НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

БАБІЙЧУК ЛЮБОВ ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 57.043:612.111:576.31:547.42

МЕХАНІЗМИ ТЕМПЕРАТУРНО-ОСМОТИЧНОЇ СТАБІЛІЗАЦІЇ ЕРИТРОЦИТІВ ПРИ ОХОЛОДЖЕННІ Й ЗАМОРОЖУВАННІ

У ПРИСУТНОСТІ НЕПРОНИКАЮЧОГО КРІОПРОТЕКТОРА

03.00.19 – кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Харків - 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України

Наукові консультанти: академік НАН України, доктор медичних наук, професор Грищенко Валентин Іванович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України, директор;

член-кореспондент НАН України, доктор медичних наук, професор Білоус Аполлон Максимович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, головний науковий співробітник відділу кріобіології систем репродукції.

Офіційні опоненти: Доктор біологічних наук Вишневський Валентин Йосипович, Інститут тваринництва УААН; головний науковий співробітник, лабораторія генетики;

доктор біологічних наук, професор Каліман Павло Авксентійович, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, завідувач кафедри біохімії;

доктор медичних наук, професор Юрченко Тетяна Миколаївна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України, завідувач відділу кріоморфології.

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Е. Кавецького НАН України, відділ імуноцитохімії

Захист відбудеться “26”листопада 2002 р. о “1330” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23)

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23)

Автореферат розісланий “18”жовтня 2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сьогодні існує ціла система концепцій, які пояснюють причини руйнування клітин при низькотемпературному впливі (Lovelock J.E., Polge C., 1954; Mazur P., 1966; Meryman H.T., 1966, 1982, 1983). Однак механізми, за допомогою яких клітини здатні зберігати свої біологічні властивості при впливі низьких температур та інших екстремальних факторів, все ще залишаються неясними. Разом з тим, вирішення цих питань має велике як фундаментальне, так і прикладне значення, оскільки дозволить істотно змінити технологічні процеси кріоконсервування клітинних суспензій, використовуваних у медицині (Аграненко В.А. и др., 1983; Виноград-Финкель Ф.Р. и др., 1980; Терехов Н.Т., Петров М.М., 1983; Sumida S., Oshikawa K., 1999) й інших галузях народного господарства (Белоус А.М., Грищенко В.И., 1994; Пушкарь Н.С., Белоус А.М., 1977).

Загальним недоліком відомих гіпотез кріопошкоджень є однобічне тлумачення процесів кріодеструкції клітин, наприклад, ролі поза- і внутрішньоклітинної кристалізації і таких супутніх процесів, як зміна тонічності середовища і рН у рідких мікрофазах закристалізованої матриці. При цьому фізіологічні системи клітин, відповідальні за збереження їхньої структурно-функціональної повноцінності в умовах охолодження й заморожування, залишалися мало дослідженими. Більш того, вважалося, що охолодження клітин від фізіологічних температур до 00С не супроводжується істотною зміною властивостей їхніх мембран і цитозольних білків, що впливають на стабільність клітини в цілому. Разом з тим, відомий феномен холодового шоку, коли клітини гинуть при охолодженні в області позитивних температур (0-40С), свідчить про те, що зниження температури до 00С є одним із важливих факторів їхнього ушкодження.

Останнім часом молекулярні механізми температурно-осмотичного шоку клітин продовжують інтенсивно вивчатися (Белоус А.М. и др., 1985; Бондаренко В.А., 1988), визначається загальна закономірність і послідовність процесів, що протікають у мембранах і клітинах у зазначених вище температурних умовах.

У наших попередніх дослідженнях з вивчення механізмів температурного шоку еритроцитів (Бабийчук Л.А., 1985; Белоус А.М. и др., 1985; Бондаренко В.А., 1988) було встановлено, що інкубація клітин при 00С в гіпертонічних розчинах солей і неелектролітів може призводити до підвищення їхньої стійкості до наступної зміни температури. Було виявлено, що в умовах температурно-осмотичного впливу на клітини відбувається деформація плазматичної мембрани, що вказувало на участь у цих процесах ліпідного бішару і білків мембрани, а також цитоскелетної мережі, стан якої контролює форму й об’єм клітин [Белоус А.М. и др., 1978, 1985).

Разом з тим, детальні клітинні механізми участі компонентів мембрани і білків цитоскелету в процесах, що регулюють структурно-функціональний стан цілісної клітини, багато в чому залишаються не з'ясованими.

Зараз відомо (Вебер К., Осборн М., 1985; Фултон А., 1987), що агрегатний і структурний стан білків цитоскелету впливає на ступінь їхньої асоціації з “якірними” білками мембрани (Tomishige M., Kusumi A., 1999; Van Dort H.M. et al., 2001), і в такий спосіб підтримує в’язко-еластичні властивості мембрани і стійкість клітини до дії екстремальних факторів, у тому числі при низьких температурах (Белоус А.М. и др., 1987). Участь білків у температурно-осмотичній стабілізації (чи дестабілізації) клітини здійснюється за допомогою досить складних механізмів, викликаних частковою дегідратацією цитоплазми, перерозподілом іонів, особливо Са2+, допоміжних білків цитозолю і, можливо, інших систем, що беруть участь у реалізації зовнішнього клітинного сигналу. Тому вивчення характеру модифікації білків плазматичної мембрани і цитоскелету має важливе значення для подальшої розробки теорії і практики холодової стабілізації і холодостійкості клітин у циклі кріоконсервування.

При цьому було важливо з'ясувати можливість перебудови зазначених вище мембранних структур у суворо визначених оптимальних умовах температуртно-осмотичного впливу з метою штучного переорієнтування їхньої структури і функції в напрямку підвищення стійкості клітин до впливу негативних температур. Подібного роду перебудова структур клітин з метою підвищення їхньої стійкості до циклу заморожування-відігрівання звичайно досягається шляхом використання відповідних швидкостей заморожування (Пушкарь Н.С., Белоус А.М., 1977) і кріопротекторів ендо- і екзоцелюлярного механізму дії (Белоус А.М. и др., 1979; Пушкарь Н.С. и др., 1978). Останнім часом заслуговують на особливу увагу екзоцелюлярні кріопротектори, які не проникають через плазматичні мембрани і не вимагають видалення з деконсервованих клітин перед їхньою трансфузією.

Незважаючи на широке застосування різних непроникаючих кріопротекторів (поліетиленоксиди, полівінілпіролідони (ПВП), гідроксиетилкрахмалі (ГЕК)) при кріоконсервуванні клітинних суспензій (Терехов Н.Т. и др., 1977,1983; Allen et al., 1978; Heschel et al., 1994;Lionetti F.J., Hunt S.M., 1975; Spiels G. et al., 1994; Sputtek A. et al., 1994), механізм дії цих хімічних сполук залишається багато в чому не ясним. Відомо, що при використанні непроникаючих кріопротекторів захист клітин обумовлений процесами помірної дегідратації і формуванням своєрідної “оболонки” навколо поверхні плазматичної мембрани (Пушкарь Н.С. и др., 1978). Однак неясно, чи спричиняють екзогенні хімічні кріопротектори лише колігативну і дегідратуючу (осмотичну) дію, або в процес утягуються системи внутрішньоклітинної сигналізації, що у свою чергу впливають на стан білків мембрани і цитоскелету клітини. Подібного роду перебудови можуть відбуватися в клітині під впливом осмотично активних непроникаючих кріопротекторів, охолодження і заморожування, що призведуть до порушення структури і функції мембрани клітин. Тому з'ясування ролі мембранних білків і білкового цитоскелету, які впливають на структурно-функціональний стан клітини, має велике значення у збереженні стійкості живих систем до дії осмотичнох і температурних факторів у процесі кріоконсервування.

У зв'язку з цим вивчення механізмів, що лежать в основі підвищення стійкості клітин до впливу факторів низькотемпературного консервування, є актуальною проблемою, вирішення якої дозволить обґрунтувати нові підходи для спрямованої модифікації стану клітин на ранніх етапах перед кріоконсервуванням і може стати основою для розробки ефективних методів кріоконсервування клітин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами: Дисертація виконана згідно з планами науково-дослідної роботи Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, у відділі біохімії холодової адаптації в рамках планових тем: “Дослідження молекулярних механізмів холодової толерантності при природній і штучній адаптації клітин” (шифр теми: 2.2.6.50) і “Вивчення молекулярних механізмів холодової стабілізації клітин при дії непроникаючих кріопротекторів і низьких температур. Розробка безвідмивної технології кріоконсервування еритроцитів” (шифр теми: 2.2.6.85, Державна реєстрація № 0101ИО03471).

Мета і задачі дослідження.

Мета дослідження. З'ясування механізмів стабілізації плазматичної мембрани і білків цитоскелету в умовах впливу на еритроцити людини осмотично активних сполук, головним чином, непроникаючих кріопротекторів, охолодження й заморожування для експериментального обґрунтування нових технологічних процесів кріоконсервування еритроцитів.

Задачі дослідження:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Об'єкт дослідження. Механізми, що лежать в основі підвищення стійкості клітин до впливу факторів кріоконсервування. Спрямована модифікація структурно-функціонального стану еритроцитів.

Предмет дослідження. Температурно-осмотична стабілізація плазматичних мембран і білків цитоскелету еритроцитів на етапі перед кріоконсервуванням. Розробка безвідмивного способу кріоконсервування еритроцитів з непроникаючим кріопротектором ПЕО-1500.

Методи дослідження. Для проведення досліджень щодо взаємодії ПЕО-1500 з еритроцитами і “білими тінями” еритроцитів, фосфорилювання мембранних білків еритроцитів, визначення концентрації внутрішньоклітинного кальцію, вивчення транспорту катіонів та амінокислот, а також приживлюваності еритроцитів у руслі крові були використані радіоізотопні методи.

Морфологічні дослідження еритроцитів проводили методом електронної та растрової електронної мікроскопій. Просторову структуру цитоскелету визначали методом поляризаційної мікроскопії.

Зміни стану білків мембран еритроцитів вивчали методом електрофорезу в ПААГ.

Структурно-функціональну повноцінність еритроцитів після кріоконсервування оцінювали за рівнем гемолізу або виживаністю еритроцитів, осмотичній крихкості, рівнем АТФ, 2,3-ДФГ і кисень-зв’язувальною здатністю еритроцитів.

Наукова новизна отриманих результатів. У роботі уперше встановлено, що визначальна роль у механізмі температурно-осмотичної стабілізації еритроцитів до факторів низькотемпературного консервування належить білкам цитоскелету клітин, модифікація яких призводить до підвищення стійкості еритроцитів до дії факторів заморожування за умови їхньої холодової експозиції при 0-40С в розчинах ПЕО-1500. Після теплової денатурації спектрину й інкубації клітин з інгібітором полімеризації колхіцином стійкість еритроцитів до дії факторів заморожування різко знижується. Використання методу електрофорезу в ПААГ із застосуванням зшивального агента, діаміду дозволило установити, що інкубація еритроцитів із кріопротектором ПЕО-1500 при 220С викликає порушення просторового розташування і перерозподіл білкових фракцій спектрин-актинового комплексу, що призводить до дестабілізації клітин. Навпроти, інкубація еритроцитів із кріопротектором при 00С сприяє стабілізації структури білків цитоскелету, зберігає їхніє просторове й орієнтаційне розташування в клітині і поліпшує тим самим результати кріоконсервування.

Уперше показано, що спрямованість структурної модифікації плазматичних мембран і білків цитоскелету клітин визначається впливом температури і рівнем дегідратації під дією непроникаючого кріопротектора ПЕО-1500 на системи, що регулюють їхній структурно-функціональний стан. Це пов'язано зі змінами концентрації внутрішньоклітинного Са2+ і рівнем фосфорилювання білків. Новим є установлений факт, що стабілізація структурно-функціонального стану білків цитоскелету еритроцитів під впливом холодової інкубації клітин із кріопротектором пов'язана з підвищенням рівня фосфорилювання спектрину (у 2,5 рази) й концентрації внутрішньоклітинного Са2+ – процесів, що підтримують білки в полімерному стані.

У роботі встановлено, що температура, при якій клітини вміщуються в гіпертонічні умови, впливає на макроскопічні параметри еритроцитів (об’єм і форму). Уперше показано, що інкубація еритроцитів з ПЕО-1500 при 00С призводить до обмежання деформації форми і зворотньої трансформації перехідних форм дискоцитів у нормоцити, що дозволяє зберегти стабільність форми клітин у циклі заморожування-відігрівання. Отримано нові дані про взаємозв'язок між характером зв'язування ПЕО-1500 з мембранами еритроцитів на етапі інкубації, зміною їхнього об’єму і форми, модифікацією білків цитоскелету, станом бар'єрних властивостей мембран і стійкістю еритроцитів до заморожування-відігрівання. Новим є виявлений нами факт зниження зв'язування 14С-ПЕО-1500 з еритроцитами при інкубації їх при 00С. Зменшення кількості ПЕО-1500, який зв’язується з клітинами, сприяє обмеженню деформації форми і дегідратації клітин, що багато в чому забезпечує збереження бар'єрних властивостей мембрани і систем транспорту іонів і метаболітів, і в остаточному підсумку стійкість еритроцитів до кріоконсервування підвищується.

Уперше показана ефективність дозованого введення в середовище кріопротектора при низьких позитивних температурах як фактора, що підвищує стійкість еритроцитів до заморожування і зміни осмотичних умов середовища.

Практичне значення отриманих результатів. У результаті проведеного вивчення механізмів стабілізації еритроцитів до дії непроникаючого кріопротектора і низьких температур обґрунтовані нові підходи для спрямованої модифікації структурно-функціонального стану клітин на початкових етапах перед кріоконсервуванням з метою підвищення їхньої стійкості до заморожування-відігрівання. Ці підходи полягають у формуванні визначених температурно-осмотичних умов, при яких відбувається стабілізація плазматичних мембран і білків цитоскелету. Розроблено оптимальні умови для структурної стабілізації еритроцитів, що полягають у попередній інкубації клітин при 0-40С і дозованому введенні кріопротектора. На основі принципу “холодової стабілізації” розроблений і захищений патентом України (Патент № 30888 А) безвідмивний спосіб кріоконсервування еритроцитів під захистом непроникаючого кріопротектора ПЕО-1500, що дозволяє значною мірою підвищити їхню стійкість до заморожування-відігрівання і зберігати структурно-функціональні показники клітин на досить високому рівні. Даний метод є більш перспективним у порівнянні з існуючими на сьогодні методами кріоконсервування еритроцитів і може знайти широке застосування в практичній медицині.

Основні наукові положення роботи використовуються в курсах лекцій для студентів факультету фундаментальної медицини Харківського Національного університету ім. В.Н. Каразіна.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням здобувача. Автору дисертаційної роботи належить вибір теми, визначення мети і задач дослідження, методологічних основ її виконання. Здобувачем особисто отримані експериментальні дані у всіх розділах досліджень, проведена їхня статистична обробка. Автором роботи самостійно проаналізовані отримані результати і зроблені висновки.

У спільних наукових публікаціях співавтори брали участь у постановці деяких методик і проведенні окремих експериментів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи повідомлені й обговорені на II Всесоюзному з'їзді гематологів і трансфузіологів (Львів, 1985); II Українському з'їзді гематологів і трансфузіологів України (Київ, 1986); Міжнародній конференції "Досягнення й перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини" (Харків, 1988); Всесоюзній конференції "Структурна динаміка біологічних мембран і її роль у регуляції фотобіологічних і рецепторних процесів" ( Мінськ, 1988); X-ій Всесоюзній конференції молодих учених "Синтез і дослідження біологічно активних сполук" (Рига, 1989); Всесоюзному симпозіумі "Реконструкція, стабілізація і репарація біологічних мембран" (Благовєщенськ, 1989); IV Міжнародній школі "Кріобіологія і заморожування-ліофілізація" (Софія, Болгарія, 1989); Міжнародній конференції "Низькі температури 90" (Чехословаччина, 1990); VII Міжнародному симпозіумі "Проблеми низькотемпературного консервування клітин, тканин і органів" (Берлін, ФРН, 1991); II Міжнародній конференції "Успіхи сучасної кріобіології" (Харків, 1992); VІ Українському біохімічному з'їзді (Київ , 1992);); III Українському з'їзді гематологів і трансфузіологів (Суми, 1995); I з'їзді Українського товариства кріобіології і кріомедицини (Харків, 1995); VI Міжнароднійй конференції по тканинним банкам (Единбург, 1997); Міжнародному симпозіумі “Трансфузія 2000” (Фукуока, Японія, 1999); П з'їзді біофізиків Росії (Москва, Росія, 1999); 30-38 Міжнародних нарадах по кріобіології (Атланта, США, 1993; Кіото, Японія, 1994; Вісконсин, США, 1995; Барселона, Іспанія, 1997; Піттсбург, США, 1998; Марсель, Франція, 1999; Единбург, Великобританія, 2001), Усеукраїнська наукова конференція “Успіхи та перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини” (Харків 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 56 наукових праць, з них 24 статті у фахових наукових виданнях, 31 тези, отриманий 1 патент України на винахід.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 299 сторінках друкованого тексту, складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, шести розділів власних досліджень та їх обговорення, заключення, висновків і списку використовуваної літератури, що включає 459 джерел на 47 сторінках. Робота ілюстрована 44 рисунками і 12 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Матеріалом дослідження були еритроцити донорської крові людини, консервованої на середовищі "Глюгіцир". Перед заморожуванням еритроцити інкубували з кріопротектором ПЕО-1500. Використовували 30% розчин ПЕО-1500 на основі або 10 мМ трис-НСl, або 0,01 М фосфатному буфері рН 7,4, що містить 150 мМ NaCl. У роботі було застосовано два температурних режими: інкубація клітин при температурі 0 – 40С і 22-240С. Розчин ПЕО-1500 вводили в суспензію еритроцитів або одномоментно по краплях та інкубували протягом 40 хв., або шляхом додавання через кожні 4 хв. рівними порціями протягом 40 хв. При цьому співвідношення об’ємів еритромаси і розчинів кріопротектора при кожному зі способів додавання складало 1:1 за об’ємом. Заморожування здійснювали до – 1960С шляхом занурення контейнера в рідкий азот. Відтаювання робили на водяній бані при температурі 42-440С при постійному похитуванні.

Взаємодію 14С-ПЕО-1500 з еритроцитами і “білими тінями” при різних режимах обробки визначали після видалення незв’язаного кріопротектора з клітинної суспензії шляхом триразового відмивання у фізіологічному розчині NaCl. Кількість зв’язаного з клітинами і “білими тінями” 14С-ПЕО-1500 визначали шляхом виміру осадку на сцинтиляційному лічильнику Beckman LS-7800 у сцинтиляторі ЖС-8.“

Білі тіні” еритроцитів одержували за допомогою гіпотонічного шоку за методом (Fairbanks G., at al., 1971).

Морфологічні дослідження еритроцитів проводили методом растрової електронної мікроскопії і сканували на електронному мікроскопі РЕМ-100У. Ультраструктуру еритроцитів вивчали відповідно до (Карулу, 1984) і досліджували в електронному мікроскопі ЕОМ-100АК. Об’єм еритроцитів визначали на приладі Пикаскель.

Денатурацію спектрину проводили, інкубуючи еритроцити при температурі 50 0С протягом 15 хв (Coakley W.T. et al., 1981). Колхіцин додавали до проб із розрахунку 0,04 мг/мл клітинної суспензії й інкубували протягом 1,5 годин при 370С (Carlsson L., Blikstad I., 1981). Рівень гемолізу після розморожування визначали на спектрофотометрі "СФ-46 ЛОМО".

Зміну стану білків мембран еритроцитів вивчали методом електрофорезу в ПААГ. Електрофорез мембранних білків проводили за методом (Fairbanks G. at al., 1971) у гелі з концентрацією акриламіду 10%, а також у градієнтних гелях РАР 4/30 (Pharmacia, Швеція). Гелі сканували при 540 нм на денситометрі "Beckman CDS-200". Для визначення молекулярної маси білків використовували маркери LMW (Pharmacia, Швеція). Обробку клітин діамідом здійснювали за методом (Haest C., at al., 1977), одержували потім “білі тіні”, що піддавалися електрофорезу.

Поляризаційно-мікроскопічні дослідження просторової структури цитоскелету еритроцитів проведені, як описано в роботі (Саакян Ш.С., 1988), на поляризаційному мікроскопі МІН-8.

Фосфорилювання мембранних білків еритроцитів здійснювали 32Р в -положенні молекули АТФ (пит. активність 1 мкКи/мл) (Fairbanks G., 1978), потім білки розділяли за допомогою електрофорезу в ПААГ. Для кількісної оцінки шматочки гелю з радіоактивно міченими білками розчиняли в 30% перекисі водню і прораховували на сцинтиляційному лічильнику.

Концентрацію внутрішньоклітинного кальцію визначали радіоізотопним методом (Покудин Н.И., Орлов С.Н., 1986) з невеликими модифікаціями (Покудин Н.И. и др., 1988), за допомогою 45СaCl2.

Транспорт катіонів та амінокислот в еритроцитах досліджували за допомогою 86Rb і 14С-гліцину. Визначення концентрації катіонів здійснювали за допомогою полум'яної фотометрії на приладі ПАЖ-1.

Осмотичну крихкість еритроцитів визначали за рівнем виходу вільного гемоглобіну після переносу розмороженої суспензії еритроцитів у середовища з фізіологічною тонічністю (0,15 М NаCl, розведення 1:100 та інкубація при 370С 1 година). Вільний гемоглобін визначали за методом (Дервиз Г.В., Бялко Н.К., 1966), загальний гемоглобін – ціан мет-гемоглобіновим методом, вміст АТФ за методом (Атаулаханов Ф.И., Пичугин А.В., 1981), 2,3-ДФГ методом (Мешкова Н.Т., Алексахина Н.В., 1954), концентрацію гемоглобіну визначали на апараті Со-оксимер (США), кисневу ємність крові на апараті Zex-Про2-Con (США), Р50 еритроцитарної маси визначали по кривих дисоціації оксигемоглобіну, що реєстрували на апараті Гем-О-Скан (США).

Реологічні властивості еритроцитів визначали за методом (Suda T. at al., 1980), їх здатність до деформації й агрегаційну активність – за методом (Шестаков В.А., Александрова Н.П., 1974).

Статистичну обробку даних проводили параметричним методом Фішера-Стьюдента (Бейли Н., 1963) з використанням t-критерію. Для розрахунків використовували комп'ютерну програму “StatGraphics Plus 2.1” for Windows.

Взаємодія поліетиленоксиду м.м. 1500 з мембранами еритроцитів. Дія ПЕО-1500 як осмотично і поверхово активної речовини, поширюється на різні системи клітин і, насамперед, на плазматичні мембрани. Співвідношення захисної дії кріопротектора та його цитотоксичного ефекту залежить від багатьох факторів. У визначених умовах варіювання температури токсичний ефект кріопротектора можна звести до мінімуму, якщо врахувати, що токсичність пов'язана саме з первинним впливом кріопротектора на поверхневі властивості мембрани. Дослідження характеру взаємодії 14С-ПЕО-1500 з еритроцитами в залежності від температури і темпів уведення кріопротектора в клітинну суспензію показали (рис. 1), що кількість кріопротектора, що зв'язується з клітинами, визначається насамперед температурою, при якій клітини інкубують із кріопротектором. Так, при 00С з еритроцитами взаємодіє в 5 разів менше 14С-ПЕО-1500, ніж при 220С, тобто введення кріопротектора в клітинну суспензію при 220С збільшує його зв'язування з еритроцитами.

Механізм взаємодії ПЕО-1500 з еритроцитами представляється досить складним. Тому що ПЕО-1500 є непроникаючою у клітину речовиною, його взаємодія з мембраною супроводжується адсорбуванням його молекул на поверхні мембрани, що змінює її структурні і зарядові характеристики (Моисеев В.А., 1984). Разом з тим, маючи значну ліпофільність, ПЕО-1500 може вбудовуватися в гідрофобні ділянки плазматичної мембрани. Наявність у структурі ПЕО-1500 полярних груп створює можливість його взаємодії з гідрофільними ділянками макромолекул, зокрема, з полярними голівками фосфоліпідів.

Рис. 1 Взаємодія 14С-ПЕО-1500 з еритроцитами і “білими тінями”.

Оскільки у використаному нами препараті ПЕО-1500 могли міститися домішки низькомолекулярних фракцій, здатних проникати в клітину, розходження у взаємодії цього кріопротектора з клітинами при 0 і 220С можуть бути обумовлені впливом температури на дифузію цих фракцій усередину клітини. Експерименти, проведені на незамкнутих “білих тінях” еритроцитів, що дозволяють виключити роль дифузії низькомолекулярних фракцій і оцінити тим самим особливості зв'язування ПЕО-1500 з мембранами еритроцитів при різних температурах, показали (рис. 1), що закономірності, установлені при взаємодії ПЕО-1500 з нативними еритроцитами при 0 і 220С, характерні також для незамкнутих “білих тіней”. Це свідчить, що розходження в кількості кріопротектора, зв’язаного з клітинами, при різних температурах, обумовлені неоднаковим характером його взаємодії з плазматичними мембранами, а дифузія низькомолекулярних домішок у клітину не відіграє визначальної ролі у виникненні цих розходжень.

При дослідженні взаємозв'язку між характером зв'язування кріопротектора з клітинами та їхньою стійкістю до заморожування-відігрівання виявлено, що існує кореляція між кількістю ПЕО-1500, що зв'язується з клітинами на етапі інкубації, та їх стійкістю до заморожування-відігрівання. Інкубація еритроцитів при 00С супроводжується незначним зв'язуванням поліетиленоксиду з поверхнею мембрани, що корелює з низьким рівнем гемолізу після розморожування клітин (рис. 2). Збільшення зв'язування з клітинами кріопротектора на етапі інкубації при 220С призводить до зниження стійкості еритроцитів до низькотемпературного впливу.

Очевидно, при збільшенні інтенсивності взаємодії кріопротектора з мембранами клітин починає виявлятися його цитотоксичний ефект, що збільшує імовірність утворення трансмембранних дефектів. В умовах заморожування-відігрівання під впливом різних фізико-хімічних факторів нестабільність клітин значно зростає.

Рис. 2 Рівень гемолізу еритроцитів, кріоконсервованих з ПЕО-1500.

Розходження в кількості ПЕО-1500, що взаємодіє з еритроцитами при 0 і 220С можуть бути обумовлені, насамперед, термодинамічними причинами, в силу яких при зниженні температури відбувається обмеження хімічних і просторових взаємодій. Максимальна збереженість еритроцитів у процесі кріоконсервування в наших експериментах спостерігається при дозованому введенні кріопротектора в клітинну суспензію на етапі інкубації при 00С. Отже, можна припустити, що в цьому випадку для забезпечення кріозахисної дії ПЕО-1500 досягаються оптимальні умови для збереження цілісності еритроцитів у циклі кріоконсервування. Таким чином, зниження температури інкубації клітин із кріопротектором до 00С призводить до зменшення кількості ПЕО-1500, який зв’язується з клітинами, що є важливим чинником у механізмі підвищення стійкості клітин до низькотемпературного впливу.

Модифікація морфологічної структури й об'ємні зміни еритроцитів під впливом кріопротектора ПЕО-1500 і заморожування-відігрівання. Теоретичний та експериментальний аналізи механізмів ушкодження клітин при охолодженні й заморожуванні-відігріванні показує, що однією з важливих цитоплазматичних структур, які забезпечують стабільність (чи нестабільність) клітини, є система мембранних цитоскелетних білків (Белоус А.М. и др., 1985, Бондаренко В.А., 1988). При додаванні до еритроцитів осмотично активних речовин і, зокрема, непроникаючих кріопротекторів, реакція білків цитоскелету проявиться, насамперед, у зміні об’єму й форми клітин. При цьому важливим є те, що поряд з осмотичними факторами температура також впливає на формотвірні процеси, утягуючи в реакцію клітин білки цитоскелету і мембрану в цілому (Glazer H., 1976). Оскільки при дослідженні стійкості еритроцитів до заморожування-відігрівання було виявлено, що найбільш оптимальним режи-мом при 00С є дозоване додавання кріопротектора до суспензії еритроцитів протягом 40 хв., а при 220С одномоментне (по краплях), то при вивченні впливу ПЕО-1500 на морфологію еритроцитів були використані саме ці режими.

При дослідженні змін форми еритроцитів нами була використана класифікація, запропонована (Козинец Г., 1984). Дана класифікація дозволяє систематизувати послідовність змін поверхневої архітектоніки клітин у процесі їхньої трансформації.

Проведені дослідження показують, що дозоване додавання кріопротектора ПЕО-1500 при 00С до еритроцитів хоча і не запобігає цілком дегідратації клітин, однак вираженої деформації клітин не спостерігається. Це підтверджують дані морфометричних досліджень (табл. 1), які свідчать про те, що інкубація при 00С призводить до достовірного збільшення числа нормоцитів у популяції в порівнянні з контролем і зменшення перехідних форм дискоцитів (із зубцюватим краєм, з відростками і "шовковична ягода"). Подібна спрямованість змін форми в присутності кріопротектора ПЕО-1500 відбиває електростатичний механізм трансформації форми, пов'язаний з екрануванням заряду поверхневих груп мембрани. Екранування заряджених груп викликає зменшення площини зовнішнього моношару мембрани, що зрушує баланс між площинами зовнішнього і внутрішнього моношарів у напрямку формування гладких дискоїдних форм (Maggic B. et al., 1976). Разом з тим, незначно збільшується число гладких сфероцитів, що супроводжується зниженням кількості сфероцитів з відростками. Спостерігається також і деяке підвищення відсотка передгемолітичних форм клітин у порівнянні з контролем. Отримані результати свідчать, що дозоване додавання кріопротектора ПЕО-1500 при 0 0С до еритроцитів викликає процес трансформації змінених форм дискоцитів, близько 30% з яких набувають двоввігнутої форми. Установлений приріст процентного числа сфероцитів відбувається, очевидно, за рахунок необоротної диск-сфера трансформації дискоцитів типу "шовковична ягода" у передгемолітичні, що індукує ПЕО-1500.

Додавання кріопротектора ПЕО-1500 до еритроцитів при 220С супроводжується значною деформацією і дегідратацією клітин. Зміна популяційного складу клітин (табл. 1) супроводжується достовірним зменшенням числа перехідних форм дискоцитів типу "шовковична ягода" і з відростками. Паралельно значно збільшується число передгемолітичних форм клітин типу сфероцитів та інших дегенеративно змінених видів еритроцитів. Виходячи з отриманих даних, можна зробити висновок, що додавання кріопротектора ПЕО-1500 до еритроцитів при 220С сприяє прискоренню процесу диск-сфера трансформації перехідних форм дискоцитів у передгемолітичні.

Таблиця 1

Морфологічна характеристика еритроцитів крові людини в умовах дії кріопротектора ПЕО-1500 і заморожування-відігріву

Умови досліду | Типы еритроцитів, %

Нормоцити | Дискоцити | Сфероцити | Інші форми еритроцитів

з гребнем | із зубчастим краєм | з відростками | “шовковична ягода” | гладкі | з відростками

Контроль | 33,2 6,8 | 1,6 0,1 | 24,0 + 2,8 | 32,6 8,0 | 3,1 0,1 | 1,5 0,05 | 2,0 0,6 | 2,0 0,04

ПЕО при 0 0С | 61,7 5,8* | 1,8 0,7 | 20,3 2,7 | 6,8 1,6* | 0,2 0,08* | 2,4 1,2* | 0,2 0,07* | 6,6 0,5

ПЕО-при 22 0С | 39,38,1 | 33,30,5* | 21,33,7 | 15,53,6* | 0,90,03* | 3,10,6* | 1,00,05 | 15,61,6*

Заморожування-відігрів після інкубації з ПЕО при 00С. | 51,7 3,9** | 1,7 0,8 | 14,9 1,7 | 7,6 0,6** | 1,5 0,4** | 11,5 2,9 | 1,3 0,37** | 9,8 1,7**

Заморожування-відігрів після інкубації з ПЕО при 220С. | 228,81,4** | 2,9 1,2 | 24,9 6,4 | 13,1 2,4** | 0,4 0,01** | 14,7 4,2 | 0,5 0,01** | 14,7 1,9**

Примітка: * – відмінності достовірні (Р<0,05) порівняно з контролем, ** – відмінності достовірні (Р<0,05) при порівнянні морфологічних характеристик після заморожування-відігріву еритроцитів, інкубованих з ПЕО-1500 при 00С і 220С.

Таким чином, порівняльний аналіз змін форм еритроцитів під впливом поліетиленоксиду м.м.1500 при 22 і 00С показує, що додавання кріопротектора при 00С більш сприятливо відбивається на морфології еритроцитів, ніж інкубація при 220С. При дослідженні зразків еритроцитів, інкубованих з ПЕО-1500 при 220С, після заморожування-відігрівання звертає на себе увагу велике число передгемолітичних форм клітин, серед яких переважають сфероцити, повсюдно зустрічаються дегенеративні форми еритроцитів, а також осколки клітин. Порівнюючи морфологічні зміни еритроцитів, інкубованих із кріопротектором при 220С до і після заморожування-відігрівання, можна відзначити, що після заморожування в популяції еритроцитів збільшується процентний вміст сфероцитів, а також мається тенденція до зниження кількості нормоцитів і перехідних типів дискоцитів. Отримані результати свідчать, що заморожування-відігрівання клітин, інкубованих із ПЕО-1500 при 220С сприяє необоротній трансформації перехідних форм дискоцитів у передгемолітичні форми еритроцитів. Після розморожування еритроцитів, попередньо інкубованих з ПЕО-1500 при 00С, спостерігається висока збереженість форми, значна частина клітин представлена нормоцитами, що мають форму двоввігнутих дисків, передгемолітичні форми зустрічаються рідше, ніж у популяції клітин, інкубованих із кріопротектором при 220С.

Отримані дані свідчать, що краще збереження форми клітин у процесі кріоконсервування досягається після інкубації їх із кріопротектором ПЕО-1500 при 00С. Це підтверджується також даними електронно-мікроскопічних досліджень ультраструктури і конформаційних змін еритроцитів, де було виявлено, що температура інкубації клітин із кріопротектором впливає на ультраструктуру і деформованість еритроцитів після заморожування-відігрівання. Так, після розморожування клітин, інкубованих із ПЕО-1500 при 00С спостерігається висока збереженість ультраструктури й помірна деформація цих клітин. Інкубація клітин при 220С й наступне заморожування-відігрівання призводить до значного росту в популяції кількості сфероцитів, збільшення числа "рожевих", ушкоджених еритроцитів.

Таким чином, узагальнюючи отримані дані, можна зробити висновок, що в клітинах, інкубованих із кріопротектором ПЕО-1500 при 220С, ушкодження і необоротна трансформація перехідних форм дискоцитів у передгемолітичні відбуваються під час інкубації клітин із кріопротектором, а наступне заморожування-відігрівання підсилюють ушкодження. Інкубація еритроцитів із кріопротектором при 00С сприяє збереженню нативної форми клітин, що може бути пов'язане з тим, що низька температура "фіксує" об’єм і форму білкового цитоскелету і набута стабільність форми зберігається й у циклі кріоконсервування.

Гіпертонічні розчини різних непроникаючих осмотично-активних речовин викликають у тому чи іншому ступені стиск клітини, обумовлений частковою об'ємною дегідратацією цитоплазми. Це означає, що вміст клітини перейшов в іншу, більш конденсовану форму, при якій динамічна структура білків цитоскелету і цитозолю зазнавала фазових і конформаційних перетворень. Тому процес дегідратації є дуже важливим фактором у структурній модифікації стану клітини в аспекті її стабільності (чи нестабільності) (Bolen W., 2000). Аналіз змін об’єму еритроцитів у залежності від температури інкубації їх із кріопротектором показує, що дозоване додавання ПЕО-1500 при 00С призводить до часткової дегідратації клітин, про що свідчить зміна їхнього об’єму на 28,9%. Інкубація еритроцитів з ПЕО-1500 при 220С супроводжується більш значною дегідратацією - зменшення об’єму досягає 44,7%. Зіставляючи ці дані з результатами, отриманими при дослідженні форми клітин, можна зробити висновок, що в еритроцитах спостерігається тісний взаємозв'язок між процесами дегідратації й деформації цих клітин. Чим менше об’єм еритроцитів, тим більше вони деформовані.

Модифікація структури білкового цитоскелету при підвищенні концентрації внутрішньоклітинних електролітів в осмотично стиснутих клітинах може служити початковим етапом появи холодової чутливості еритроцитів. При зменшенні об’єму концентрація усіх внутрішньоклітинних компонентів збільшується, що саме по собі може сприяти зміні молекулярної структури цитоскелету. Тому можна припустити, що після інкубації еритроцитів із кріопротектором ПЕО-1500 при 00С, коли зменшення об’єму клітин менш виражено, відбувається, очевидно, така модифікація структури цитоскелету, що призводить до різкого обмеження деформації форми і формуванню стійкого до низькотемпературного впливу стану.

Фізико-хімічна модифікація білків цитоскелету при температурно-осмотичному впливі на клітини і після заморожування-відігрівання. Той факт, що стійкість еритроцитів до заморожування після інкубації з ПЕО-1500 при 00С пов'язана, насамперед, з модифікацією білків цитоскелету, доводять експерименти, у яких блокується (чи обмежується) можливість структурних змін цих білків. Як видно з даних, представлених на рис. 3, теплова денатурація спектрину при 500С (Coakley W.T. et al., 1981), що передує інкубації еритроцитів у розчині кріопротектора й обмежуюча його участь у структурно-функціональній модифікації клітин, призводять до зниження їхньої стійкості до заморожування-відігрівання, що виявляється в підвищенні рівня гемолізу як у випадку інкубації при 00С (рис. 3 в), так й у випадку інкубації з кріопротектором при 220С (рис. 3 г) у порівнянні з аналогічними варіантами інкубації нативних клітин (рис. 3 а, б).

Отже, зниження стійкості еритроцитів до заморожування-відігрівання після термоденатурації спектрину обумовлено змінами властивостей цього білка і його здатності до взаємодії з іншими компонентами мембрани (Coakley W.T. et al., 1981, Lee J.C., 1999). Разом з тим, після розморожування еритроцитів з денатурованим спектрином, інкубованих із кріопротектором при 220С, рівень їхнього гемолізу вище (рис. 3 г), ніж у передінкубованих з ПЕО-1500 при 00С (рис. 3 в). Це може бути пов'язане з особливостями взаємодії поліетиленоксиду з мембранами еритроцитів при різних температурах, коли при 00С взаємодія даного кріопротектора з клітинами слабшає і локальні деформації плазматичної мембрани менш виражені, тобто не відбувається перебудова білків цитоскелету, що веде до дестабілізації клітин. Можливо також, що розходження, які зберігаються, у стійкості еритроцитів до заморожування-відігрівання в залежності від температурного режиму інкубації з кріопротектором пов'язані зі здатністю інших білків цитоскелету адекватно реагувати на температурно-осмотичний вплив і додавати клітинам підвищеної стійкості.

Рис. 3 Вплив теплової денатурації спектрину на стійкість до заморожування еритроцитів, інкубованих з ПЕО-1500 при різних температурах.

Аналогічні закономірності встановлені й в експериментах, у яких інкубації еритроцитів у розчині кріопротектора передувала інкубація з колхіцином, що інгібує процеси полімеризації актину (Carlsson L., Beckstad I., 1981) і, зв'язуючи зі спектрином (Fuller G.M. et al., 1973), може впливати на утворення його олігомерних форм. Передінкубація еритроцитів з колхіцином також призводить до зниження стійкості еритроцитів, інкубованих у розчині ПЕО-1500 як при 00С, так і при 220С, до дії заморожування-відігрівання. Ці дані підтверджують визначальну роль спектрину й актину в підвищенні стійкості клітин до заморожування-відігрівання, і свідчать, що в механізмі підвищення холодової стабільності еритроцитів важливим є така структурна модифікація цитоскелету, при якій зберігається полімеризована форма актину й формуються олігомери спектрину.

Характер модифікації білків цитоскелету еритроцитів під впливом кріопротектора і заморожування-відігрівання можна адекватно оцінити методом електрофорезу в ПААГ, використовуючи білок-зшиваючий реагент, - діамід, що має здатність утворювати містки між SH-групами білків, що знаходяться на певній один від одного відстані (Haest C.W.H. et al., 1977). У результаті цього при окислюванні SH-груп білків виникають агрегатні білкові комплекси, що виявляються на електрофореграмах у вигляді фракцій високомолекулярних білків на старті гелю.

Інкубація еритроцитів у розчині ПЕО-1500 при 22 0С призводить до деяких порушень просторового упакування частини білків цитоскелету, про що свідчить поява білкових агрегатів на старті гелю, хоча кількість їх незначна і складає 2,4% від усіх мембранних білків (рис. 4).

а - нативні еритроцити; б - еритроцити після заморожування-відігрівання без кріопротектора; в - інкубація клітин з ПЕО-1500 при 220С; г - заморожування після інкубації з ПЕО-1500 при 220С; д - інкубація еритроцитів з ПЕО-1500 при 00С; е - заморожування після інкубації клітин при 00С. М - маркерні білки.

Білки | Вміст, %

Умови експерименту

а | б | в | г | д | е

Білкові

Агрегати |

- |

14,5 |

2,4 |

14,0 |

0,5 |

3,8

Спектрин | 17,7 | 14,0 | 16,6 | 12,4 | 17,6 | 17,8

Полоса 2.1 | 12,5 | 13,9 | 10,9 | 9,5 | 10,8 | 12,9

Полоса 3 | 25,1 | 17,1 | 26,5 | 20,8 | 28,3 | 26,3

Полоса 4.1 | 9,6 | 7,7 | 6,9 | 4,2 | 5,3 | 7,8

Актин | 11,3 | 7,8 | 9,7 | 4,3 | 10,0 | 7,5

Рис. 4 Електрофорез білків мембран еритроцитів, оброблених діамідом, після їхньої інкубації з кріопротектором при різних температурах і наступного заморожування-відігрівання.

Особливо чітко ці порушення в структурі білків цитоскелету виявляються після розморожування клітин, інкубованих при 220С в розчині ПЕО-1500, де на електрофореграмі з'являються білкові агрегати на старті гелю.