НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

БАЛАШОВА Ірина Анатоліївна

УДК 575.11.113:633.16

МАРКування ГЕНІВ VRN і PPD М'ЯКОЇ ПШЕНИЦІ

МЕТОДАМИ ПЛР-АНАЛІЗУ

03.00.26 – молекулярна генетика

А в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у Південному біотехнологічному центрі у рослинництві УААН (м.Одеса)

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор, академік УААН

СИВОЛАП Юрій Михайлович, директор Південного

біотехнологічного центру у рослинництві УААН.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України

КУНАХ Віктор Анатолійович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

завідувач відділу генетики клітинних популяцій;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

ТЕРНОВСЬКА Тамара Костянтинівна,

Інститут агроекології і біотехнології УААН, завідувач лабораторії

геномної та хромосомної інженерії рослин.

Провідна установа:

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться 22.10.2002 р. о 14 годині на засіданні спеціальної вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН Україні за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано 20.09.2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Визначення молекулярно-генетичного внутрішньовидового поліморфізму та маркування генів є важливою проблемою молекулярної генетики і спрямоване на розвиток теорії й практики поліпшення рослин. Особливу увагу у цьому плані привертає найпоширеніший культурний злак – пшениця.

Спадкова мінливість пшениці в період індивідуального розвитку значною мірою обумовлена особливістю експресії генів двох генетичних систем – Vrn та Ppd, які відповідають за чутливість до яровізації та фотоперіоду. У зв'язку з тим, що основним завданням селекції є підвищення урожайності культурних рослин, успіх роботи у даному напрямку має зв'язок з результативністю відбору, який спрямований на оптимальний рівень тривалості онтогенезу, отже і на добір ефективніших Vrn та Ppd-генотипів. Цілеспрямоване використання у селекційних програмах домінантних та рецесивних генів Vrn та Ppd стримується складністю визначення генотипів за фенотиповим проявом зазначених ознак. У зв'язку з цим виникає необхідність, поряд із традиційними методами генетичного аналізу використовувати методи визначення молекулярно–генетичного поліморфізму ДНК рослин. Аналіз поліморфізму ДНК м'якої пшениці сприяє розв'язанню завдань селекції та генетики, у тому числі і виявленню ділянок ДНК, які тісно зчеплені з генами, що мають важливе господарське значення. За останні роки створено значну кількість ДНК-маркерів, що знайшли застосування у генетико–селекційних програмах. Створення молекулярних маркерів також здійснюється і відносно генів, які відповідають за тип та швидкість розвитку м'якої пшениці. Такі роботи нечисленні та, в основному, стосуються ПДРФ-маркерів (поліморфізм довжин рестрикційних фрагментів). Останні з успіхом використовуються для локалізації генів Vrn у подібних позиціях на хромосомах п'ятої гомеологічної групи, що дозволяє підтвердити високий рівень їхньої гомеології. Аналогічні дослідження проводили методом ПДРФ для генів Ppd. ПДРФ-маркери не мають широкого використання, що обумовлено трудомісткістю і високою собівартістю ПДРФ-аналізу.

Розробка більш ефективних та економних методів на базі полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) дає змогу проводити пошук ДНК-маркерів, тісно зчеплених з досліджуваними генами, та використовувати їх у генетико-селекційних дослідженнях.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділі молекулярної генетики Південного біотехнологічного центру у рослинництві (до 1999 року в складі СГІ) в межах програм (НТП) УААН “Розробка і впровадження ДНК-технологій, культури тканин та органів in vitro для розвитку теорії і практики селекції рослин” у рамках завдання “Підвищення ефективності селекції високоінтенсивних сортів пшениці за допомогою ДНК-технології” (№ 01.02.01.) та НТП УААН “Біотехнологія культурних рослин (2001 –2005 р.)''.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є маркування генів Vrn і Ppd та використання маркерів для аналізу генетичного матеріалу.

Відповідно до поставленої мети вирішували такі завдання:

1.Дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму майже ізогенних та заміщених хромосомних ліній – носіїв різних домінантних та рецесивних алелів генів Vrn і Ppd.

2. Ідентифікація ПЛР-маркерів до генів, що відповідають за тип та швидкість розвитку м'якої пшениці.

3. Визначення Vrn та Ppd-генотипів сортів ярої та озимої пшениці різних еколого-географічних зон за допомогою ПЛР-маркерів.

Об'єкт дослідження – геном м'якої пшениці.

Предмет дослідження – ідентифікація та використання поліморфізму за генами, що відповідають за тип та швидкість розвитку м'якої пшениці.

Методи дослідження – варіанти полімеразної ланцюгової реакції (RAPD,

SSRP, ISSR та STS-ПЛР), генетичний аналіз за типом та швидкістю розвитку м'якої пшениці.

Наукова новизна одержаних результатів. Наукова новизна полягає у виявленні та скринінгу поліморфних локусів ДНК, що детектують контраснті за Vrn і Ppd–генотипи методами ПЛР-аналізу. Створено систему ДНК-маркерів, що дозволяє ідентифікувати домінантний стан деяких генів, які відповідають за зниження чутливості до яровизації та фотоперіоду. Вперше отримано домінантні ПЛР-маркери до гена Vrn-D1 та показано можливість використання альтернативних домінантних маркерів для визначення Vrn-D1– генотипів рослин у популяції, що розчеплюється. Конвертовано RAPD-маркер до гену Vrn-D1 у кодомінантний STS-маркер.

Вперше створено ISSR-маркер до гена Ppd-D1a. На різноманітному

селекційному матеріалі, тестованому методами генетичного аналізу, показано зв'язок поліморфних ДНК-локусів з маркерними ознаками.

Практичне значення одержаних результатів. Практичне значення одержаних результатів полягає у запровадженні створених ДНК-маркерів для тестування Vrn та Ppd–генотипів сортів та ліній ярої і озимої пшениці, отриманих внаслідок селекції. Показано моживість використання системи ПЛР-маркерів для встановлення алельного стану гену Vrn-D1 у сортів і ліній ярої пшениці.

Особистий внесок здобувача. Експериментальна частина роботи, статистична обробка цифрового матеріалу, написання тексту дисертації та її оформлення виконано здобувачем особисто.

Аналіз та обговорення результатів проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були повідомлені на науково – методичному семінарі “ Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях” (Одеса, 1997); на Міжнародній конференції "Агробіотехнологія рослин та тварин" (Київ, 1997), на II та III Міжнародних конференціях “Використання сучасних молекулярно–генетичних і біотехнологічних розробок у генетико–селекційних дослідженнях” (Одеса 1998, 1999); на Міжнародній конференції "Молекулярная генетика и биотехнология" (Мінськ, Білорусь, 1998, 2001 р.); на Міжнародній конференції "Семинар по современным методам селекции растений" (Київ, 1999), на Міжнародній конференції "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, Росія, 2000), на 11 конференції Європейского товариства з анеуплоідів пшениці, присвяченій пам'яті О.І. Майстренко” (Новосибірськ, Росія, 2000), на Міжнародній конференції “ Plant, Animal and Microbe Genomes” (Сан–Дієго, США, 2002). Міжнародній конференції "Молекулярно-генетические маркеры растений" (Ялта, 2002).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані у трьох статтях і тезах восьми доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, експериментальної частини, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків.

Роботу викладено на 142 сторінках машинописного тексту. Дисертацію проілюстровано 27 рисунками і 8 таблицями. Список використаної літератури охоплює 191 джерело, з яких 125 закордонних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

М А Т Е Р І А Л И І М Е Т О Д И Д О С Л І Д Ж Е Н Н Я

Матеріалом для дослідження слугували:

1) майже ізогенні лінії моногено домінантні за локусами Vrn-A1, Vrn-B1, Vrn-D1, створені у генофонах озимих сортів-носіїв vrn генів [Стельмах А.Ф., 1983]: Миронівська 808, Скороспелка3б, Одеська 16, Triple Dirk C:

лінія Triple Dirk C(озима) – vrn–A1 vrn-B1 vrn–D1; лінія Triple Dirk D (яра) - Vrn–A1 vrn-B1 vrn–D1; лінія Triple Dirk B (яра) - vrn–A1 Vrn-B1 vrn–D1;лінія Triple Dirk Е (яра) - vrn–A1 vrn-B1 Vrn–D1; лінія Triple Dirk F(яра) - vrn–A1 vrn-B1 vrn–D1 Vrn 4 – генотипи.

2) нулі-тетрасомні лінії за п'ятою гомеологічною групою хромосом пшениці, створених у генофоні сорту Chinese Spring: H(нулі)5A/T(тетра)5B, H5A/T5D, H5B/T5A, H5B/T5D, H5D/T5A, H5D/T5B.

3) заміщені лінії за хромосомами другої гомеологічної групи, створені у генофоні сорту Mercia. Сорт Mercia - носій рецесивних алелів генів ppd (рpd-D1b рpd-B1b рpd-A1b); лінії: Mercia / 2D Ciano 67 (Ppd -D1a рpd-B1b рpd-A1b), Mercia / 2D RCM 71 (Ppd-D1a рpd-B1b рpd-A1b); Mercia /2B Chinese Spring (ppd-D1b Ppd- B1a ppd–A1b); Mercia / 2A C591 (ppd–D1b ppd–B1b Ppd–A1a);

4) заміщені лінії за хромосомами другої гомеологічной групи, створені у генофонах п'яти сортів озимої пшениці: Avalon / 2D Ciano 67, Avalon /2D RCM 71, Norman/2D RCM 71, Brimstoun/2D RCM 71, Brigand/2D RCM 71, Rendezvous/2D RCM 71, Mercia/2D RCM 71 (донорами гену Ppd-D1a були сорти Ciano 67 та Mara), рекомбінантна лінія Capрelle / 2B Chіnese Spring ;

5) 9 сортів ярої пшениці з різних еколого-географічних зон: Frontana (Бразилія), Bledsol (США), АНК-18А (Росія, Західний Сибір) – vrn-A1 Vrn-B1 vrn-D1 генотипи; Kentana 48 (Мексика) – vrn-A1 Vrn-B1 Vrn-D1 генотип Еритроспермум – 841 (Росія, Поволжжя), Sonalika (Індія) – Vrn-A1 vrn-B1 Vrn-D1 генотипи; Cocoraque F 75 (Мексика), Beacon (Кенія), Santa Catalina (Аргентина) - vrn-A1 vrn-B1 Vrn-D1 – генотипи.

6) 14 сортів озимої м'якої пшениці різних еколого-географічних зон: Bassvood, Seri (Мексика); Norin 1 (Японія); H87CFH10-1675, Capрelle–Desprez (Франція); YUMA131, XIAOYAN6 (Китай); Yerek-79 (Туреччина); Triple Dirk C (Австралія); Danica (Югославія); Erin (США); Победа (Росія); Комсомольская (Казахстан); Еритроспермум 80 (Киргизія).

7) сорти озимої пшениці, рецесиви за рpd-A1b, рpd-B1b, рpd-D1b: Mercia, Avalon, Norman, Brimstoun, Brigand, Rendezvous, Capрelle; слабочутливий до фотоперіоду сорт Ciano 67 (носій домінантного алелю гену Ppd-D1a);

8) 52 рослини популяції F2, що розчеплюється, яку створено від схрещування лінії Миронівська 808 Vrn-D1 (яра) х Миронівська 808 (озима);

9) 104 рослини F2 популяції, отриманої від схрещування слабочутливої до фотоперіоду заміщеної лінії Avalon /2D Ciano 67 (носій домінантного алелю Ppd-D1) х високочутливий до фотоперіоду сорт Одеська 16 (рецесив за генами ppd);

10) 12 ліній, отриманих від схрещування фоточутливого сорту Mercia х Mercia/ 2D Ciano 67; 10 ліній, створених від схрещування лінії Merсia / 2В Chinese Spring x Merсіa. Лінії цих згаданих комбінацій тестовані на фоточутливість та фотонейтральність протягом двох років у кліматичних умовах Великої Британії та Німеччини (дані з центру Джона Айнеса, Велика Британія).

Матеріали для досліджень люб'язно надані співробітниками Селекційно-генетичного інституту: завідувачем відділу спеціальної генетики, кандидатом біологічних наук Файтом В.І., академіком УААН Стельмахом А.Ф., а також доктором Ворландом A.Дж. з центру Джона Айнеса, Велика Британія.

Виділення рослинної ДНК. ДНК виділяли з етиольованих триденних паростків. Паростки (100 мг) розтирали в епендорфі з 0,5 мл лізуючого буферу (1,4 М NaCl; 20 mМ Na3EDTA; 100 mМ Tris-HCl, pН 8,0 (25 °C); 2 % CTAB). Інкубували на водяній бані протягом 1 години при 600 С. Депротеїнізацію проводили рівним об'ємом суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1). Центрифугували протягом п'яти хвилин у центрифузі Eppendorf 5415 при 12000 об/хв, водяну фазу (не зачіпаючи інтерфази) переносили в інший епендорф. ДНК екстрагували рівним об'ємом ізопропанолу з наступним центрифугуванням протягом п'яти хвилин при 12000 об/хв. Надосадову рідину обережно зливали. Осад промивали 1 мл 70% етанолу. Отриманий осад ДНК розчиняли в 500 мкл розчину TE (10 mМ Tris-HCl, pH 8,0; 1 mМ Na3EDTA) з 1 мкг/мл РНК-азою А. Концентрацію ДНК вимірювали на флуориметрі TKO Hoefer-100 у розчині 1 х TNE (10 mМ Tris-HCl pH 7.4 (25 0C); 100 mМ NaCl; 1mМ Na3EDTA) з 100 мкг/мл інтеркалюючого барвника Hoechst 33258.

Умови ПЛР, гель-електрофорез, візуалізація ампліконів. Реакційний буфер для ампліфікації методом ДП-ПЛР містив: 50 mМ KCl; 20 mМ Трис-HCl, pН 8,4; 3,5 mМ MgCl2; 0,01 % Tween-20; 0,15 mМ кожного dNTP; 0,2 mkМ праймера; 20 нг ДНК і 1од. Taq-полімерази. ПЛР проводили при двох різних температурах відпалу залежно від довжини праймера. Для тестування продуктів ампліфікації застосовували 2,0 % агарозні гелі. Для реакції з ISSR-праймерами використовували буфер для ПЛР, що містить 2 mМ хлориду магнію. Температура відпалу ISSR-праймерів була 580С для праймерів із тринуклеотидним повтором і 550С для праймерів з динуклеотидним повтором. Гелі з ПЛР-продуктами забарвлювали бромистим етидієм і фотографували в УФ-світлі на фотоплівку "Мікрат 300". Ампліфікацію з SSR-праймерами проводили в буфері ідентичному такому для RAPD-PCR, однак, вміст MgCl2 варіював від 2,5 до 3,5 mМ. Температура відпалу SSR-праймерів була 52-55 0С. STS-PCR проводили при температурі відпалу за даними програми “Oligo”. Кількість циклів ампліфікації для всіх ПЛР-методів – 35. Продукти ампліфікації фракціонували в 10 % ПААГ, візуалізували фарбуванням гелів сріблом. Реакцію ампліфікації проводили на приладах "Терцик", Росія, Москва .

Клонування фрагменту ДНК проводили у “Т-векторі”: pGEM-T з використанням набору “pGEM – T Esay Vector System “ (Promega). Секвенування ДНК проводили на секвенаторі “MegaBASETM 1000 DNA Sequencing System” и “Sequence Analyzer software”, конструювання спрямованих праймерів проводили за програмою “Oligo”.

Гібридологічний аналіз популяцій F2 та F3 проводили за ознаками типу та швидкості розвитку. Аналіз розщеплення проводили шляхом обліку ярих (колосіння до 85 діб) і озимих (відсутність колосіння за 100 та більше діб після сходів). Встановлення Ppd генотипів F2 і F3 популяцій проводили за реакцією на фотоперіод (ранні:пізні). Практично здобуті та теоретично очікувані розчеплення використовували для аналізу відповідності фактичних даних за критерієм c2.

В и з н а ч е н н я з ч е п л е н н я Д Н К-м а р к е р і в з а д о п о м о г о ю п р о г р а м и “М A P M A K E R”. Для обробки результатів аналізів використовували комп'ютерну програму MAPMAKER, 3.0. Для встановлення зчеплення ДНК-маркера з генетичним локусом використовували двоточковий аналіз. Локус вважали зчепленим з геном, якщо значення LOD (logariphm of odds ratio), складало 3,0 та більше. Частоту рекомбінації оцінювали за принципом максимальної правдоподібності. Для перерахування значення частоти рекомбінації у сантиморганіди (сМ, відстань на генетичнії карті) використали картувальну функцію Козамбі. Маркер вважають зчепленим з генетичним локусом, якщо відстань не перевищує 10 сМ.

Р Е З У Л Ь Т А Т И Д О С Л І Д Ж Е Н Н Я Т А Ї Х О Б Г О В О Р Е Н Н Я

1. SSR-аналіз ДНК майже ізогенних за Vrn генами ліній. SSR-аналіз проводили за допомогою праймерів, розроблених щодо мікросателітних локусів хромосом п'ятої гомеологічної групи, а саме: WMS192, 190, 186 (5AL); WMS 159, 554 (5BL); WMS 212, 292 (5DL). Особливу увагу приділяли локусам WMS 186, 554, 292 и 212 у з'вязку з тим, що дані мікросателіти картовано у зоні локалізації генів Vrn. Поряд з WMS пшениці для SSR-аналізу використали праймери до мікросателітних локусів інших злаків, відповідно гомеології їхніх хромосом.

SSR-PCR з кожною із пар праймерів (використано 22 пари праймерів) не

дозволив виявити поліморфізм ДНК майже ізогенних ліній, створених у генофонах чотирьох сортів озимої пшениці. Спектри продуктів реакції виявились ідентичними у аналізованих генотипів, за винятком SSR-аналізу з праймерами до WMS 159 (5B хромосома). У даному випадку виявлено поліморфний амплікон 500 п. н. у лінії, що є носієм гену Vrn-D1. Отримані результати суперечать існуючим літературним даним, оскільки ген Vrn-D1 локалізується у 5DL хромосомі, а мікросателітний локус WMS 159 є специфічним до 5В хромосоми.

SSR-PCR з праймерами до WMS 212 та 292 не дозволив виявити поліморфізм ДНК ізогенних за Vrn генами ліній. Як показано Snape [1998 р.], WMS 212 і 292 тісно зчеплені з локусом Vrn-D1, отже, ці мікросателітні локуси можна використовувати для ідентифікації Vrn-D1 генотипів. Проте, відсутність поліморфізму у ДНК ізогенних ліній, ідентичність їх продуктів реакції з праймерами до WMS 212 і 292, найімовірніше, свідчить про відсутність тісного зчеплення даних мікросателітних локусів з геном Vrn-D1. Проведений SSR-PCR не дозволив використати рекомендовані мікросателітні локуси як ДНК-маркери. Факт тісного зчепленя WMS 212 і 292 з геном Vrn-D1 не дістав підтвердження при аналізі більшого за обсягом генетичного матеріалу.

Обмеженням використання ДНК-маркерів у селекційних програмах є їх

специфічність щодо конкретних генотипів (батьківських форм та відповідних популяцій, що розщеплюються). Отримання таких маркерів має велику цінність, проте вони не відповідають вимогам практичного використання, бо не забезпечують тестування Vrn-генотипів сортів та ліній різної селекції. Негативний результат SSR-аналізу сприяв використанню методів ампліфікації з довільними праймерами (багатолокусні системи).

2. ПЛР з довільними праймерами. За методом RAPD-PCR використано більше 600 праймерів, що дозволило проаналізувати у середньому 3000 ДНК-ампліконів. При проведенні RAPD-аналізу майже ізогенних за Vrn генами ліній та їх рекурентних батьків виявлено 8 поліморфних локусів ДНК, що ідентифікують різні Vrn-генотипи. Отримані результати свідчать про низькі рівні поліморфізму ДНК ізогенних за Vrn генами ліній, що складає 0.3 % від ампліфікованої частини геному. ПЛР-аналіз із довільними праймерами демонструє, що більша частина виявлених поліморфних ампліконів, шість із восьми, ідентифікує Vrn–генотипи тієї чи іншої лінії, створених у одному, рідко у двох генофонах. Незважаючи на те, що даний генетичний матеріал є практично ідентичними генотипами, не кожний з виявлених поліморфних продуктів варто розглядати як ДНК-маркери до індивідуального гена. Процес пошуку молекулярних маркерів потребує порівняльного аналізу ДНК ідентичних за Vrn генотипів, зокрема, аналізу декількох наборів майже ізогенних ліній та їх рекурентних батьків. Порівняльний аналіз дозволяє уникнути помилкової інтерпретації результатів аналізу та, як наслідок, забезпечити високу надійність отриманих маркерів.

Скринінг поліморфних ампліконів, виявлених при використанні ампліфікації з одиничними довільними праймерами, дозволив відібрати два фрагменти ДНК, які можна розглядати як потенційні маркери.

Поліморфний амплікон розміром 500 п. н., який одержано за використанням ампліфікації з парою одиничних праймерів р. 101/ 109, маркує лінії моногенно домінантні за геном Vrn-B1, створені у генофонах трьох сортів озимої пшениці. Поліморфний амплікон розміром 657 п. н., що отримано при використанні праймеру р.116 (WMS159L), маркує лінії, моногенно домінантні за геном Vrn-D1, створені у генофонах чотирьох сортів озимої пшениці.

3. Маркування гена Vrn-B1. Для отримання майже ізогенних ліній в декількох генофонах озимої пшениці донорами генів Vrn були лінії сорту Triple Dirk, зокрема, для створення ліній моногенно домінантних за Vrn-B1 донором була лінія Triple Dirk В. Можливо, що виявлений поліморфизм у ізогенних ліній може бути обумовлений особливостями ДНК лінії-донора та не стосується безпосередньо маркуємого алеля. У зв'язку з цим ампліфікували ДНК сортів ярої пшениці різних еколого-географічних зон. Сорти ярої пшениці розрізняються за Vrn–генотипами, що підтверджено результатами генетичного аналізу. Ампліфікація з парою одиничних праймерів р. 101/109 свідчить, що поліморфний амплікон розміром 500 п.н. присутній як у сортів моногенно домінантних за Vrn–B1, так і у сортів, що знаходяться під дігенно домінантним Vrn–B1Vrn–B1, або Vrn–B1Vrn–D1 контролем. У ДНК сортів, які є носіями рецесивних алелів vrn-B1, спостерігалась відсутність даного амплікону. Отримані результати демонструють можливість використання RAPD-амплікона розміром 500 п. н. як ДНК-маркера до гена Vrn-B1.

Майже ізогенні лінії у генофоні Triple Dirk представлені лініями, моногенно домінантними за генами Vrn-A1, Vrn–B1, Vrn–D1 та Vrn 4 (лінія Triple Dirk F). Щодо існування гена Vrn 4 висловлюються суперечливі думки. Припускають, що гени Vrn–B1 та Vrn 4 локалізовані у 5В хромосомі. Кількість сортів, які імовірно є носіями гена Vrn 4, обмежена. При проведенні ПЛР-аналізу ізогенних ліній Triple Dirk поліморфний амплікон 500 п. н. виявлено як у лінії Triple Dirk В, так і у лінії Triple Dirk F. Зважаючи на погляди деяких авторів, які вважають, що лінія Triple Dirk F знаходиться під Vrn 4 контролем, та результати ПЛР-аналізу (наявність однакових за розміром поліморфних ампліконів у ліній з різним Vrn-контролем), можна припустити високий рівень гомеоалельності генів Vrn-B1 та Vrn 4.

4. Маркування гена Vrn-D1. Для маркування гену Vrn-D1 використовували

ПЛР з довільними праймерами. RAPD-аналіз проводили на ДНК майже ізогенних за Vrn генами ліній, на ДНК ліній з нулі–5/тетра–5 заміщеннями хромосом, створених у генофоні сорту Сhinese Spring, рослинах популяції F2, що розщеплюється, та сортах ярої пшениці різного походження.

Використання деяких праймерів дозволило виявити поліморфні фрагменти ДНК, що детектують лінії з Vrn-D1 генотипом. У випадку проведення реакції амплифікації з р.116 виявлено поліморфний амплікон розміром 657 п. н., який становить найбільший інтерес у з'вязку з тим, що даний фрагмент ДНК присутній у ліній, моногенно домінантних за Vrn-D1, створених у чотирьох генофонах озимої пшениці. Встановлення хромосомної локалізації отриманого RAPD-фрагмента проведено на ДНК нулі-тетрасомних ліній (компенсація за п'ятою групою хромосом пшениці): H(нулі)5D/T(тетра)5A, H5D/T5B, H5A/T5D, H5B/T5A), створеними у генофоні сорту Chinese Spring. Цей генетичний матеріал є зручним об'єктом для підтвердження можливості використання амплікону 657 п.н. як ДНК-маркера до гену Vrn-D1, оскільки сорт Chinese Spring є носієм гена Vrn-D1 у домінантному стані. Ампліфікація з р. 116, що проведена на ДНК нулі-тетрасомних ліній, свідчить про присутність поліморфного фрагмента у ліній з нормальною та подвійною кількістю 5D хромосом на відміну від ДНК ліній, де 5D хромосоми заміщені на 5А, або 5В хромосоми.

ПЛР-аналізу підлягали ДНК ярих сортів пшениці різного еколого- географічного походження. Спектри продуктів ПЛР з р.116 дозволяють ідентифікувати сорти, що є носіями домінантних алелів гена Vrn-D1 за наявністю поліморфного амплікону 657 п. н. Присутність поліморфного продукту не залежить від моно- чи дигенного Vrn контролю аналізованих сортів. Використання праймера р.116 та пари довільних праймерів р.101/109 дає можливість детекції дигенного Vrn-B1Vrn-D1 контролю сорту Kentana 48 у зв'язку з присутністю поліморфних продуктів 500 п.н. та 657 п.н. Результати ПЛР-аналізу збігаються з результатами генетичного аналізу із ототожнення Vrn–генотипів сортів ярої пшениці, що аналізуються.

5. Використання ISSR-PCR для маркування гену Vrn-D1. Ізогенні за Vrn-генами лінії були вихідним генетичним матеріалом для пошуку ДНК-маркерів методом ISSR-аналізу. В реакції ампліфікації використовували 20 ISSR-праймерів, що є ди- та тринуклеотидними мотивами. Декілька праймерів (шість) не дозволили отримати чітких спектрів продуктів ампліфікації. ISSR-PCR з праймером Isr7 (АGC)6G дає можливість ототожнювати лінії – носії домінантного гену Vrn-D1. Характер поліморфізму полягає у відсутності продукту ампліфікації у зоні 850 п.н., що означено як нуль-алель 850(-). Нуль-алель 850(-) виявлено у моногенно домінантних за Vrn-D1 геном ліній, створених у генофонах сортів Triple Dirk, Миронівська 808, Одеська 16 и Скороспелка 3б. Відповідно, у ліній з генотипами Vrn-A1, Vrn-B1 та їх рекурентних батьків фрагмент ДНК розміром 850 п. н. присутній.

ISSR-аналіз ДНК сортів ярої пшениці різного еколого-географічного походження показує відсутність амплікону 850 п.н. тільки у сортів, що знаходяться під моногенно домінантним Vrn-D1 контролем (Beacon, Cocoraqua 75, Santa Catalina). У озимих сортів, а також у сортів з моногенним Vrn-A1, Vrn-B1 контролем та дигенним Vrn-A1Vrn-D1, Vrn-B1Vrn-D1 визначено наявність алелю 850(+).

Отримані результати дозволяють розглядати нуль-аллель 850(-) як маркер рослин ярої пшениці, що знаходяться під моногенним Vrn-D1 контролем.

Використання таких маркерів (відсутність продукту реакції), у деяких випадках, дозволяє детальніше проводити оцінку Vrn-генотипів рослин ярої пшениці.

Використання RAPD-маркера 657 п.н. та ISSR-маркера 850(-), дає змогу по- перше, виявити присутність гену Vrn-D1 у сортів та ліній, що аналізуються, та, по-друге, виключити або довести присутність у геномі інших домінантних алелів генів Vrn.

6. Аналіз популяції F2, що розчеплюється. Процес створення ДНК-маркерів до індивідуальних генів потребує вивчення рослин популяції, що розчеплюється, як за допомогою ПЛР-методів, так і шляхом гібридологічного аналізу. Порівняння результатів гібридологічного аналізу за типом розвитку (ярі:озимі) та ПЛР-аналізу, за ознакою наявність / відсутність поліморфного продукту, дозволяє дати оцінку зчеплення маркера з визначеним геном та довести ефективність його подальшого використання. З таким наміром гібридологічному аналізу було піддано рослини з популяції F2, яку створено від схрещування лінії моногенно домінантної за геном Vrn-D1 Миронівська 808 х озимий сорт Миронівська 808 ( рецесив за vrn генами). Насіння F2 від згаданої комбінації вирощували в умовах, що виключають вплив яровізаційних температур. Для кожної з 52-х рослин популяції позначали період колосіння. Проведено аналіз за типом розвитку – ярі : озимі. До числа ярих зараховано рослини, що перейшли до генеративної стадії розвитку (колосіння, або формування трубки колосу), а до числа озимих – рослини, розвиток яких зупинено на стадії кущіння. Отримані результати дозволяють поділити популяцію на два класи у співвідношенні близькому до 3:1, відповідно критерію ч2 (табл.1).

Аналіз ДНК рослин популяції F2 проводили методами RAPD та ISSR-PCR. Матеріалом для ПЛР-аналізу була ДНК, яку отримано з індивідуальних рослин популяції. Реакцію ампліфікації проводили з використанням довільного праймера р.116 та ISSR праймера Isr7. ПЛР-аналіз здійснювали на гібридах F1 та F2, а також на ДНК їхніх батьківських форм. Порівняння спектрів ампліфікації аналізованих ДНК свідчить про подібність електрофореграм рослин F1 (гетерозиготи за Vrn-D1) зі спектром ампліфікації одного з батьків, зокрема лінії моногено домінантної за локусом Vrn-D1 (домінантна гомозигота). ПЛР-аналіз з р.116 проводили на ДНК 52-х рослин популяції F2,. За ознакою наявність / відсутність фрагмента 657 п.н., гібридну популяцію поділено на два класи : 41 яру рослину та 11 озимих, при теоретично очікуваному розподілу 39:13. Кожний з фактично отриманих розподілів відповідає теоретично очікуваному 3:1 за критерієм ?2 (табл.1).

ISSR-аналіз рослин F2 дозволяє поділити популяцію, за ознакою відсутність / наявність фрагмента розміром 850 п.н. також на два класи, але у співвідношенні 1:3. Відсутність амплікону спостерігали у ярих рослин з найбільш раннім терміном колосіння. Дослідження генетичних ефектів генів Vrn доводять, що раннє колосіння є характерною рисою домінантних гомозигот за Vrn, у даному випадку за Vrn-D1. У ярих рослин з пізнім колосінням або формуванням трубки колосу, можливо гетерозигот за Vrn-D1 / vrn-D1, а також у озимих форм (рецесиви за vrn), відсутності амплікону 850 п. н. не спостерігали. Порівняння результатів ISSR, RAPD та гібридологічного аналізів показує, що гібридологічний та RAPD методи дають змогу ідентифікувати ярі та озимі форми, ISSR-аналіз дозволяє, у свою чергу, поділити групу ярих рослин на домінантні гомозиготи за ознакою нуль-алель 850(-) і гетерозиготи за наявністю фрагмента 850(+) у співвідношенні 1:2, відповідно (табл.1).

Таблиця 1

Розщеплення за типом розвитку (ярі:озимі) популяції F2 від схрещування Миронівська 808 Vrn-D1(яра)хМиронівська 808 (рецесив, озима), отримане

гібридологічним, RAPD- та ISSR-аналізами

Метод аналізу Фактично спостережене Теоретчно очікуване c2 *

Гібридологічний 42 : 10 39 :13 0,92*

RAPD 41 : 11 39 : 13 0,41*

ISSR 12 : 40 13 : 39 0,25**

Примітки: *c 23 : 1< 3,84 при df=1 **c 21 : 3< 3,84 при df=1

Створено два домінантних маркери до гена Vrn-D1, які позначені як SBC 657 та SBC 850, відповідно.

7. Створення кодомінантного STS-маркера до гена Vrn-D1. Для створення STS-маркера матрицею був RAPD-маркер SBC 657. Поліморфний фрагмент ДНК

вилучали з агарозного гелю та секвенували за методом Сенгера. Проводили аналіз секвенованої послідовності за допомогою комп'ютерних програм BLSTN 2.1.2, NSITE, FASTA, FGENESH 1.0. Відповідно результатам аналізу секвенований аплікон–маркер не містить зон інтронів, промоторів та енхансерів. Показана гомологія SBC 657, в основному, в позиціях 153-605 п.н. з кДНК деяких видів рослин, переважно у злаків. Рівень гомології не перевишує 3% від розміру аналізованих кДНК. Виявлено часткову гомологію секвенованого фрагмента з ДНК, що кодує білок alpha / beta–type gliadin Triticum urartи. Прогнозується можливість кодування +ланцюгом маркера SBC 657, у позиціях 2-655 п. н., молекули білка розмірому 218 амінокислот. Проведений аналіз свідчить, що секвенований фрагмент, в основному, є транскрибованою частиною ДНК м'якої пшениці.

Відповідно програмі “Oligo” сконструйовано спрямовані пари праймерів до кінцевих ділянок секвенованого фрагмента, що дало змогу провести STS-аналіз ДНК різного генетичного матеріалу.

Left Primer : 5' CCAACACTGGAACACGACACG

Position: 4 Tm = 53 Length : 21

Right Primer : 5'CTAACATATTCCAACCAAACCC

Position: 588 Tm = 52,6 Length : 22

STS-аналіз ДНК ізогенних ліній показує, що у генотипів – носіїв рецесивних алелів vrn-D1 продуктом ампліфікації є поліморфний фрагмент розміром 820 п. н., на відміну від ліній з моногенно домінантним Vrn-D1 контролем, де ампліфікується фрагмент розміром 780 п. н. Аналіз ДНК нулі-тетрасомних ліній свідчить, що у ліній з компенсацією 5D хромосом не спостережено продуктів реакції розміром 820 та 780 п. н. У ліній, де 5D хромосоми присутні у нормальній чи подвійній кількості, продуктом реакції є фрагмент 780 п. н. Наявність цього поліморфного фрагмента обумовлена присутністю домінантних алелів Vrn-D1 у сорту Chinese Spring. Таким чином, підтверджено хромосомну локалізацію STS-маркера.

Аналіз рослин F1 та їхніх батьківських форм свідчить, що маркер має кодомінантну природу, оскільки у гібридних рослин (гетерозиготи за Vrn-D1) виявлено фрагменти ампліфікації як 780 п. н., так і 820 п. н. STS-аналіз рослин F2 дозволяє поділити популяцію на три генотипічних класи у співвідношенні 1:2:1, відповідно критерію ч2. Для рослин, що охарактеризовані як озимі (10 рослин) показано присутність поліморфного амплікону розміром 820 п.н. У ярих рослин з найбільш раннім терміном колосіння (12 рослин) виявлено поліморфний фрагмент ДНК 780 п.н., а для ярих з пізнім колосінням (30 рослин) присутні обидва фрагменти (рис.1).

Рис. 1 Електрофореграма продуктів STS - аналізу ДНК рослин F2:

1, 3 – ДНК ярих рослин F2 популяції (раннє колосіння);

2, 4, 7 – ДНК озимих рослин популяції F2;

5, 6 – ДНК ярих рослин популяції F2 (пізнє колосіння).

Поліморфні амплікони позначено стрілками

STS-аналіз показує, що фрагмент ДНК 780 п.н. є маркером до домінантного алеля гена Vrn-D1, а амплікон 820 п. н. – маркер до рецесивного алеля vrn-D1. Маркери позначено як: SBC 780 та SBC 820, відповідно. Результати STS-PCR рослин F2 популяції відповідають результатам гібридологічного аналізу за типом розвитку (ярі:озимі).

STS-PCR використовували для аналізу ДНК сортів ярої пшениці з різних еколого-географічних зон (Vrn-генотипи визначено).

За результатами STS-аналізу ДНК різних сортів ярої м'якої пшениці показано, що маркер SBC 780 виявлено у сортів, які є носіями гена Vrn-D1 незалежно від моногенно домінантного Vrn-D1 контролю, чи дигенного Vrn-A1Vrn-D1, Vrn-B1Vrn-D1 контролю. У сортів, які є носіями рецесивних алелів vrn-D1, виявлено маркер SBC 820. Результати STS-аналізу, що отримано на різному генетичному матеріалі, відповідають результатам маркування гена Vrn-D1 за допомогою домінантних RAPD- та ISSR-маркерів. Маркування гена Vrn-D1 може бути здійснено з кожним із створених ПЛР-маркерів за переліком особливостей тестованих генотипів та особливостей маркерів, що використуються.

8. Визначення зчеплення STS-маркера з геном Vrn-D1. Для встановлення зчеплення SBC 780 з геном Vrn-D1 використовували результати гібридологічного та STS-аналізів. Дані стосовно кожної з рослин популяції F2 реєстрували за допомогою літер А, В, та Н, що означали: А – ярі з раннім колосінням; Б – озимі; Н – ярі з пізнім колосінням (для гібридологічного аналізу). Аналогічне позначення літерами використано для результатів STS-аналізу, де А – фрагмент величиною 780 п. н., В – фрагмент 820 п. н., Н – обидва фрагменти 780 / 820 п.н. Частоту рекомбінаційного процесу обчислено за допомогою програми Mapmaker та переведено у сантиморганіди за функцією Kозамбі та Холдейна. Відстань ДНК-маркера від гена Vrn-D1 на хромосомній карті складає 1 сМ. Отримані результати свідчать про тісне зчеплення маркера SBC 780 з геном Vrn-D1.

9. Маркування гена Ppd-D1a. Для виявлення поліморфних фрагментів ДНК, що є потенційними маркерами до генів Ppd, проведено ПЛР-аналіз заміщених за другою групою хромосом ліній, створених у генофоні сорту Mercia. Методами ПЛР-аналізу виявлено декілька поліморфних фрагментів ДНК, що ідентифікують лінії з різними Ppd генотипами. Відібрано два поліморфних амплікони, які можна розглядати як ДНК-маркери, зокрема, за методом ISSR-аналізу отримано маркер до гена Ppd-D1a, з відсутністю продукту ампліфікації у зоні 350 п.н., що позначений як нуль-алель 350(-). Отримані результати мають підтвердження при проведенні ампліфікації з праймером (AG)6C на ДНК заміщених за 2D хромосомами ліній, створених як від різних рекурентних батьків, так і від різних донорів 2D хромосом. Аналізували лінії: Avalon / 2D Ciano 67, Avalon / 2D RCM 71, Norman / 2D RCM 71, Brimstoun / 2D RCM 71, Brigand / 2D RCM 71, Rendezvous / 2D RCM 71 та ДНК рекурентів. Електрофореграми продуктів реакції показують міжсортовий поліморфізм ДНК рекурентів у зоні 600-800 п. н., в той час, як у низькомолекулярної частині спектра, зокрема у 400-300 п. н., поліморфізм відсутній. Показано, що в усіх аналізованих заміщених ліній (носії Ppd-D1a) реєструється нуль-алель 350(-).

ISSR-аналіз проводили на ДНК 12-ти ліній, що отримано від схрещування фоточутливого сорту Mercia x Mercia / 2D Ciano 67 (носій Ppd-D1a). Лінії вирощували та тестували на фоточутливість / фотонейтральність у кліматичних умовах Великої Британії та Німеччини протягом двох років. Результати ISSR-аналізу свідчать, що нуль алель 350(-) виявлено тільки у фотонейтральних, на відміну від фоточутливих ліній. Отримані результати свідчать, що поліморфизм ДНК аналізованого матеріалу у зоні 350 п.н. обумовлений заміщенням 2D хромосоми рекурентів на 2D хромосоми сортів-донорів.

Аналіз популяцій F2 та F3, що розщеплюються. Аналізу підлягали 104 рослини популяції F2, створеної від схрещування фотонейтральної лінії Avalon / 2D Ciano 67 (Ppd-D1a, раннє колосіння) х фоточутливий сорт Одеська 16 (рецесив за Рpd, пізнє колосіння). ISSR-аналіз ДНК індивідуальних рослин дозволяє поділити популяцію за алельним станом ISSR-локусу 350(-) / 350(+) на два класси у співвідношенні 1:3 за критерієм c2, що свідчить про моногенний контроль фотоперіодичної чутливості. (табл.2).

Таблиця 2

Розщеплення у комбінації схрещуваня Avalon/2D Ciano 67 (рання) х Одеська 16 (пізня) на раннє : пізне колосіння рослин та співвідношення розщеплення за алельним станом ISSR–локусу 350(-)\350(+)

Метод аналізу Фактично спостережене Теоретично очікуване c2

Гібридологічний ISSR- PCR 77 : 27 22 : 82 78 : 26 26 : 78 0,05* 0,82**

Примітки: *c 23:1< 3,84 при df=1 **c 23:1< 3,84 при df=1

Нуль-алель 350(-) виявлено у слабо чутливої до фотоперіоду батьківської лінії Avalon /2D Ciano 67 та 22-х аналізованих рослин F2, в основному з найбільш раннім часом колосіння. Генетичні ефекти генів Ppd свідчать, що раннє колосіння є характерною ознакою домінантних гомозигот за Ppd у порівнянні з гетерозиготами. Електрофореграми ДНК інших 82 рослин та їхнього фоточутливого батька показують присутність продукта ампліфікації розміром 350 п. н. Для кожної з рослин популяції проводили аналіз швидкості розвитку. Гібридологічний аналіз підтвердив, що різниця між заміщеною лінією і сортом Одеська 16 за Ppd контролюється одним геном (табл.2).

Результати ISSR-аналізу індивідуальних рослин популяції F2 показують можливість маркування домінантних гомозигот за Ppd-D1.

Для підтвердження отриманих результатів проводили аналіз за швидкістю розвитку рослин популяції F3. Необхідність проведення цього аналізу обумовлена тим, що у деяких випадках період колосіння домінантних гомозигот та гетерозигот може бути однаковий. Насіння F3 вирощували сім'ями: домінантні гомозиготи (відбір за результатами ISSR-PCR), гетерозиготи та рецесивні гомозиготи. Серед ліній F3, що охарактеризовані як домінантні гомозиготи, за одиничним винятком, розщеплення за терміном колосіння не виявлено. Таким чином, за допомогою ISSR-маркера – нуль-алель 350(-) проведено відбір носіїв гена Ppd-D1a у домінантно гомозиготному стані. Маркер позначено як SBC 350.

Встановлено зчеплення SBC 350 з геном Ppd-D1. Відстань ДНК-маркера від гену Ppd-D1а на хромосомній карті складає 1,9 сМ. Отримані результати свідчать про тісне зчеплення маркера SBC 350 з геном Ppd-D1a.

10. Маркування гену Ppd-B1а. Для створення маркера до генів Ppd використано SSR-аналіз. Ампліфікацію проводили з парами праймерів до мікросателітних локусів хромосом другої гомеологічної групи пшениці та ячменю, що обумовлено гомеологією хромосом злаків, а також гомеологією генів, що відповідають за однакові ознаки. SSR-PCR з HMS 36 (мікросателітний локус ячменю) показує присутність поліморфного амплікону 180 п.н. у