НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

Бабій Любов Володимирівна

УДК 577.164.11 + 547.789

МОДЕЛЬНІ ОКИСНЮВАЛЬНІ ПЕРЕТВОРЕННЯ

ТІАМІНУ І ТІАМІНФОСФАТІВ

02.00.10 – біоорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Київ -2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.

Науковий керівник: доктор хімічних наук Вовк Андрій Іванович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу механізмів біоорганічних реакцій

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Кібірєв Володимир Костянтинович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу хімії білка доктор хімічних наук Бальон Ярослав Григорович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, завідувач лабораторії органічного синтезу

Провідна установа: Інститут органічної хімії НАН України, відділ механізмів органічних реакцій

Захист відбудеться “15” листопада 2002 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

Автореферат розісланий “14” жовтня 2002 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Біологічна дія тіаміну (вітаміну В1) пов'язана з реалізацією його коферментних і некоферментних функцій. Природними фосфорильованими похідними вітаміну В1 є тіамінмонофосфат (ТМФ), тіаміндифосфат (ТДФ) і тіамінтрифосфат (ТТФ). ТМФ утворюється в рослинах і мікроорганізмах в процесі біосинтезу вітаміну В1, а також при його метаболізмі. ТДФ входить до складу ферментів і мультиферментних комплексів, що каталізують реакції a-кетокислот та інших карбонільних сполук. Співвідношення між тіаміном, ТМФ, ТДФ і ТТФ регулюється специфічними фосфатазами і кіназами. Серед продуктів неферментативного окиснювального розкладу вітаміну В1 in vivo реєструються тіохром і тіаміндисульфід.

Перебіг неферментативних окиснювальних перетворень тіаміну і його структурних фосфорильованих аналогів в живій клітині може спричиняти зниження їх загального рівня і накопичення токсичних сполук. Такі хімічні перетворення низькомолекулярних біорегуляторів без участі ферментів чи білків визначаються як “параметаболічні” [Голубев, 1996]. Встановлено, що прискорення процесів окиснення ТДФ може корелювати з розвитком патологічних станів організму [Пархоменко и др., 1996]. Однак механізми окиснювальних перетворень, що відбуваються при взаємодії вітаміну В1 та його похідних з фізіологічними окисниками або ксенобіотиками, досі залишаються нез'ясованими. Тому актуальними є модельні дослідження, які грунтуються на можливих механістичних аналогіях перетворень субстратів в живих організмах і реакцій природних та синтетичних сполук в простіших хімічних та біохімічних системах.

Звўязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є складовою частиною науково-дослідних робіт Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (тема 2.1.10.13-99 "Дослідження біоміметичних реакцій з метою розробки теоретичних основ спряження одно- та двоелектронних стадій в біохімічних системах", № держреєстрації 0199U003949).

Мета і задачі дослідження. Мета дисертаційної роботи полягала в зўясуванні закономірностей модельних перетворень ТМФ, ТДФ, тіаміну та його О-ацилзаміщених структурних аналогів при дії основи та окисників.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

- вивчення кінетики окиснення ТМФ і ТДФ фериціанідом;

- встановлення кінетичних закономірностей окиснення тіаміну і його О-заміщених похідних при взаємодії з фізіологічним акцептором електронів - ферицитохромом С;

- вивчення закономірностей гідролізу фосфатного зв'язку в процесі окиснювальних перетворень ТМФ;

- дослідження кінетики дефосфорилювання ТМФ і ТДФ в присутності лужної фосфатази.

Обўєкт дослідження – вітамін В1 і тіамінфосфати.

Предмет дослідження – механізми окиснювальних перетворень тіаміну та його структурних аналогів.

Методи дослідження – хімічна кінетика, ферментативна кінетика, спектрофотометричний аналіз, високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ, для визначення складу реакційних сумішей), ЯМР 1Н-спектроскопія (для підтвердження структури синтезованих сполук).

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено кінетичні закономірності реакцій окиснення тіаміну і його О-заміщених структурних аналогів ферицитохромом С, а також окиснення ТМФ і ТДФ фериціанідом. Продемонстровано характер впливу замісників в положенні 5 тіазолієвого циклу на швидкість окиснювальних перетворень субстрату. Проаналізовано залежність констант швидкості зникнення “жовтої” форми від структури 3-[(4-аміно-2-метил-5-піримідиніл)метил]-4-метил-5-R-тіазолієвого іону. Вперше встановлено, що в лужному середовищі при дії фериціаніду або йоду перебіг неферментативних окиснювальних перетворень ТМФ супроводжується його дефосфорилюванням з утворенням тіаміну і тіохрому. Показано, що в аеробних умовах в процесі спряження окисно-відновних стадій з перенесенням фосфорильного залишку відбувається значне прискорення гідролізу діаніону ТМФ. Досліджено кінетику гідролізу ТМФ і ТДФ лужною фосфатазою. На підставі аналізу кінетичних даних встановлено, що реакційна здатність ТМФ в модельних окисно-відновних системах знижена у порівнянні з реакційною здатністю вітаміну В1 і ТДФ. Запропоновано механізми модельних реакцій, які включають стадії одноелектронного переносу.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дисертаційної роботи є важливими для обгрунтування механізмів параметаболічних перетворень тіаміну і тіамінфосфатів в живій клітині і встановлення можливого зв'язку поміж їх перебігом та розвитком В1-авітамінозу. Одержані дані можуть бути використані при розробці лікарських засобів, необхідних для корекції рівня тіаміну в організмі.

Особистий внесок здобувача. Дисертантка самостійно виконала експериментальну частину роботи, проводила обробку, аналіз та узагальнення отриманих результатів. Постановка завдань, обговорення механізмів та формулювання висновків відбувалося спільно з науковим керівником. Всі результати робіт, що опубліковані у співавторстві та увійшли до дисертації, одержані за безпосередньою участю дисертантки.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені на VIII науковій конференції ”Львівські хімічні читання-2001” (Львів, травень 2001 р.), XIX Українській конференції з органічної хімії (Львів, вересень 2001 р.), VIII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, жовтень 2002 р.), XVI та XVII наукових конференціях з біоорганічної хімії та нафтохімії (Київ, березень 2001 та 2002 рр.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей, з них 4 в наукових фахових виданнях, та тези 3 доповідей.

Структура та обўєм роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, екпериментальної частини, викладу отриманих результатів та їх обговорення, висновків та списку літератури (184 найменування). Дисертаційна робота налічує 135 сторінок друкованого тексту і проілюстрована 7 таблицями та 25 малюнками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В першому розділі подано огляд даних літератури, які стосуються перетворень вітаміну В1 і його структурних аналогів в присутності основи або основи та окисника. Розглядаються також властивості тіазолієвого іону при взаємодії з основою, субстратом та окисником.

В другому розділі описано вихідні речовини, що були об'єктами досліджень, та умови проведення експериментів.

Третій розділ включає результати дослідження кінетики окиснювальних перетворень ТМФ і ТДФ в присутності фериціаніду, а також кінетики відновлення ферицитохрому С при взаємодії з вітаміном В1 та його О-за-міщеними структурними аналогами. В розділі наведено результати хімічного моделювання реакцій гідролізу ТМФ в присутності фериціаніду, йоду або молекулярного кисню, а також кінетичні і термодинамічні характеристики зникнення “жовтої” форми тіаміну та його похідних. Тут представлено результати дослідження гідролізу ТМФ і ТДФ лужною фосфатазою та продемонстровано вплив ферментативного дефосфорилювання ТДФ на швидкість спряжених окисно-відновних реакцій в присутності фериціаніду і ферицитохрому С.

Кінетика окиснення ТМФ і ТДФ фериціанідом

Кінетику окиснення ТМФ і ТДФ фериціанідом вивчали в розбавлених розчинах при незмінній іонній силі і рН 7,5-8,0. Концентрація фериціаніду калію значно перевищувала концентрацію субстрату (2,5Ч10-5 М - 5Ч10-5 М). Початкову швидкість реакції визначали за зміною оптичної густини при 367 нм, яка характеризувала утворення тіохроммонофосфату або тіохромдифосфату.

Встановлено, що окиснювальний розклад ТМФ (2) і ТДФ (3) при дії фериціаніду калію інгібується фероціанідом. В присутності фероціаніду калію, що додавався в реакційну суміш у надлишкових концентраціях, перебіг окиснення характеризується першим порядком за субстратом. При цьому константи швидкості псевдопершого порядку, що спостерігаються (k1obs), прямо пропорційні концентрації окисника (рис. 1), а залежність 1/k1obs від початкової концентрації фероціаніду калію є лінійною (рис. 2). Ці дані свідчать про утворення проміжного продукту, здатного окиснюватись фериціанідом та відновлюватись фероціанідом. Таким інтермедіатом в процесі окисно-відновної реакції може бути катіон-радикал 6, стабілізований резонансною структурою (схема 1).

Схема 1

Рис. 1. Залежність k1obs окиснення ТМФ (1) і ТДФ (2) від концентрації фериціаніду калію. Концентрація фероціаніду калію 2·10-5 М, рН 7,8. Рис. 2. Залежність 1/k1obs окиснення ТМФ (1) і ТДФ (2) від концентрації фероціаніду калію. Концентрація фериціаніду калію 4·10-4 М, рН 7,8.

За умови стаціонарності проміжного катіон-радикалу 6 константа швидкості псевдопершого порядку, що спостерігається, описується виразом:

k1k2Kў Kўў [Fe(CN) 63-](S[Bi])2

k-1[Fe(CN)64-] + k2(S[Bi])

де Kў і Kўў - константи рівноваги на стадіях утворення тіазолієвого іліду 4 і ймовірного інтермедіату 5, відповідно. Припускається, що перенос наступного електрону на фериціанід не лімітує загальну швидкість реакції. Із зворотної залежності:

k-1[Fe(CN)64-] 1

k1 k2KўKўў [Fe(CN)63-](S[B] i)2 k1KўKўў [Fe(CN)63-](S[B] i)

розраховано константи k1ў= k1KўKўў (S[B]i) та співвідношення k-1/k2(S[B]i), які подано в табл. 1.

Таблиця 1

Константи швидкості окиснення ТМФ і ТДФ фериціанідом

(0,05 М фосфатний буфер, 23,5оС)

Субстрат рН kў1·101, M-1c-1 k-1/k2(S[B]і)·104

ТМФ 7,5 0,92±0,45 36,63±2,21

ТМФ 7,7 1,07±0,33 23,54±2,19

ТМФ 7,8 1,00±0,27 14,94±2,87

ТМФ 7,9 1,24±0,59 8,99±0,94

ТМФ 8,0 0,99±0,59 8,01±1,62

ТДФ 7,5 2,70±0,91 1,71±0,38

ТДФ 7,7 3,42±1,17 1,37±0,27

ТДФ 7,8 3,51±0,88 1,09±0,19

ТДФ 7,9 2,80±1,02 0,88±0,28

ТДФ 8,0 3,40±0,58 0,47±0,13

Враховуючи кінетичні дані окиснення вітаміну В1 фериціанідом [Вовк и др., 2000], можна зробити висновок, що константа швидкості утворення проміжного радикального інтермедіату k1ў зменшується, а співвідношення констант швидкостей зворотної та прямої одноелектронної окисно-відновних стадій k-1/k2(S[B]i) зростає в ряду: ТДФ, тіамін, ТМФ. Отримані результати характеризують ТМФ як найстійкішу форму вітаміну В1 по відношенню до фериціаніду.

Кінетика відновлення ферицитохрому С

при взаємодії з тіаміном і його структурними аналогами

Відновлення ферицитохрому С в присутності тіаміну може відбуватися при фізіологічних концентраціях гідроксиду (рНі7,5). Продуктом окиснення вітаміну В1 за умов експерименту є тіохром, зареєстрований методом ВЕРХ. Початкова швидкість утворення фероцитохрому С, що контролювалася спектрофотометрично, зростає із збільшенням рН реакційної суміші. Реакційна здатність тіазолієвого субстрату при взаємодії з ферицитохромом С значно зменшується в ряду від тіаміну до ТМФ і ТДФ і збільшується при використанні О-ацилзаміщених похідних вітаміну В1 8-12 (рис. 3).

Рис. 3. Залежність початкової швидкості відновлення цитохрому С від концентрації ТМФ (1), ТДФ (2), тіаміну (3, 4), і О-(2-адамантил)ацетилтіаміну (5). Концентрація цитохрому С 3Ч10-5 М, рН 7,5 (3, 5), 7,8 (1, 2, 4). При переході від 3-[(4-амі-но-2-метил-5-піримідиніл)ме-тил]-4-метил-5-заміщених структурних аналогів тіаміну до 3-бензил-4-метил-5-заміще-них тіазолієвих солей вихід фероцитохрому С суттєво знижується. Так, при взаємодії ферицитохрому С (3Ч10-5 М) з 3-бензил-4-метил-5-(2-гідрок-сиетил)тіазолій хлоридом (4Ч10-4 М) швидкість реакції (фосфатний буфер, рН 7,8) складає приблизно 10% від даних контрольних дослідів в присутності вітаміну В1.

Гіперболічні криві залежності швидкості від концентрації окисника (рис. 4, А) для всіх субстратів лінеаризуються в подвійних зворотних координатах {1/V; 1/[ферицитохром С]} (рис. 4, Б).

Рис. 4. Залежність початкової швидкості відновлення ферицитохрому С від його концентрації в прямих (А) та подвійних зворотних координатах (Б). Концентрація субстрату 4Ч10-4 М, рН 7,8. 1 - ТМФ, 2- ТДФ, 3 - тіамін, 4 – О-(4-нітробензоїл)тіамін (11), 5 - О-(5-нітро-2-хлорбензоїл)тіамін (12).

Механізм утворення тіохрому з тіаміну включає перенос двох електронів і стадії переносу протону за участю основи. Якщо припустити, що інтермедіатом в процесі перетворення тіаміну (S) в тіохром (Р) за наявності основи є нейтральна трициклічна форма (Sў), то її окиснення гемовою групою ферицитохрому С приведе до утворення катіон-радикального продукту Pў (схема 2). Як видно з рис. 4, А, в певному інтервалі концентрацій окисника швидкість реакції пропорційна його концентрації. Очевидно, друга молекула ферицитохрому С реагує на стадії, що не лімітує загальну швидкість окиснювального перетворення тіаміну або його структурного аналога. Вплив молекулярного кисню на стадії перетворення катіон-радикалу Pў за участю основи в тіохром не змінює стехіометрію реакції, оскільки супероксидний аніон-радикал ефективно окиснюється ферицитохромом С [Avigliano et al., 1986].

Негативні відхилення від лінійності в залежності швидкості накопичення фероцито-хрому С від концентрації окисника (рис. 4, А), а також різна швидкість перетворень ТДФ, тіаміну і ТМФ при окисненні фериціа-нідом та ферицитохромом С (рис. 1, 3) свідчать про можливість комплексоутво-рення білкової молекули з нейтральною трициклічною формою Sў (схема 2).

Схема 2

Виходячи з матеріального балансу загальної концентрації нейтральної трициклічної форми, вільної і зв'язаної в комплекс з ферицитохромом С, швидкість реакції можна подати рівнянням:

k1k2K[CytC][S] k-1[H+]+ k1K[Cyt C]

[S] - концентрація тіаміну чи його структурного аналога, а k1, k-1 і k2 - константи швидкості на стадіях утворення комплексу ліганда з ферицитохромом С і його розкладу на вихідні продукти і продукти окиснення, відповідно. Кінетичне рівняння виведено з урахуванням того, що концентрація ферицитохрому С значно більша за концентрацію проміжної сполуки Sў, яка знаходиться в рівновазі (константа K) з іонною формою субстрату S. З рівняння

1/V=1/k2[S] + [H+]/k2K1K[CytC][S]

можна визначити константи швидкості k2. Нахил лінійної залежності в координатах 1/V; 1/[CytC], що дорівнює [H+]/k2K1K[S], характеризує добуток констант K1 і K.

Отримані значення констант швидкості k2 (табл. 2) збільшу-ються при переході від тіаміну (1) до О-(5-нітро-2-хлорбензоїл)тіамі-ну (12) та похідних (8-11) і зменшуються при використанні ТМФ (2) і ТДФ (3) як субстратів. Подібний характер залежності між структурою та реакційною здатністю вітаміну В1, тіамін-фосфатів і сполук 8-12 виявляється також у відносних значеннях KK1, що зростають в ряду від ТМФ (2) до О-(4-ніт-робензоїл)тіаміну (11) і О-бен-зоїлтіаміну (10). Таблиця 2 Значення k2 в реакції окиснення вітаміну В1 і його похідних ферицитохромом С (0,05М фосфатний буфер, 23,5 oС) Субстрат k2Ч106, с-1 1 1,5±0,2 2 0,6±0,3 3 0,5±0,1 8 3,1±0,5 9 3,3±0,3 10 2,6±0,4 11 2,9±0,3 12 2,0±0,2

Представлені результати демонструють різну реакційну здатність тіаміну і тіамінфосфатів по відношенню до ферицитохрому С. Вони вказують на можливість окисно-відновних стадій в процесі взаємодії вітаміну В1 з білком і на структурні особливості ліганду, які визначають специфічність таких перетворень в модельній системі.

Окиснювальна активація гідролізу ТМФ

В лужних розчинах субстратами окиснювальних перетворень ТМФ, а також продуктами, що дефосфорилюються, можуть бути тіольна форма (13), “жовта” форма (14), нейтральна трициклічна форма (15) та ряд інших сполук. Термодинамічно нестійка “жовта” форма (14), що виникає в реакції тіазолієвого іону з гідроксидом, швидко перетворюється в тіольну форму (13) [Chahine et al., 1983; Maier et al., 1957] (схема 3).

Схема 3

З'ясувалося, що наявність фосфатної групи в структурі замісника в положенні 5 тіазолієвого циклу може змінювати швидкість перетворення “жовтої” форми в тіольну форму. Константи швидкості зникнення “жовтої” форми, що спостерігаються, були розраховані з лінійних залежностей логарифму оптичної густини при 335 нм від часу. Вони збільшуються при переході від тіаміну до ТМФ та ТДФ і зменшуються в реакціях 3-[(4-аміно-2-метил-5-піримідиніл)метил]-4,5-диметилтіазолій хлориду (16) і 3-[(4-аміно-2-метил-5-піримідиніл)метил]-4-метилтіазолій хлориду (17) (табл. 3).

Таблиця 3

Константи швидкості (с-1) зникнення “жовтої” форми тіаміну

та його структурних аналогів (24oС)

Субстрат k1obs, c-1

0,025 M NaOH 0,05 M NaOH

1 (6,4±0,1)Ч10-3 (3,4±0,1)Ч10-3

2 (14,9±0,5)Ч10-3 (7,6±0,2)Ч10-3

3 (17,4±1,2)Ч10-3 (7,6±0,2)Ч10-3

16 (44,8±1,0)Ч10-4 (23,6±0,3)Ч10-4

17 (4,8±0,2)Ч10-4 (3,3±0,1)Ч10-4

Аналіз активаційних параметрів свідчить про те, що різна швидкість зникнення “жовтої” форми вітаміну В1 і його структурних аналогів може бути спричинена впливом ентропійних факторів. Так, при переході від тіаміну до ТМФ як субстрату DS# зростає від –24,9 кал/мольЧК до –21,7 кал/мольЧК.

Відомо, що швидкість хімічного гідролізу діаніонів монозаміщених фосфатів є досить низькою [Kirby et al., 1966]. Нами було встановлено, що значне прискорення гідролізу фосфатного зв'язку відбувається в лужних розчинах при окисненні ТМФ йодом, фериціанідом або молекулярним киснем. Використання розчинів йоду або фериціаніду приводить до накопичення в реакційній суміші поряд з фосфорильованими продуктами 18 і 19 також тіаміну, тіохрому і неорганічного фосфату (схема 4).

Схема 4

Максимальні виходи тіаміну і тіохрому при еквімолярній концентрації йоду стосовно субстрату і надлишковій концентрації йодиду складають приблизно по 3%, а неорганічного фосфату – 6%. Дефосфорилювання ТМФ при спільній дії лугу та йоду характеризується нелінійними залежностями від концентрацій реагентів (рис. 5, 6). При різних концентраціях йоду і лугу вихід продуктів гідролізу пропорційний витрачанню ТМФ. В результаті окиснення ТМФ 0,08 М фериціанідом в присутності 0,02-0,05 М NaOH загальна кількість тіохрому та тіаміну, що утворюються, не перевищує 3-7% від кількості фосфорильованих продуктів реакції. При цьому гідроліз фосфатного зв'язку інгібується фероціанідом.

Рис. 5. Залежність витрачання ТМФ (1) і виходів неорганічного фосфату (2), тіохрому (3), тіаміну (4) від концентрації йоду. NaOH 0,03 М; 30 0C. Рис. 6. Залежність витрачання ТМФ (1) і виходів неорганічного фосфату (2), тіохрому (3), тіаміну (4) від концентрації NaOH. Йод 0,04 М; 300C.

Дефосфорилювання ТМФ в присутності кисню повітря відбувається при підвищенні концентрації лугу до 0,1-0,5 М і супроводжується реакціями незворотного розкладу субстрату. Після нейтралізації реакційної суміші були ідентифіковані продукти: неорганічний фосфат, тіохром, а також 4-аміно-5-амінометил-2-метилпіримідин. Тіамінангідрид не накопичувався, реакційна суміш не вміщувала також тіаміну. Вихід неорганічного фосфату зростає зі збільшенням температури (рис. 7).

Кінетичні дані накопичення неорганічного фосфату в процесі деструкції ТМФ в аеробних умовах дозволяють виділити два етапи реакції - швидкий і повільний, кожен з яких характеризується областю певного нахилу в напівлогарифмічних координатах (рис. 7). При цьому швидкість утворення неорганічного фосфату зменшується в міру зникнення “жовтої” форми ТМФ. Така ж двофазна кінетика описує витрачання ТМФ (рис. 8).

Отримані кінетичні дані (рис. 7, 8) узгоджуються з протіканням паралельних стадій перетворення субстрату. Швидкість незворотного витрачання ТМФ за умов реакції можна представити рівнянням, що містить суму експоненціальних членів і відбиває наявність “жовтої” і тіольної форм:

-d[S]/dt = kў[S][1- exp(-kt)] + kўў[S]exp(-kt),

де S - концентрація субстрату, що в умовах дослідів визначається як сума концентрацій “жовтої” і тіольної форм, k - константа швидкості перетворення “жовтої” форми в тіольну форму, kў і kўў - константи швидкості незворотного розкладу тіольної і “жовтої” форм субстрату, відповідно. Після інтегрування

[S] = [S]0 exp {[(kўў- kў)/k][exp(-kt)-1] - kўt}.

Рис. 7. Кінетика утворення неорганічного фосфату в процесі аеробного розкладу 0,002 М (2), 0,004 М (1,3,4), 0,005 М (5) ТМФ при 35 0С (3), 42 0С (1,4), 50 0С (5). NaOH 0,25 М (1), 0,5 М (2,3,5), 1 М (4). Рис. 8. Кінетика витрачання ТМФ (1) і утворення неорганічного фосфату (2) в присутності кисню повітря. NaOH 0,5 М; 50 0C.

Константи швидкості kў і kўў розраховані методами нелінійної регресії. Необхідні для цих розрахунків значення k отримані з констант швидкості зникнення “жовтої” форми при нижчих температурах, що складали для ТМФ 4,17Ч10-4 с-1 (150С), 7,75Ч10-4 с-1 (230С), 13,63Ч10-4 с-1 (300С), 24,03Ч10-4 с-1 (380С).

Дефосфорилювання ТДФ при спільній дії лугу та окисників не відбувається, однак кінетичні закономірності його розкладу в лужному середовищі за наявності кисню повітря є подібними до кінетики деструкції ТМФ. При цьому значення констант швидкості перетворення “жовтих” форм ТМФ і ТДФ (kўў) більші від значень констант швидкості деструкції їх тіольних форм (kў). Константи kў і kўў зростають при переході від ТМФ і ТДФ до тіаміну (табл. 4).

Таблиця 4

Константи швидкості розкладу ТМФ і його структурних аналогів

в лужному середовищі. 500С, 0,5 М NaОН

Субстрат S0Ч104, М kЧ103, c-1 kўўЧ104, c-1 kўЧ106, c-1

ТМФ 3,95±0,01 5,46 1,39±0,28 7,97±0,80

ТДФ 3,97±0,03 5,58 1,64±0,58 8,23±1,10

Тіамін 3,97±0,01 5,69 2,05±0,27 14,61±0,83

Очевидно, дефосфорилювання ТМФ спричинено окисненням проміжних сполук, які виникають в присутності лугу, а нелінійна кінетика накопичення неорганічного фосфату пов'язана з різною реакційною здатністю “жовтої” та тіольної форм. При цьому

швидкість гідролізу ТМФ в лужному середовищі за наявності кисню повітря значно перевищує швидкість гідролізу діаніону п-нітрофенілфос-фату (константа швидкості при 390С 1,6Ч10-8 с-1 [Hoff et al., 1998]). Можна припустити, що в перехідному стані реакції дефосфорилювання ТМФ електронна густина на алкоксид-іоні, який

відходить, стабілізується внаслідок внутрішньомолекулярної взаємодії мостикового атома кисню з електронодефіцитним центром інтермедіату окиснювальних перетворень. Дефосфорилюванню можуть підпадати проміжні катіон-радикальні продукти або комплекси з переносом заряду. Дефосфорильований інтермедіат надалі окиснюється до тіохрому чи відновлюється до тіаміну.

Отримані результати свідчать про те, що хімічне окиснення ТМФ в живій клітині фізіологічним або екзогенним окисником може супроводжуватись гідролізом його фосфатного зв'язку. Ці реакції розглядаються як нова модель переносу фосфорильного залишку ТМФ.

Відносна реакційна здатність ТМФ і ТДФ

в реакціях ферментативного гідролізу

Гідроліз ТМФ і ТДФ в присутності лужної фосфатази з кишок теляти в трис-НСI буфері описується кінетикою Міхаеліса – Ментен. Відхилення в кінетичних залежностях витрачання ТМФ і ТДФ, що обумовлені інгібуючим впливом продуктів дефосфорилювання, на початку реакції є незначними. При незмінних умовах дослідів швидкість гідролізу ТМФ у порівнянні зі швидкістю ферментативних перетворень ТДФ є значно нижчою. Найсуттєвіші відмінності у швидкостях гідролізу ТМФ і ТДФ спостерігаються при рН 8,9-9,0. Разом з тим, початкові швидкості дефосфорилювання ТДФ, АДФ і АМФ при каталізі лужною фосфатазою приблизно одинакові. Отримані із залежностей Лайнуівера – Берка значення Km складають (5,2±1,6)Ч10-3 М для ТМФ і (3,0±0,8)Ч10-4 М для ТДФ. Різний ступінь спорідненості ферменту до п-нітрофенілфосфату, ТМФ і ТДФ, а також конкурентний характер зв'язування ТДФ демонструє рис. 9.

Значення каталітичної константи швидкості реакції визначається виразом kкат =1/(1/k2+1/k3), а співвідношення kкат/Km, що характеризує зміну вільної енергії між вихідним та перехідним станом стадії фосфорилювання ферменту, дорівнює k1k2/(k-1+k2) [Manes et al., 1998; Hall et al., 1986] (схема 5).

Схема 5

Аналіз результатів свідчить про те, що співвідношення Vmax/Km для ТДФ у 53 рази перевищує значення Vmax/Km для ТМФ. Однією з причин зниження швидкості дефосфорилювання ТМФ через відмінності на стадіях, що визначаються константами k-1, k1 і k2, може бути взаємодія позитивно зарядженого тіазоліє-вого циклу субстрату з найближ-чим білковим оточенням в активному центрі лужної фосфа-тази. Це змінює дисоціативність перехідного стану ферментатив-ної реакції.

Рис. 9. Залежність 1/V від 1/[S] гідро-лізу п-нітрофенілфосфату при дії лужної фосфатази (рН 9,0) (1); в присутності 5 мМ ТМФ (2); в присутності 2 мМ ТДФ (3).

Вплив лужної фосфатази на функціонування модельних окисно-відновних систем може бути пов'язаний з різною по відношенню до окисника реакційною здатністю тіамінфосфатів і продуктів дефосфорилювання, що утворюються. Так, швидкість відновлення ферицитохрому С в карбонатному буфері при рН 9,25 збільшується при використанні тіаміну замість ТМФ чи ТДФ. Тому в системі, що вміщувала ТДФ і препарати лужної фосфатази, внаслідок реакцій ферментативного гідролізу швидкість відновлення ферицитохрому С зростає. Швидкість окиснення фериціанідом в боратному буфері (рН 9,18) зменшується при переході від ТДФ до тіаміну і ТМФ. У спряженій системі при взаємодії ТДФ з лужною фосфатазою витрачання окисника сповільнюється.

Можна припустити, що при інтенсифікації окиснювальних перетворень в живій клітині ТМФ є відносно стабільною формою вітаміну В1. Знижена реакційна здатність ТМФ у порівнянні з тіаміном і ТДФ може забезпечувати його ймовірні транспортні функції.

ВИСНОВКИ

1. В дисертації представлено нове вирішення наукової задачі і ряд теоретичних узагальнень, що виявляється в з'ясуванні закономірностей та обгрунтуванні механізмів модельних окиснювальних перетворень вітаміну В1 і його структурних аналогів.

2. На підставі аналізу кінетичних даних окиснення ТМФ і ТДФ фериціанідом показано, що реакція інгібується продуктом реакції – фероціанідом. Розраховано константи швидкості утворення стаціонарної проміжної сполуки та співвідношення констант швидкостей окремих стадій реакції. Отримані результати характеризують ТМФ у порівнянні з ТДФ чи тіаміном як найбільш стійку сполуку по відношенню до окисника.

3. Встановлено кінетичні закономірності окиснювальних перетворень вітаміну В1 при взаємодії з ферицитохромом С. Реакційна здатність субстратів зростає в ряду від тіаміну до його О-ацилзаміщених похідних. Константи швидкості окиснення ТМФ і ТДФ значно нижчі. Особливості перебігу реакції проявляються в нелінійній залежності швидкості відновлення ферицитохрому С від його концентрації.

4. Знайдено, що в лужному середовищі окиснювальні перетворення ТМФ при дії фериціаніду або йоду супроводжуються гідролізом фосфатного зв'язку з утворенням неорганічного фосфату, тіаміну та тіохрому. В присутності лугу та кисню повітря швидкість дефосфорилювання (поряд з утворенням тіохрому) зменшується в процесі перетворення “жовтої” форми в тіольну форму ТМФ. Розраховано константи швидкості окиснювального розкладу “жовтої” та тіольної форм ТМФ.

5. Продемонстровано вплив замісників у положенні 5 тіазолієвого циклу на константи швидкості та термодинамічні активаційні параметри зникнення “жовтої” форми вітаміну В1 і його структурних аналогів.

6. Показано, що реакційна здатність ТМФ як субстрату лужної фосфатази знижена у порівнянні з реакційною здатністю ТДФ. За рівних умов Vmax/Km гідролізу ТМФ в 53 рази менше від Vmax/Km реакції гідролізу ТДФ, що пояснюється впливом позитивно зарядженого тіазолієвого циклу ТМФ на найближче оточення в активному центрі ферменту.

7. Механізми модельних окисно-відновних реакцій можуть включати: перетворення тіазолієвого іону вітаміну В1 і тіамінфосфатів при дії основи в продукти, що здатні окиснюватись; утворення нейтральної трициклічної форми тіаміну та її комплексу з модельним білком - ферицитохромом С; стадії одноелектронного переносу при окисненні фериціанідом і ферицитохромом С; спряження окисно-відновного процесу з дефосфорилю-ванням ТМФ у лужному середовищі.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Бабий Л.В., Муравьева И.В., Вовк А.И. Разложение “желтой” формы тиамина и его структурных аналогов // Доповіді НАН України. – 2001, № 8. – С. 118-122.

2. Муравьева И.В., Бабий Л.В., Вовк А.И. Кинетика окисления тиамин-монофосфата и тиаминдифосфата феррицианидом // Доповіді НАН України. – 2001, № 7. – С. 135-139.

3. Вовк А.И., Бабий Л.В., Муравьева И.В. Относительная реакционная способность тиаминмонофосфата и тиаминдифосфата при взаимодействии со щелочной фосфатазой // Укр. біохім. журн. – 2002. – Т. 74, № 1. – С. 93-96.

4. Вовк А.І., Бабій Л.В., Бугас Р.В., Муравйова І.В. Механізми взаємодії тіаміну і його структурних аналогів з ферицитохромом С // Укр. біохім. журн. – 2002. – Т. 74, № 4а. – С. 29.

5. Бабий Л.В., Вовк А.И. Окислительная активация гидролиза тиаминмонофосфата // Фізіологічно активні речовини. – 2002. – Т. 33, № 1. – С. 72-77.

6. Вовк А.І., Муравйова І.В., Бабій Л.В. Вітамін В1 і тіамінфосфати: механістичні моделі кислотно-основних перетворень // Фізіологія рослин в Україні на межі тисячоліть. – Київ, 2001. – Т.1. – С. 295-300.

7. Бабій Л., Муравйова І., Вовк А. Взаємодія цитохрому С з вітаміном В1 та його структурними аналогами // Восьма наукова конференція “Львівські хімічні читання — 2001”. Тези доповідей. – Львів, 2001. – С. 22.

8. Бабій Л.В., Муравйова І.В., Вовк А.І. Механізми модельних окиснювальних перетворень вітаміну В1 і його структурних аналогів // XIX Українська конференція з органічної хімії. Тези доповідей. – Львів, 2001. – С. 170.

Бабій Л.В. Модельні окиснювальні перетворення тіаміну і тіамінфосфатів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 – біоорганічна хімія. – Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2002.

Дисертацію присвячено моделюванню окиснювальних перетворень природних низькомолекулярних біорегуляторів – вітаміну В1, тіамінмонофосфату (ТМФ) і тіаміндифосфату (ТДФ). Встановлено, що окиснення ТМФ і ТДФ фериціанідом калію інгібується фероціанідом і включає стадію утворення проміжного катіон-радикального продукту. Константи швидкості, що спостерігаються, знижуються при переході від ТДФ до тіаміну і ТМФ. Вперше досліджено окиснювальні перетворення вітаміну В1 та його О-заміщених структурних аналогів при дії фізіологічного окисника – ферицитохрому С. Особливості перебігу реакції виявляються в нелінійній залежності швидкості відновлення цитохрому С від його концентрації, що пояснюється попереднім утворенням комплексу нейтральної трициклічної форми тіаміну з білком. Встановлено, що окиснення ТМФ в лужному середовищі при дії фериціаніду або йоду супроводжується прискореним гідролізом фосфатного зв'язку з утворенням неорганічного фосфату, тіаміну і тіохрому. В аеробних умовах накопичення неорганічного фосфату відбувається разом з утворенням тіохрому та процесами незворотного розкладу ТМФ. Розраховано константи швидкості окиснювального розкладу “жовтої” та тіольної форм ТМФ. Продемонстровано вплив замісників в положенні 5 тіазолієвого циклу тіаміну і його структурних аналогів на константи швидкості та термодинамічні активаційні параметри зникнення “жовтої” форми. Вивчено реакційну здатність фосфорних естерів тіаміну при взаємодії з лужною фосфатазою.

Ключові слова: тіамін, тіамінмонофосфат, тіаміндифосфат, фериціанід, ферицитохром С, окиснення, гідроліз, неорганічний фосфат, лужна фосфатаза, моделювання, механізми реакцій.

Бабий Л.В. Модельные окислительные превращения тиамина и тиаминфосфатов. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 – биоорганическая химия. – Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2002.

Диссертация посвящена моделированию неферментативных окислительных превращений природных низкомолекулярных биорегуляторов – витамина В1, тиаминмонофосфата (ТМФ) и тиаминдифосфата (ТДФ). Впервые установлены кинетические закономерности окисления ТМФ и ТДФ феррицианидом в фосфатом буфере при рН 7,5-7,8, протекающего с образованием соответствующих производных тиохрома. Реакция ингибируется ферроцианидом. При избыточной начальной концентрации феррицианида зависимость обратной величины наблюдаемой константы скорости псевдопервого порядка от концентрации ферроцианида является линейной. В присутствии избытка ферроцианида калия реакция характеризуется первым порядком по субстрату и первым порядком по окислителю. Рассчитаны константы скорости образования вероятного промежуточного продукта и соотношения констант его превращений в обратной и последующей стадиях окислительно-восстановительной реакции.

Впервые исследованы кинетические закономерности реакции восстановления феррицитохрома С при взаимодействии с тиамином и его О-замещенными структурными аналогами в фосфатном буфере при рН 7,5-7,8. Скорость восстановления феррицитохрома С прямо пропорциональна концентрации тиамина или его производных. Зависимость скорости реакции от концентрации окислителя характеризуется отрицательными отклонениями. Установлено, что при окислении феррицитохромом C реакционная способность тиамина значительно превышает реакционную способность ТДФ и ТМФ, в то же время при окислении феррицианидом скорость реакции возрастает в ряду: ТМФ, тиамин, ТДФ. Скорость восстановления феррицитохрома С увеличивается при использовании в качестве субстратов О-(2-норборноил)тиамина, О-(2-адамантил)ацетилтиамина, О-бензоилтиамина, О-(4-нитробензоил)тиамина, О-(4-нитро-2-хлорбензоил)тиамина.

Изучена кинетика и определены термодинамические активационные параметры исчезновения “желтой” формы витамина В1 и его структурных аналогов, отличающихся природой заместителя в положении 5 тиазолиевого цикла. Наблюдаемые константы скорости псевдопервого порядка увеличиваются при переходе от тиамина к ТМФ и ТДФ и уменьшаются при использовании в качестве субстратов 3-[(4-амино-2-метил-5-пиримидинил)метил]-4,5-диметилтиазолий хлорида и 3-[(4-амино-2-метил-5-пиримидинил)метил]-4-метилтиазолий хлорида. Повышение ионной силы раствора приводит к снижению скорости исчезновения “желтой” формы ТМФ и ТДФ.

Установлено, что окислительные превращения ТМФ при действии щелочи, феррицианида или йода сопровождается частичным гидролизом фосфатной связи с образованием неорганического фосфата, тиамина и тиохрома. Выход неорганического фосфата составляет примерно 6% при окислении ТМФ на 80%. Гидролиз фосфатной связи в присутствии кислорода воздуха, сопряженный с образованием тиохрома, наблюдается в более щелочной среде. При этом скорость гидролиза уменьшается после превращения “желтой” формы в тиольную форму субстрата. Рассчитаны константы скорости окислительного разложения “желтой” и тиольной форм ТМФ.

Реакционная способность ТМФ в качестве субстрата щелочной фосфатазы из тонкой кишки теленка является более низкой по сравнению с реакционной способностью ТДФ. ТДФ более эффективно, чем ТМФ, конкурирует с п-нитрофенилфосфатом за связывание в активном центре фермента. Значения Km при рН 8,5 и 30оС равны (5,2±1,6)Ч10-3 М для ТМФ и (3,0±0,8)Ч10-4 М для ТДФ. При одних и тех же условиях соотношение Vmax/Km гидролиза ТДФ более чем в 53 раза больше Vmax/Km ферментативной реакции ТМФ, что объясняется влиянием положительно заряженного тиазолиевого цикла субстрата на ближайшее окружение в активном центре фермента. Влияние щелочной фосфатазы на функционирование модельных окислительно-восстановительных систем связано с различной по отношению к окислителю реакционной способностью субстратов и образующихся продуктов дефосфорилирования.

Предложены механизмы окислительно-восстановительных превращений витамина В1 и тиаминфосфатов, которые включают: катализ основанием разложения тиазолиевого иона до продуктов, способных окисляться; образование нейтральной трициклической формы и ее комплекса с модельным белком – феррицитохромом С; стадии одноэлектронного переноса с образованием катион-радикальных интермедиатов при окислении феррицианидом и феррицитохромом С; сопряжение окислительно-восстановительных стадий с дефосфорилированием ТМФ в щелочной среде. Предполагается, что накопление ТМФ как резервной формы витамина В1 может быть одной из функций живой клетки при интенсификации окислительных процессов.

Ключевые слова: тиамин, тиаминмонофосфат, тиаминдифосфат, феррицианид, феррицитохром С, окисление, гидролиз, неорганический фосфат, щелочная фосфатаза, моделирование, механизмы реакций.

Babiy L.V. The model oxidative transformations of thiamin and thiamin phosphates. – Manuscript.

Thesis for the candidate degree in chemical sciences, speciality 02.00.10 – bioorganic chemistry. – Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2002.

The thesis is devoted to the modelling of oxidative transformations of natural low-molecular bioregulators - vitamin B1, thiamin monophosphate (TMP) and thiamin diphosphate (TDP). It was established that the oxidation of TMP and TDP by ferricyanide is inhibited by ferrocyanide and involves one-electron transfer step with formation cation-radical intermediate. The observed rate constants decrease if using TMP instead of TDP or thiamin. Oxidative transformations of vitamin B1 and its O-substituted structural analogues by action of ferricytochrome C as physiological oxidant has been investigated. Distinction of reaction is displayed in nonlinear dependence of reduction rate of cytochrome C on its concentration attributed to formation of complex of thiamin neutral tricyclic form with protein. Oxidative transformations of TMP in alkaline solutions at the presence of ferricyanide or iodine are accompanied by a rapid hydrolysis of phosphate bond with formation of inorganic phosphate, thiamin and thiochrome. In the aerobic conditions inorganic phosphate accumulation is accompanied by thiochrome formation and TMP irreversible destruction. Rate constants of oxidative decomposition of yellow and thiol forms of TMP were calculated. The effects of substituents in a position 5 of thiazolium cycle of thiamin and its structural analogues on kinetic rate constants and thermodynamic activation parameters of transformation of yellow form were shown. Reactivity of TMP and TDP toward alkaline phosphatase was investigated.

Key words: thiamin, thiamin monophosphate, thiamin diphosphate, ferricyanide, ferricytochrome C, oxidation, hydrolysis, inorganic phosphate, alkaline phosphatase, modelling, mechanism of reaction.