній комплексів NO—Hb. Утворення комплексів NO з гемовими і негемовими Fe—S-білками N-типу детоксикаційної та енергетичної систем клітин органів вивчали методом ЕПР в режимі низькотемпературної стабілізації зразків (77 К).

Для вивчення швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів і цитохрому Р-450 в ендоплазматичному ретикулумі клітин виділяли мікросоми за методом Ж. Де П'єр і Г. Далльнер (1979), а концентрацію білка визначали за C.S.та P.R.(1982) і O.H. Lowry et al. (1951). Кількісне визначення швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів проводили методом ЕПР із застосуванням спінового уловлювача гідроксиламіну — 2,2,6,6-тетраметил-4-оксипіперидину, який внаслідок взаємодії з супероксидними радикал-аніонами відновлювався до стабільного нітроксильного радикала.

Рівень гідроксильних радикалів оцінювали з використанням уловлювача — диметилсульфоксиду (ДМСО). Внаслідок його окиснення гідроксильними радикалами утворюються метилові радикали (СН3.), продуктом взаємодії яких з киснем є формальдегід. Останній визначали на спектрофлуориметрі КСВУ-23 та спектрофотометрі СФ-46 за довжини хвилі 415 нм. Стан залізосірчаних білків N-типу електронтранспортного ланцюга енергетичної системи мітохондрій оцінювали у зразках органів методом ЕПР при 77 К. Вміст окисненої (низькоспінової) та відновленої (високоспінової) форм цитохрому Р-450 детоксикаційної системи органів вивчали методом ЕПР при 4,2—77 К. Стан молекулярних переносників електронів мітохондрій надниркових залоз оцінювали методом ЕПР при 77 К. Для вивчення молекулярних переносників електронів в органах, клітинах, субклітинних структурах, крові методом ЕПР за допомогою прес-форми готували зразки , заморожували їх при температурі рідкого азоту в кварцовій посудині, при 4,2 і 77 К записували спектри ЕПР на радіоспектрометрі РЕ-1307 "Radiopan" з високочастотною модуляцією магнітного поля (100 кГц) та фіксованою потужністю випромінювання клістрону. Активність СОД визначали в клітинах печінки, нирок та еритроцитах за методами, описаними С. Чеварі та співавт. (1991), каталази — М.О. Королюк та співавт. (1988).

Як уловлювач РФК при антиканцерогенних діях застосовували флавон фірми “Fluka et Busch” (Швейцарія) у складі фосфоліпідної емульсії в дозі 0,2 мг/кг, який вводили тричі на тиждень внутрішньовенно протягом 2 міс. Для профілактики радіаційного канцерогенезу як антирадикальний засіб застосовували меланін, виділений з гриба Cladosporium Cladosporioides. Меланін згодовували тваринам з кормом протягом місяця з розрахунку 0,025 г/кг маси тіла щоденно. Проведено два курси: на 6-му і 15-му місяцях постійного перебування лабораторних щурів у 30-кілометровій зоні відчуження ЧАЕС.

Вільнорадикальні оксидні процеси в органах і клітинах крові вивчали методом хемілюмінесценції. Кінетику люмінесценції проб реєстрували у вигляді хемілюмінограм на приладі ХЛМ1Ц-О1, розробленому за участю співробітників відділу біофізики канцерогенезу ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАНУ, емісію світла реєстрували за допомогою лічильника фотонів. Хемілюмінесценцію сироватки крові ініціювали 3%-м розчином пероксиду водню.

Біологічні маркери (8-oxodG, 8-oxoG) оксидної модифікації ДНК вивчали на клінічному матеріалі (кафедра педіатрії № Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця МОЗ України). В сечі дітей визначали молекулярні маркери оксидної модифікації ДНК: 8-oxodG і 8-oxoG. Твердофазову екстракцію окиснених гуанінових основ ДНК із сечі, їх ідентифікацію і кількісну оцінку вмісту проводили методом спектрофотометрії.

Результати та ЇХ обговорення

Радикальні форми кисню та оксиду азоту при хімічному канцерогенезі молочних залоз і гепатоканцерогенезі. Реалізація завдань, поставлених у роботі, стала можливою завдяки використанню нової технології реєстрування РФК — методів спінових уловлювачів та ЕПР у режимі низькотемпературної стабілізації біологічного матеріалу (4,2—77 К), яка забезпечила пряме реєстрування радикальних продуктів.

Кінетичні дослідження на всіх етапах генерування супероксидних радикал-аніонів і вмісту гідроксильних радикалів в ендоплазматичному ретикулумі клітин печінки та нирок проведено на двох моделях хімічного канцерогенезу: 7,12-ДМБА та НДЕА. На рис. 1 наведено залежність кінетики генерування супероксидних радикал-аніонів в ендоплазматичному ретикулумі клітин печінки при 7,12-ДМБА канцерогенезі.

Рис.1. Швидкість генерування супероксидних радикал-аніонів у мікросомах клітин печінки тварин: 1 – на різних етапах канцерогенезу, індукованого 7,12-ДМБА; 2 – інтактні тварини

Швидкість генерування супероксидних радикал-аніонів на 15, 19, 21, 29, 37, 49-му тижні після введення канцерогену дорівнювала у середньому 0,50; 1,02; 0,71; 0,31; 0,55; 0,70 нмоль/мг білка за 1 хв. У мікросомах печінки інтактних тварин вона становила 0,26 нмоль/мг білка за 1 хв і з часом не змінювалась. З 15-го по 19-й тиждень канцерогенезу реєстрували 5-разове збільшення швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів — це період розвитку компенсаторних реакцій на дію хімічного канцерогену на всі системи організму і структурно-функціональних перебудов в тканинах молочних залоз у зв'язку з дією 7,12-ДМБА. Наступний етап (19—29-й тижні) характеризувався зниженням швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів, що в часі збігалося з формуванням пухлин у молочній залозі. На кривій швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів на 29-й тиждень хімічного канцерогенезу відмічався мінімум, що свідчить про початок активного росту пухлинних клітин у молочних залозах. Наступний етап канцерогенезу (37–29 тиждень) характеризувався наростанням у печінці тварин швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів. В період із 7-го місяця до 1 року після введення 7,12-ДМБА (термінальний період канцерогенезу) реєстрували високі швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів, що в 2,5 рази перевищували контрольні значення. Це може свідчити про зниження активності систем елімінації інтермедіатів кисню. В ендоплазматичному ретикулумі клітин пухлин молочних залоз зафіксовано низькі швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів, які у середньому дорівнювали 0,2 нмоль/мг білка за 1 хв. Кількісні показники швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів в ендоплазматичному ретикулумі клітин нирок тварин наведено у табл. .

Таблиця 1

Швидкості генерування (нмоль/мг білка за 1 хв) супероксидних радикал-аніонів в ендоплазматичному ретикулумі клітин нирок щурів (n=400, p<0,05) при канцерогенезі, індукованому 7,12-ДМБА

Тиждень Інтактні тварини Канцерогенез

6-й 0,29 ± 0,01 0,41 ± 0,03

15-й 0,29 ± 0,02 0,35 ± 0,03

19-й 0,31 ± 0,01 0,63 ± 0,01

21-й 0,30 ± 0,02 0,65 ± 0,02

25-й 0,30 ± 0,01 0,53 ± 0,04

29-й 0,29 ± 0,02 0,36 ± 0,03

37-й 0,31 ± 0,03 0,41 ± 0,05

49-й 0,30 ± 0,03 0,45 ± 0,01

З наведених у табл. даних випливає, що швидкість генерування супероксидних радикал-аніонів в ендоплазматичному ретикулумі клітин нирок значно перевищувала контрольні значення на всіх вивчених нами етапах канцерогенезу. Зазначимо, що кінетичні характеристики показників швидкості накопичення супероксидних радикал-аніонів у клітинах нирок та печінці схожі, що свідчить про подібність структурно-функціональних змін у мембранах клітин цих органів під дією хімічного канцерогену.

Отже, для всіх етапів хімічного канцерогенезу, індукованого 7,12-ДМБА, характерним є значне зростання швидкості накопичення супероксидних радикал-аніонів у клітинах органів тварин. Встановлено значне коливання цього показника в залежності від стадії канцерогенезу. Максимальні значення цього показника спостерігалися в період компенсаторних реакцій організму на дію хімічного канцерогену, а також у період структурно-функціональних перебудов у клітинах органів тварин, коли й реалізується максимальна ушкоджувальна дія РФК.

Кінетика швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів у клітинах печінки тварин при гепатоканцерогенезі має інший характер (рис. ). Швидкість генерування супероксидних радикал-аніонів на 4, 7, 17, 24, 63-му тижні гепатоканцерогенезу становила відповідно в середньому 1,45; 0,85; 0,42; 0,21;0,15 нмоль/мг білка за 1 хв, а у мікросомах клітин печінки інтактних тварин — 0,35 нмоль/мг білка за 1 хв. На ранніх стадіях гепатоканцерогенезу (до 2 тижнів) спостерігалося різке підвищення, а потім безперервне зниження швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів з мінімальним значенням цього показника на 24—63-й тиждень.

Рис.2. Швидкість генерування супероксидних радикал-аніонів у ендоплазматичному ретикулумі клітин печінки тварин на різних етапах гепатоканцерогенезу, індукованого НДЕА

Показники швидкості накопичення супероксидних радикал-аніонів у злоякісних пухлинах і здорових тканинах наведено на рис. .

Рис.3. Швидкість генерування супероксидних радикал-аніонів у клітинах злоякісних пухлин молочної залози і печінки та нормальних тканинах цих органів

Виявлено низькі рівні цього показника у клітинах пухлин молочних залоз і печінки порівняно із здоровими тканинами органів.

Встановлено зміни функціональної активності низькоспінової (окисненої) форми цитохрому Р-450 на всіх етапах бластомогенезу. В клітинах пухлин молочних залоз і неоплазмах печінки, індукованих 7,12-ДМБА і НДЕА відповідно, виявлено низький рівень швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів і вмісту гідроксильних радикалів, що корелює з кількістю окисненої форми цитохрому Р-450. У клітинах пухлин молочних залоз і печінки виявлено зміщення спінової рівноваги цитохрому Р-450 в бік його високоспінової форми (S = 5/2), що засвідчує функціональне домінування його відновленої форми (спектри ЕПР на рис.4,2,3, g=6,1). Низькоспінова (S1/2) форма цитохрому Р-450 на термінальних стадіях росту неоплазм не реєструється. Спектри ЕПР клітин печінки тварин (1), пухлин печінки (2) і пухлин молочних залоз (3) при температурі рідкого гелію (18 К) наведено на рис. 4.

Рис.4. Спектри ЕПР високоспінової форми цитохрому Р-450 при температурі 18 К

Переходи між двома станами гемопротеїду відбувалися повільніше порівняно з перенесенням електронів по ланцюгу детоксикаційної системи ендоплазматичного ретикулуму. Водночас одна з форм цитохрому Р-450 відновлювалась з більшою швидкістю, ніж загальний фонд гемопротеїду.

Враховуючи зростання рівнів РФК у мембранах клітин органів внаслідок порушень в електронтранспортному ланцюзі детоксикаційної системи клітин і функціонуванні цитохрому Р-450, спричинених дією хімічних канцерогенів, досліджено стан основних антиоксидантних систем клітин органів — СОД і каталази, які дезактивують відповідно супероксидні радикал-аніони і пероксид водню. Аналіз динаміки змін активності СОД у клітинах печінки та нирок за хімічного канцерогенезу, індукованого 7,12-ДМБА, засвідчує, що коливання активності ферменту дисмутації О2. у клітинах цих органів істотно різняться, коефіцієнт кореляції становить 0,66 (рис. ). Каталазна активність у цитозолі клітин печінки була зниженою на всіх стадіях розвитку пухлин молочних залоз і не корелювала з активністю СОД. У нирках активність СОД і каталази на ранніх стадіях канцерогенезу у молочних залозах на 50перевищувала аналогічні значення у тварин, яким не вводили канцероген. У тварин зі сформованими пухлинами активність цих ферментів знижувалась до мінімальних значень (40контрольних величин) .

Рис.5. Динаміка активності СОД у клітинах печінки (1) і нирок (2) за хімічного канцерогенезу, індукованого 7,12-ДМБА

Знайдено значні відміни активності СОД і каталази в еритроцитарній фракції крові. Якщо питома активність СОД в еритроцитах крові знижувалась до 75відносно контролю на 19-й тиждень канцерогенезу, а далі стабілізувалась і зберігалась на рівні активності, характерної для інтактних тварин, то для каталази характерною була низька активність упродовж усього періоду спостережень. Лише на 19-й тиждень канцерогенезу активність ферменту елімінації пероксиду водню в крові тварин збільшувалася, досягаючи рівня, характерного для СОД у цей період (рис. 6).

Рис.6. Динаміка активності СОД (1) і каталази (2) в крові тварин за канцерогенезу, індукованого 7,12-ДМБА

В клітинах злоякісних пухлин печінки, індукованих НДЕА, відмічено низькі рівні активності СОД і швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів (рис. ), що збігається з характером зміни активності цього ферменту в клітинах пухлин молочних залоз.

Рис.7. Активність Cu-, Zn-супероксиддисмутази у цитозолі (а) і швидкість генерування супероксидних радикал-аніонів у мікросомах клітин злоякісних пухлин печінки (б), індукованих НДЕА, та у контролі

На ранніх етапах індукції пухлин печінки активність ферменту елімінації гідропероксиду підвищувалась на 10-40% (залежно від органа: печінки, нирки, кров), з подальшим поступовим її активності при прогресуванні процесу і максимальних значень вона досягала при утворенні в печінці злоякісних пухлин (рис. 8).

Рис.8. Динаміка активності каталази в клітинах печінки (1), нирок (2) і крові (3) за гепатоканцерогенезу, індукованого НДЕА

Активність ферменту елімінації супероксидних радикал-аніонів в еритроцитах крові зростала, починаючи з ранніх стадій індукції пухлин печінки та утримувалася на цьому рівні впродовж усього експерименту. Порушення рівноваги між накопиченням РФК і активністю ферментативних антиоксидантних систем на різних стадіях хімічного канцерогенезу засвідчує зміщення рівноваги в бік підсилення оксидних процесів в органах тварин.

Утворення комплексів оксиду азоту з гемовими і негемовими залізовмісними білками детоксикаційної та енергетичної систем клітин за канцерогенезу печінки і молочних залоз. Оксид азоту є відносно нестабільним в аеробних умовах вільним радикалом, який виступає високоактивним плейотропним медіатором у біологічних системах. NО синтезується з L-аргініну в реакції, що каталізується NО-синтазою в клітинах усіх органів, зокрема гепатоцитами, клітинами імунної системи. Радикальні форми NО з високим ступенем спорідненості взаємодіють з гемовими і негемовими білками. Константа взаємодії NО з гемоглобіном становить 3 Ч 1010 М–1, що в 100 разів більше, ніж для СО, тоді як константа взаємодії цього білка з киснем дорівнює 6 Ч 104 М–1. Комплекс NО—Hb реагує з киснем з утворенням метгемоглобіну. Молекула NО здатна також міцно зв'язуватись з гемовим залізом(ІІІ) і повільно відновлювати його до гемового заліза(ІІ).

На стадії ініціації хімічного гепатоканцерогенезу виявлено порушення в мембранах детоксикаційної системи печінки, що виявлялося в утворенні комплексів NO—цитохром Р-450. Подальша генералізація порушень мембранного апарату клітин печінки поширювалася на енергетичну систему — залізосірчані білки електронтранспортної системи мітохондрій. Динаміку цих змін в електронтранспортних ланцюгах детоксикаційної та енергетичної систем клітин печінки на різних стадіях розвитку злоякісних пухлин печінки наведено на рис. 9.

Рис.9. Динаміка змін в електронтранспортних ланцюгах детоксикаційної та енергетичної систем клітин печінки на різних стадіях утворення й розвитку злоякісних пухлин печінки: 1 — сформовані гепатоми; 2, 3 — гепатоми, які формуються; 4 — печінка інтактних тварин

Утворення нітрозильних комплексів (NO—Fe—S-білки мітохондрій, NO—цитохром Р-450 ендоплазматичного ретикулуму), які реєстрували у вигляді триплетних структур на спектрах ЕПР, спричинювало втрату ними функціональної здатності як переносників електронів, порушення спряження біологічного окиснення з фосфорилюванням та пошкодження в системі цитохрому Р-450.

Виявлено також комплекси NO з гемовими і негемовими залізосірчаними білками N-типу в детоксикаційній та енергетичній системах клітин аденокарцином молочних залоз, яке засвідчує єдність механізму перебудови функціонування цих систем у клітинах злоякісних пухлин печінки та молочних залоз (рис. 10).

Рис.10. Утворення комплексів NО з гемовими і негемовими залізосірчаними білками N-типу електронтранспортних ланцюгів ендоплазматичного ретикулуму і мітохондрій в клітинах аденокарцином молочних залоз на різних стадіях розвитку: 1 — аденокарцинома молочної залози; 2, 3 — стадії розвитку аденокарциноми молочної залози; 4 — молочна залоза в період лактації

Гепатоцити синтезують NO з L-аргініну в кількостях, що перевищують ці показники для клітин імунної системи, ендотелію і нейтрофілів (2.105 гепатоцитів в 0,74 ммоль нітрату/нітриту за 18 год). Такі концентрації ендогенного NО здатні in vivo гальмувати активність цитохрому Р-450, тобто впливати на його активність. Комплекс NO—цитохром Р-450 є нестабільним і має спектроскопічні характеристики неактивної форми цитохрому Р-420.

З метою вивчення змін в електронтранспортних ланцюгах детоксикаційної та енергетичної систем мембран клітин молочних залоз за хімічного канцерогенезу проведено дослідження тих самих зразків клітин пухлин молочних залоз, які вивчали при фіксованих температурах рідкого азоту (77 К) і гелію (4,2—20 К). При 20 К спектри ЕПР клітин пухлин молочних залоз — аденокарциноми (рис. 11, 1) і фіброаденоми (рис. 11, 2) — мали різну конфігурацію, що засвідчує різну глибину перебудови в детоксикаційній та енергетичній системах і може стати маркером оцінювання цих змін.

Рис.11. Типові форми спектрів ЕПР клітин злоякісних і доброякісних пухлин при температурі рідкого гелію: 1 — аденокарцинома молочних залоз, індукована 7,12-ДМБА при 20 К; 2 — фіброаденома молочних залоз, індукована 7,12-ДМБА при 20 К

Як молекулярний маркер оцінки канцерогенезу молочних залоз використано кінетику формування сигналу ЕПР з триплетною структурою при g = 2,007, який є характеристичним показником злоякісного трансформування клітин. Наявність триплетної структури з розщепленням 17 Е засвідчує, що такий сигнал ЕПР зумовлений взаємодією неспареного електрона з оксидом азоту 14N.

Антиканцерогенна та антирадикальна властивості флавону. З урахуванням отриманих даних щодо змін у системі генерування й детоксикації РФК і NO та їх ролі в ініціації і промоції канцерогенезу досліджено антиканцерогенні властивості флавоноїдів, здатних уловлювати радикальні форми кисню та азоту. Виявлено значний антиканцерогенний ефект флавону (табл. 2), який полягає у зменшенні кількості тварин із злоякісними і доброякісними пухлинами (на 23 %) і з аденокарциномами молочних залоз ( на 33Крім цього, виявлено значне збільшення латентного періоду виникнення пухлин, зниження множинності пухлинних вузлів і превалювання кількості доброякісних новоутворень.

Таблиця 2

Антиканцерогенна активність флавону на моделі канцерогенезу, індукованого 7,12-ДМБА

Група тварин, Кількість тварин Частота виявлення перших пухлинних вузлів Кількість тварин з пухлинами, %

які спостерігались 4-й 8-й 12-й 16-й Всього Адено-карцинома

7,12-ДМБА 46 1 24 33 37 84,4 65,2

7,12-ДМБА + флавон 23 0 4 9 15 65,2 43,5

Примітка: 4, 8, 12, 16-й — тижні після першої ін'єкції.

Знайдено кореляцію (r0,97) між антиканцерогенною та антирадикальною активністю флавону (табл. 3 і 4). Найбільшого антирадикального ефекту досягнуто на стадії розвитку пухлин молочних залоз. Водночас за хімічного канцерогенезу у молочних залозах тварин, які не отримували флавону, на цій стадії реєстрували максимальну швидкість генерування супероксидних радикал-аніонів і відповідне збільшення гідроксильних радикалів, що індукують оксидні порушення в мембранах і ДНК.

Таблиця 3

Швидкість генерування супероксидних радикал-аніонів у клітинах печінки щурів (нмоль/мг білка за 1 хв) за антиканцерогенної дії флавону на моделі канцерогенезу, індукованому 7,12-ДМБА

Тиждень після першої ін'єкції Тип пухлини 7,12-ДМБА 7,12-ДМБА + флавон

8-й Ак Фа 0,41 ± 0,04 0,34 ± 0,01 0,36 ± 0,02 0,31 ± 0,02

15-й Ак Фа 0,50 ± 0,03 0,35 ± 0,03 0,44 ± 0,03 0,30 ± 0,04

19-й Ак Фа 1,02 ± 0,02 0,43 ± 0,03 0,85 ± 0,01 0,29 ± 0,01

Примітка. Інтактні тварини — 0,24 ± 0,02 нмоль/мг білка за 1 хв. Тут і у табл. : Ак — аденокарцинома, Фа — фіброаденома.

Таблиця 4

Вміст гідроксильних радикалів у клітинах печінки щурів (відн. од. ґ 102) за антиканцерогенної дії флавону на моделі канцерогенезу, індукованому 7,12-ДМБА

Тиждень після першої ін'єкції Тип пухлини 7,12-ДМБА 7,12-ДМБА + флавон

8-й Ак Фа 3,6 ± 0,3 2,7 ± 0.2 2,6 ± 0,1 2,1 ± 0,2

15-й Ак Фа 3,8 ± 0,2 2,6 ± 0,1 3,3 ± 0,2 2,2 ± 0,3

19-й Ак Фа 14,4 ± 0,8 5,1 ± 0,2 4,9 ± 0,4 3,1 ± 0,1

Примітка. Інтактні тварини — (1,8 ± 0,3).102 відн. од.

Радикальні форми кисню та оксиду азоту за умов постійної дії на організм малих доз іонізувальної радіації низької потужності. Виявлено багаторазове збільшення швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів і вмісту гідроксильних радикалів у мікросомах клітин печінки та нирок тварин, які протягом 1—2 років зазнавали впливу інкорпорованих радіонуклідів і зовнішнього опромінення в 30-кілометровій зоні відчуження ЧАЕС (рис. 12).

Рис.12. Швидкість генерування супероксидних радикал-аніонів у мікросомах клітин печінки (а) та нирок (б) тварин, які перебували 1—2 роки у Чорнобилі та Києві

Швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів і вмісту гідроксильних радикалів у мікросомах клітин нирок тварин, які перебували у Чорнобилі 1—2 роки, становили 1,25 ± 0,03 — 1,96 ± 0,02 нмоль/мг білка за 1 хв, а в тварин, яких утримували в Києві, значення цих показників дорівнювали 0,25 ± 0,03 — 0,76 ± 0,02 нмоль/мг білка за 1 хв. Вміст гідроксильних радикалів у мікросомах клітин нирок у ці самі терміни становив відповідно 0,095 ± 0,004 — 0,16 ± 0,07 відн. од. і 0,031 ± 0,004 — 0,054 ± 0,001 відн. од.

У тварин, які перебували у Чорнобилі, виявлено зниження функціональної активності окисненої форми цитохрому Р-450 в ендоплазматичному ретикулумі клітин печінки. Аналогічні зміни одержано і для окисненої форми цитохрому Р-450 клітин нирок.

Активність СОД і каталази у клітинах печінки та еритроцитах крові піддослідних тварин, які тривалий час перебували у зоні аварії на ЧАЕС. У тварин, які протягом 2 років перебували у 30-кілометровій зоні відчуження ЧАЕС під впливом постійної дії іонізувальної радіації низької потужності виявлено кількісні зміни активності СОД у клітинах печінки та еритроцитах у порівнянні зі щурами, яких утримували в Києві. Динаміку цих змін наведено у табл. .

Таблиця 5

Активність СОД і каталази в клітинах печінки і еритроцитах крові щурів (n=250, p<0,05) за умов постійної дії іонізувальної радіації низької потужності

Місце утримання тварин Вік тварин, міс

12 15 18

С у п е р о к с и д д и с м у т а з а

Клітини печінки, відн. од. на 1 мг білка

Чорнобиль 15,50 ± 1,40 17,80 ± 1,38 19,20 ± 1,90

Київ 15,45 ± 1,20 15,60 ± 1,25 15,72 ± 1,93

Еритроцити, відн. од. на клітину

Чорнобиль 6,82 ± 0,35 7,52 ± 0,43 9,13 ± 0,60

Київ 15,20 ± 0,22 5,24 ± 0,40 5,82 ± 0,41

К а т а л а з а

Клітини печінки, відн. од. на 1 мг білка

Чорнобиль 84,6 ± 8,8 80,6 ± 5,4 73,2 ± 4,1

Київ 102,6 ± 7,0 105,2 ± 7,8 102,8 ± 7,4

Еритроцити, відн. од. на клітину

Чорнобиль 0,93 ± 0,02 0,86 ± 0,04 0,81 ± 0,03

Київ 1,03 ± 0,08 1,02 ± 0,07 1,00 ± 0,03

Чітко видно, що підвищення активності СОД — ферменту дисмутації супероксидних радикал-аніонів у клітинах печінки та еритроцитах за умов перманентного впливу іонізувальної радіації, відбувається на фоні зниження активності каталази — ферменту інактивації пероксиду водню в органах і крові. Зниження активності каталази в клітинах печінки та еритроцитах тварин, які перебували у Чорнобилі, свідчать про "виснаженість" цього ферменту. Втрата активності каталази в умовах тривалого перебування тварин у 30-кілометровій зоні відчуження ЧАЕС може бути зумовлена не порушенням структури ферменту, а зниженням швидкості синтезу чи прискоренням його розщеплення.

Регуляторний вплив меланіну грибного походження на швидкість генерування і вміст радикальних форм кисню у мікросомах клітин печінки тварин, яких тривалий час утримували у м. Чорнобилі. Виявлено захисну дію меланіну, вилученого з гриба Cladosporium Cladosporioides, введення якого гальмує швидкість генерування супероксидних радикал-аніонів у мембранах ендоплазматичного ретикулуму клітин печінки. Якщо швидкість генерування супероксидних радикал-аніонів у мембранах мікросом клітин печінки в зоні аварії на ЧАЕС була 1,17—1,91 нмоль/мг білка за 1 хв, то після курсу введення меланіну вона становила 0,71—1,0 нмоль/мг білка за 1 хв, контроль — 0,20—0,66 нмоль/мг білка за 1 хв. Вміст гідроксильних радикалів у мембранах мікросом клітин печінки тварин, які протягом 1—2 років перебували в зоні аварії на ЧАЕС, був у межах 0,050—0,180 відн. од., а вміст цих радикалів у клітинах тварин, яких утримували на стандартному раціоні віварію в Києві, дорівнював 0,014—0,070 відн. од. (рис. 13). Меланін гальмував наростання вмісту гідроксильних радикалів до 0,033—0,060 відн. од. Отже, меланін грибного походження, який безпосередньо взаємодіє з РФК, можна пропонувати як перспективний регуляторний засіб гальмування радіаційних уражень.

Рис.13. Кінетика накопичення супероксидних радикал-аніонів у мікросомах клітин печінки тварин в умовах дії радіонуклідів (1), радіонуклідів і меланіну (2) і в контролі (3). Інтенсивність сигналу ЕПР відповідає швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів

Порушення у функціонуванні систем антиоксидного захисту (СОД—каталаза) в органах і крові тварин, які знаходились під тривалим впливом малих доз іонізувальної радіації низької потужності, у разі застосування меланіну зникли. Основні показники активності систем антиоксидного захисту в органах тварин наведено у табл. .

Таблиця 6

Активність СОД та каталази в клітинах печінки та еритроцитах крові щурів (n=250, p<0,05) за умов тривалої дії радіації низької потужності при курсовому застосуванні меланіну

Місце утримання тварин Тривалість перебування у Чорнобилі, міс

9 18 9 18

СОД, % Каталаза, %

К л і т и н и п е ч і н к и

Київ 100,0 ± 7,8 100,0 ± 6,3 100,0 ± 2,9 100,0 ± 3,6

Чорнобиль 100,5 ± 9,0 119,7 ± 7,0 82,4 ± 3,3 73,2 ± 5,3

Чорнобиль* 99,8 ± 7,9 109,8 ± 6,0 92,6 ± 2,5 94,9 ± 2,8

Е р и т р о ц и т и

Київ 100,0 ± 4,1 100,0 ± 7,5 100,0 ± 3,0 100,0 ± 3,1

Чорнобиль 131,2 ± 5,1 135,8 ± 6,9 84,5 ± 2,3 66,3 ± 7,9

Чорнобиль* 105,8 ± 5,4 103,8 ± 3,8 92,2 ± 3,2 91,6 ± 3,4

* Тварини пройшли курс лікування меланіном.

Отже, у разі курсового використання меланіну з гриба Cladosporium cladosporioides отримано результати стосовно синхронізації функціонування СОД і каталази. Коригуючий ефект меланіну триває декілька місяців, що вказує на перспективність меланіну як профілактичного засобу в зонах, забруднених радіонуклідами.

Стан негемових залізосірчаних білків, які забезпечують транспорт електронів у мембранах мітохондрій органів тварин за умов впливу на організм іонізувальної радіації низької потужності. Поява сигналу ЕПР з фактором спектроскопічного розщеплення g2,03 в органах і тканинах пов'язана з утворенням комплексів оксиду азоту з негемовими залізосірчаними білками N-типу у мембранах мітохондрій.

В електронтранспортному ланцюзі внутрішньої мембрани мітохондрій клітин печінки та нирок тварин, які тривалий час (2 роки) перебували у Чорнобилі на раціоні, що включав радіонукліди аварійного викиду 4-го енергоблоку ЧАЕС, зареєстровано сигнал ЕПР з g ,03 (рис. 14).

Відомо, що залізосірчані білки N-типу в електронтранспортному ланцюзі мітохондрій забезпечують спряження біологічного окиснення з фосфорилюванням. Утворення комплексів радикальних форм оксиду азоту із залізосірчаними білками N-типу порушує електронний транспорт, вони є характерними маркерами канцерогенезу і свідчать про порушення в клітинах, які формують розвиток стохастичних (онкологічних) і детермінованих ефектів.

Рис.14. Типові спектри ЕПР клітин печінки (а) і нирок (б) тварин за умов дії на організм іонізувальної радіації низької потужності (1) і в контролі (2)

Стан молекулярних переносників електронів мембран мітохондрій клітин надниркових залоз тварин за умов впливу на організм іонізувальної радіації. Одним з найважливіших патогенетичних механізмів, що виявляється під час перебування живих організмів у зонах, забруднених радіонуклідами, є порушення взаємодії нейрогуморальної та ендокринної систем. Відповідно до сучасних уявлень, у внутрішній мембрані мітохондрій клітин кори надниркових залоз функціонують два ланцюги перенесення електронів за умов процесів гідроксилювання стероїдів та окисного фосфорилювання. Наявність у мітохондріях гідроксилюючих та оксидазних електронтранспортних систем є характерною ознакою