ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім В. Н. КАРАЗІНА

БАРАНОВСЬКИЙ Сергій Федорович

УДК 577. 113

МОЛЕКУЛЯРНИЙ МЕХАНІЗМ СИКВЕНС – СПЕЦИФIЧНОЇ ВЗАЄМОДІЇ ІНТЕРКАЛЮЮЧИХ ЛIГАНДIВ З ДЕЗОКСИОЛIГОНУКЛЕОТИДАМИ РІЗНОЇ ДОВЖИНИ І ВТОРИННОЇ СТРУКТУРИ

03.00.02 - біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора фiзико-математичних наук

Харків - 2002

Дисертація є рукопис.

Роботу виконано в Севастопольському державному технічному

університеті Міністерства освіти і науки України.

Науковий консультант доктор фізико - математичних наук,

професор Веселков Олексій Никонович,

Севастопольській державний технічний

університет, завідувач кафедри фізики.

Офіційні опоненти:

-доктор фізико - математичних наук, професор

Семенов Михайло Олексійович, Інститут радіофізики та

електроніки ім. О. Я. Усікова НАН України, провідний науковий

співробітник відділу біофізики (м. Харків );

-доктор фізико - математичних наук, професор

Харкянен Валерій Миколайович, Інститут фізики НАН

України, завідувач відділу фізики біологічних систем (м. Київ);

-доктор фізико-математичних наук, професор

Бержанський Володимир Наумович, Таврійський національний

університет ім. В.І.Вернадського, завідувач кафедри експеримен-

тальної фізики (м. Сімферополь).

Провідна установа

Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна

НАН України, відділ молекулярної біофізики м. Харків.

Захист відбудеться “ 14 “ 03 2002 р. о 1500 годині на засіданні специалізованої вченої ради Д 64.051.13 Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна, 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4,ауд.7-4.

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4,ауд.7-4.

Автореферат розіслано “ 8 “ лютого 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема взаємодії нуклеінових кислот з біологічно активними ароматичними речовинами є однією з важливих у сучасній молекулярній біофізиці. Відомо, що зв'язування нуклеінових кислот (НК) з багатьма лікарськими препаратами, канцерогенними і мутагенними речовинами, а також з барвниками, характерною рисою яких є наявність плоских гетероциклічних хромофорів, приводить до зміни конформації полімерних молекул НК, характеру білково - нуклеінових взаємодій і, як наслідок, до порушення біологічних функцій генетичного матеріалу клітини. Лікарські препарати з даного класу хімічних сполук широко використовуються при лікуванні різноманітних пухлинних захворювань, зокрема, у хіміотерапії лейкозів, що збіль-шились після аварії на Чорнобильській атомній електростанції. Для з'ясовування молекулярного механізму дії ароматичних лігандів використовуються різноманітні теоретичні й експериментальні методи дослідження. Існуючі теорії взаємодії, особливо модель інтеркаляції, зробили суттєвий внесок у розуміння біологічних властивостей і характеру взаємодії органічних ароматичних сполук з молекулами нуклеінових кислот. Експериментально найбільш повну інформацію про структурні і термодинамічні параметри комплексоутворення лігандів з олігонуклеотидами в розчині можливо одержати за допомогою методів одно- и двомірної ЯМР спектроскопії, що і визначило вибір методів дослідження і розробку пов'язаних з ними методик разрахунку параметрів комплексоутворення молекул і структур молекулярних комплексів.

Конформаційна мінливість і складність побудови полімерних молекул нуклеінових кислот, велика різноманітність місць зв'язування в макромолекулах обмежують можливість детального аналізу іх комплексоутворення з низькомолекулярними ароматичними сполуками. Проте експеримент показує, що селективність іх зв'язування з лігандами виявляється вже на коротких нуклеотидних послідовностях. Отже, основні особливості молекулярного механізму дії біологічно активних речовин, енергетичні і структурні характеристики комплексів лігандів з ДНК і РНК можуть бути виявлені шляхом вивчення іх взаємодії з фрагментами нуклеінових кислот. Зокрема, висновок про селективність зв'язування того або іншого низькомолекулярного сполучення з ви-значеним сайтом нуклеотідної послідовності можна зробити на основі порівняльного аналізу величин рівноважних констант взаємодії лігандів з олігонуклеотидами різноманітних довжин, нуклеотідного складу і послідовості основ у ланцюгу. Такі експерименти стали можливими завдяки розвитку методик синтезу олігонуклеотидів із заданими характеристиками.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в повній відповідності з планом науково-дослідних робіт кафедри фізики і хімії Севастопольсього держав-ного технічного університету в рамках держбюджетних НДР: “Специфіка взаємодії лікарськіх речовин з ДНК. Встановлення природи фізико-хімічних факторів, відповідальних за ефектив-

ність зв'язування лікарських речовин, що мають різну біологічну активність, із заданими послідовностями ДНК” ( “Комплекс”, “Комплекс - 2” 1997 - 1999 рр., Координаційний план №16 Міносвіти України) і “Молекулярні основи протекторної дії кофеіна та його метаболітів як комплексоутворювачів - інтерцепторів ароматичних біологічно - активних речовин” (“Ліганд”1998 - 2000 рр.), за програмою Міжнароднього наукового фонду (фонд Сороса) – гранти UD 7000, UD 7200 (1994 - 1996), а також за Договором про науково - технічне співробітництво СевДТУ з департаментом хімії Беркбек коледжу Лондонського університету (Великобританія) на спільні наукові дослідження (1993 – 1998 рр., 1998 – 2003 рр. “Specificity of drug-nucleic acid interactions ”) і за Міжнародним Грантом INTAS № 97 - 31753 (1999 - 2002 рр. “Design, synthesis and testing of novel biologically - active molecules as potential drugs with sequence - specific binding to nucleic acids”).

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було встановлення основних закономірностей інтеркаляційної взаємодії ароматичних лігандів з комплементарними і некомплементарними олігонуклеотидними послідовностями в водно-сольовому розчині; з'ясування впливу довжини нукле-отидного складу, вторинної структури нуклеотидної послідовності на процеси комплексоутворення ароматичних лігандів з дезоксиолігонуклеотидами і можливість перенесення отриманих характеристик на полімерну молекулу ДНК.

Для досягнення поставленої мети вирішувались задачі: розшифровки і віднесення сигналів протонів та ядер фосфору в одновимірних і двомірних спектрах розчинів досліджуємих молекул, виявлення в спектрах ядерного ефекту Оверхаузера характерних внутрішньо - і міжмолекулярних крос - піків для молекулярних комплексів у розчині та їх інтерпретація; вивчення закономірностей самоасоціації ароматичних лігандів, дезоксиолігонуклеотидів; аналізу вторинних структур олігонуклеотидів різної довжини і послідовності основ, визначення кількісних характеристик, необхідних для аналізу рівноваги у розчині барвник – олігонуклеотид; розробки методик визначення структурних і термодинамічних параметрів асоціації і комплексоутворення молекул на основі концентраційних і температурних залежностей протонних хімічних зсувів; вивчення комплексоутворення фенантридінового барвника бромистого етидію (EB) і антрациклінового антибіотика дауноміцину (DAU) з одно- і дволанцюговими дезоксиолігонуклеотидами різноманітного нуклеотидного складу і послідов-ності основ у ланцюзі, встановлення основних типів утворюючихся комплексів їх структур і термодинамічних характеристик; аналізу характеру фізико-хімічних взаємодій, відповідальних за селективність зв'язування аромати.

Об'єкт дослідження – дезоксиолігонуклеотиди різної довжини і вторинної структури і іх комплекси з біологічно активними ароматичними речовинами - бромистим етидієм і дауноміци-ном у водному розчині.

Предмет дослідження – одномірнї і двомірнї ЯМР спектри розчинів молекул, просторові структури молекулярних комплексів.

Методи дослідження - одномірна і двомірна ЯМР спектроскопія, спектрофотометрія, моделювання процесів комплекоутворення молекул в умовах багатокомпонентної рівноваги у розчині.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено, що характеристики процесу самоасоціації лігандів істотньо залежать від структури їх хромофорів і характеру бічних ланцюгів і груп. Отримано кількісні дані, які показують, що термодинамичні параметри самоасоціації дезоксиолігонуклеотидів визначаються складом, послідовністю основ і довжиною нуклеотидного ланцюга; за термодинамічною стабільністю досліджені самокомплементарні дуплекси дезоксиолігонуклеотидів розташовуються в нас-тупному ряді: d(CGCGCG) 2 > d(GACATGTC)2 > d(CGTACG) 2 > d (TACGTA) 2 > d(CGCG) 2 > d (GCGC) 2 > d (TGCA) 2 > d (ACGT) 2 > d (AGCT) 2, а диміри несамокомплементарних дезокситетрануклеотидів у такій послідовності: d (CGAA) 2 ”

d(AAGC) 2 > d (CTGA) 2 > d (GAAG) 2. Особливе місце в плані термодинамічної стабільності (Тm ” 760 С) займає несамокомплементарний дезоксиолігонуклеотид d(GCGAAGC), спроможний утворювати шпилькову структуру у водному розчині. Методом одномірної і двомірної гомо - і гетероядерної ЯМР-спектроскопії проведено комплексне і систематичне дослідження взаємодії у водному розчині типового інтеркалятора бромистого етидію і антрациклінового антибіотика дауноміцину з вказаними дезоксиолігонуклеотидами, що відрізняються нуклеотидним складом, послідовністю основ у ланцюзі та числом місць можливої посадки ліганду. Отримано і проаналізовано двомірні ЯМР спектри, що свідчать про місця переважної посадки ліганда при взаємодії з олігонуклеотидами. Виявлено особливості утворення комплексів при різноманітних співвідношеннях вхідних концентрацій взаємодіючих молекул і температурах розчину. Вста-новлено переважну взаємодію бромистого етидію з пірімідін-пуріновою (pyr-pur) послідовністю основ у самокомплементарному олігонуклеотидному дуплексі, а дауноміцину з триплетною нуклеотидною послідовністю, що містить дві сусідні CG-пари, фланковані AT-парою в гексамірі d(CGTACG)2. Показано, що при взаємодії лігандів з одно - і двоспіральними молекулами оліго-нуклеотидів характер зв'язування залежить як від нуклеотидного складу, так і від послідовності основ у ланцюзі. Антибіотик виявляє певну специфічність зв'язування з d(CpG)-сайтом в одно-ниткових послідовностях дезоксигексануклеотидів. На основі запропонованих моделей визна-чено структурні і термодинамічні характеристики самоасоциації молекул, а також реакцій компле-ксоутворення олігонуклеотид - ліганд. Розроблено методику розрахунку структур комплексів барвників з олігонуклеотидами за граничними значеннями протонних хімічних зсувів взаємоді-ючих молекул. Визначено просторові структури 1:1 і 1:2 комплексів бромистого етидію і дауноміцина з дезоксі- олігонуклеотидами, проведено порівняльний аналіз геометричних особли-востей комплексів молекул в розчині. На основі сумісного аналізу експериментальних концен-траційних і температурних залежностей хімічних зсувів лігандів розраховано внески різно-манітного типу реакцій у розчині в сумарні теплові і ентропійні ефекти.

Проведено порівняльний аналіз різноманітних типів молекулярних взаємодій у процесах комплексоутворення ароматичних лігандів з дезоксиолігонуклеотидами в розчині.

Практичне значення одержаних результатов. Отримані в роботі експериментальні і теоретичні результати поглиблюють існуючі уявлення про взаємодію біологічно активних низькомолекулярних речовин з фрагментами молекул нуклеінових кислот у різноманітних конформаційних станах. Клас речовин, що інтеркалюють, досить широкий і різноманітний за своїми медично - біологічними властивостями. Прикладом можуть бути протипухлинні антибіотики - інгібітори синтезу ДНК і РНК, акридинові барвники, що володіють канцерогенною і мутагенною активністю і фенантридиновий барвник бромистий етидій, що виявляє трипаноцидну дію. Розроблені в дисертації методики, алгоритми і програми аналізу концентраційних і температурних залежностей експериментальних параметрів ЯМР – спектроскопії дозволяють проаналізувати закономірності рівноваги “олігонуклеотид – ліганд” у розчині, знайти константи утворення різноманіт-ного вигляду комплексів, визначити структури молекулярних комплексів, диференціювати вклади різноманітних реакцій комплексоутворення в сумарні тепловій і ентропійний ефекти при взаємодії інтеркаляторів з олігонуклеотидами у розчині. Запропоновані методики розрахунку структурних і термодинамічних параметрів застосовано для аналізу сиквенс-специфічного зв'язування ароматичних лігандів з одноланцюговими і двохспіральними фрагментами нуклеінових кислот в умовах складної рівноваги у розчині. Отримані результати можуть бути використані при детальних дослідженнях поцесів молекулярного “впізнавання” у різноманітних фізико-хімічних і біологічних системах, установленні принципів виборчої взає-модії з генетичним матеріалом клітини, розробці лікарських препаратів.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих із співавторами наукових роботах особистий внесок здобувача полягає:

у роботах [1,2,9] - в проведенні експерименту, аналізі літературних даних,обробці експериментальних даних;

у роботах [10,19,38] - в проведенні чисельного експерименту та обговоренні результатів;

у роботах [28,40,41] - в проведенні вимірювань та аналізі експериментальних даних ;

у роботах [3,4,5,37] - в проведенні аналізу літературних данних, постановці задачі теоретичного дослідження і написанні наукових статей;

у роботах [6-9,11,12,14,36] - в написанні наукових статей, виборі і реалізації аналітичних і чисельних методів, розробці методик визначення структурних і термодинамічних параметрів

асоціації і комплексоутворення молекул на основі концентраційних і температурних залежностей протонних хімічних зсувів;

у роботах [13,16,35] – в постановці задачі, виборі і реалізації аналітичних і чисельних методів її розв'язання, розшифровці і віднесенні сигналів протонів в одномірних і двомірних спектрах розчинів досліджуваних молекул;

у роботах [15,17,18,22,27,29,39] - в побудові структур молекулярних комплексів у розчині, аналізі і інтерпретації отриманих результатів, написанні наукових статей, аналізі літературних даних;

у роботах [20,23,24,33] - в розвитку методу аналізу ЯМР - спектрів, проведенні теоретичних розрахунків, аналізі та інтерпретації отриманих результатів;

у роботах [31,32,34] - в постановці задачі експериментального дослідження, проведенні теоретичних розрахунків, обговоренні отриманих результатів, написанні наукових статей.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були представлені й обговорювалися на: семінарі хімічного товариства їм. Д. І. Менделєєва “Молекулярна фізика і біофізика водних систем”, Санкт-Петербург, 1992, 1993 рр.; семінарі департаменту фізики і хімії СевДТУ, Севастополь, 1992 – 2001рр.; III міжнародному конгресі по теоретичній органічній хімії, Тойохаши, Японія, 1993 р.; Міжнародній науковій конференції, присвяченої 150-річчю народження І. Пулюя, Тернопіль, 1995 р.; 35-м Санибел – симпозіумі, Флорида, США, 1995 р.; Міжнародній конференції по ЯМР-спектроскопії, Манчестер, Великобританія, 1995 р.; Європейській конференції з експериментальної ЯМР - спектроскопії (EENC-1996), Париж, Франція, 1996 р.; 12 біофізичному з'їзді, Амстердам, Голандія, 1996 р.; 13-ій міжнародній конференції з ЯМР спектроскопії, Ексетер, Великобританія, 1997 р.; 14-й європейській конференції по експериментальній ЯМР - спектроскопії (EENC-1998), Блед, Словенія, 1998 р.; II з'їзді Українського біофізичного товариства, Харків, 1998 р.; Міжнародній конференції по фізиці біологічних систем, Київ, 1998 р.; 14-й міжнародній конференції з ЯМР – спектроскопії, Едінбург, 1999 р.; 15-й європейській конференції з експериментальної ЯМР - спектроскопії (EENC-2000), Лейбциг, 2000 р.; 15-й міжнародній школі – семінарі “Спектроскопія молекул і кристалів”, Чернігів, 2001р. Тези перерахованих доповідей опубліковано.

Публікації. Результати дисертації опубліковані в 41 наукових працях, в тому числі у 31 статтях у наукових журналах та у 10 материалах і тезах доповідей національних і міжнародних конференцій, симпозіумів і з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, 5 розділів, висновків і додатків. Повний обсяг дисертації складає 379 с., із яких додатки, оформлені окремою книгою, займають 101с. Дисертація містить 22 таблиці і 73 рисунка, в тому числі на 37 окремих сторінках. Список використаних літературних джерел – 358 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовується актуальність дослідження, викладено його мету і задачі, вказано на новизну отриманих результатів, та на їх наукову і практичну цінність.

В першому розділі, що має оглядовий характер, наведено експериментальні і теоретичні дані про структурні особливості молекул нуклеінових кислот та їх компонентів. Проаналізовано літературні дані про процеси самоасоціації нуклеотидних послідовностей і ароматичних молекул бар-вників та антибіотиків, комплексоутворення ароматичних лігандів з фрагментами молекул нуклеінових кислот, отримані засобами ЯМР – спектроскопії та іншими експериментальними засобами. Обговорено наявні в літературі дані про сиквенс – специфічне інтеркаляційне зв'язування ароматичних лігандів з ДНК. Зроблено висновок про те, що в розчині, що містить фрагменти ДНК і інтеркалятори, має місце динамічна рівновага, включаюча самоасоціацію молекул і утворення різноманітних типів комплексів з дезоксиолігонуклеотидами. Кількісний аналіз процесів комплексоутворення лігандів з олігонуклеотидними послідовностями припускає наявність інформації про параметри самоасоціації різноманітних форм молекул, що досліджуються і про структурні особливості агрегатів у водному розчині. Інтенсивність крос - піків в спекрах 2М - NOESY, зумовлена міжмолекулярними взаємодіями в інтеркальованих комплексах, досить низька. Це пов'язано з досить великою відстанню між протонами ароматичних лігандів і основами олігонуклеотидів, а також з тим, що вміст того або іншого типу комплексу, що знаходиться в рівновазі у змішаному розчині взаємодіючих молекул, відносно малий. При інтерпретації експериментальних даних ЯМР необхідно вирішувати проблему "конформаційної чистоти" в розчині: розробляти розрахункові методики і моделі комплексоутворення, які дозволили б оцінювати відносний вміст різноманітного типу асоціатів в розчині і на цій підставі робити висновки про характер взаємодії і структурні особливості комплексів.

Схематичне подання дослідницкої роботи по темі дисертації (мал. 1) включає:

а) дослідження самоасоціації і комплексоутворення несамокомплементарних дезокситетрануклео-тидів з ароматичними лігандами (мале коло). Послідовності основ тетрануклеотидів d(AAGC), d(GAAG), d(CGAA) входять в якості складових елементів в структуру некомплементарного дезоксигептануклеотида d(GpCpGpApApGpC), що містить паліндромну послідовність у ланцюзі, здатного утворювати шпилькову структуру в водному розчині (велике коло).

б) середнє коло діаграми відбиває дослідження самоасоциації і комплексоутворення самокомплементарних дезоксиолігонуклеотидів різної довжини

Мал. 1. Схематичне подання дисертаційної роботи.

і послідовності основ ланцюга з ароматичними лігандами, що дозволяють отримати інформацію про природу фізико-хімічних взаємодій, відповідальних за сиквенс-специфічне зв'язування лігандів і провести порівняльний аналіз структурних і термодинамічних параметрів комплексоут-ворення лігандів з дезоксиолігонуклеотидами різноманітної вторинної структури. В якості ароматичних лігандів використано типові інтеркалятори: фенантридіновий барвник бромистий етидій (EB), володіючий мутагенною дією, і антрацикліновий антибіотик дауноміцин (DAU) з виразною антипухлинною активністю.

В другому розділі розглянуто фізичні основи ЯМР- спектроскопії, методики отримання

одномірних і двомірних спектрів. Наведено опис двомірної гомоядерної (2М-CОSY, 2М-NOESY, 2М-ТОCSY) і гетероядерної кореляційної спектроскопії (2М - НМВС), що дозволяє отримати інформацію про структурні параметри взаємодіючих молекул у водному розчині – дезоксиолігонуклеотидів і ароматичних лігандів. Показано доцільність використання двомірних методик в даній роботі. Описано умови проведення експериментів і приготування розчинів. Зразки дезоксиолігонук-леотидів d(CpGpCpG), d(GpCpGpC), d(TpGpCpA), d(ApCpGpT), d(ApGpCpT), d(CpGpApA), d(ApApGpC), d(CpTpGpA), d(GpApApG), d(CpGpCpGpCpG), d(CpGpTpApCpG), d(TpApCpGpTpA), d(GpCpGpApApGpC), d(GpApCpApTpGpTpC) синтезовано компанією "Oswel DNA Service" (Великобританія). Використали барвники і антибіотики фірм "Sigma" і "Flukа" (США). Досліджовані речовини розчиняли у D2O з ізотопною чистотою 99.95% і ліофілізували в дейтерирований 0.1 M фосфатний буфер (pD 7.1). Концентрацію молекул визначали спектрофото-метрично за відомими молярними коефіцієнтами екстинції. Одномірні 1Н ЯМР спектри вимірювали на імпульсних спектрометрах з резонансною частотою 500 МГЦ ("JEOL GSX 500", “Bruker DRX 500”), двомірні гомоядерні спектри (2М - СОSY, 2М - NОESY, 2М - TOСSY) - на спектрометрах “Bruker DRX” (500 МГц) і “Bruker AMX” (600 МГц), а гетероядерні 1H – 31P (2М-НМВС) на спектрометрі “Bruker DRX” (500 МГц). При вимірі двомірних спектрів ЯМР зразки заздалегідь дегазували, продуваючи їх азотом. В концентраційних дослідженнях підтримували постійну концентрацію барвника послідовним доданням свіжоприготовленого розчину ліганда певної концентрації в початкову суміш олігонуклеотида і барвника. В процесі вимірів температура зразка стабілізувалась з похибкою ± 1К з допомогою терморегулятора BVT-3000 або "JEOL NM– GVT 3". Протонні хімічні зсуви вимірювались відносно внутрішнього стандарту - ТМА, бо його сигнал практично незалежить від рD і температури у водних розчинах нуклеотидів і після цього перераховували відносно ДСС (2.2-ди-метіл-2-силапентан-5-сульфокислота). Хімічний зсув ядер 31P визначали відносно резонансного сигнала фосфору буферного розчину. Виміри проводилися в стандартних ампулах з зовнішнім діаметром 5 мм, мінімальний об'єм розчину – 0.5 мл.

В третьому розділі подано результати досліджень самоасоціації в водному розчині молекул бар-вників, антибіотиків і дезоксиолігонуклеотидів. Основні характеристики самоасоціації ароматич-них лігандів, отримані на основі кооперативної і некооперативної моделей взаємодій молекул, з використанням експериментальних концентраційних і температурних залежностей протонних хі-мічних зсувів молекул, суттєво залежать від хімічної структури хромофорів і характеру бокових ланцюгів і груп досліджених біологічно активних сполук. Отримані дані (табл.1) показують, що

при утворенні асоціатів молекул профлавіна, хромофор якого не містить бокових груп або ланцю- Таблиця 1

Параметри самоасоціації молекул барвників і антибіотиків у водному розчині (pD 7.1, T=298K)

Барвникі і антибіотикі Некоопера- тивна модель Кооперативна Модель -DG°, кДж/ моль -DH°, кДж/ моль - DS°, Дж/ мольЧK

K, л/моль K, л/моль s

Профлавін 698 ± 68 1050 ±100 0,42 ± 0,06 15,9 ± 0,5 46,0 ± 8,4 101 ± 17

Акридиновий оранжевий 4600 ± 600 6900 ± 460 0,45 ± 0,05 20,8 ± 0,5 38,1 ± 4,6 57,0 ± 8,0

Бромистий етидій 305 ± 20 347 ± 20 0,89 ± 0,06 14,2 ± 0,2 23,4 ± 3,3 31,0 ± 4,6

Иодистий пропидій 63 ± 6 67 ± 6 0,98 ± 0,06 10,3 ± 0,2 26,2 ±5,5 31,0 ± 4,6

Актиноміцин D - 1400 ± 100 1,49 ± 0,10 18,0 ± 0,3 31,8 ± 6,3 46,9 ± 4,6

Дауноміцин 720 ± 130 580 ± 120 1,34 ± 0,6 16,3 ± 0,5 34,0 ± 6,0 60 ± 15

Ногаламіцин 6900 ±1400 5000 ± 1800 1,37 ± ,02 21,9 ± 0,4 22,7 ± 4,0 2,6 ± 0,5

гів, s < 0.5, для бромистого етидію і иодистого пропидію наявність бокових привісків в хромофорах знижує кооперативність (s = 0.89 ± 0.06), в той час як для актиноміцина D, до хромофору якого приєднані масивні пентапептидні кільця, параметр s ” 1.5 і процес самоасоціації носить антикооперативний характер. Параметр кооперативності дауноміцина (s ” 1.34) в межах похибки співпадає з величиною s, розрахованою для ногаламіцина (s ”1.37) в аналогічних експериментальних умовах. Це дозволяє зробити припущення, що ногалозний сахар в молекулі ногаламіцина і аміносахар в дауноміцині, приєднані однаковим чином до агликонового хромофору, створюють стеричні перешкоди при утворенні стопочних асоціатів в розчині. Найменше значення ентальпії по абсолютній величині отримано для реакції самоасоціації ногаламіцина, яке у 1.5 -2 рази менше DH для реакцій самоасоціації дауноміцина, актиноміцина D, акридинового оранжевого і профлавіна. Це пов'язано з суттєво меншим в порівнянні з іншими лігандами перекриттям ароматичних кілець ногаламіцина в агрегаті з-за наявності зв'язування з хромофором антибіотика непланарного біциклічного позитивно зарядженого аміносахара, створюючого стеричні перешкоди для паралельної орієнтації хромофорів при утворенні стопочного асоціата. Що ж стосується зміни ентропії DS, то значення цього параметру розрізняються ще в більшому ступені, ніж DH. Можна припустити, що при самоасоціації

бромистого етидію, акридинового оранжевого, актиноміцина D, дауноміцина, иодистого пропидію і ногаломіцина більш суттєву роль, в порівнянні з профлавіном, грають гідрофобні взаємодії, яки дають позитивний внесок в DS. Це пов'язано з наявністю у хромофорів цих молекул досить масивних гідрофобних атомних груп і бокових ланцюгів, які внаслідок просторової укладки при утворенні дімерних комплексів витісняють молекули розчинника на околиці агрегатів і завдяки цьому, збільшують ентропію самоасоціації молекул.

Параметри самоасоціації дезоксиолігонуклеотидів в водному розчині (табл. 2), розраховані в основному з використанням моделі двох станів “мономір – дуплекс” за експерименальними кон-центраційними і температурними залежностями протонних хімічних зсувів олігонуклеотидів. Ототожнення сигналів в спектрах ЯМР отримано на підставі аналізу двомірних гомоядерних CОSY, NOESY, ТОCSY і двомірних гетероядерних НМВС експериментів. Виявлені групи протонів атомів, що належать окремій основі або дезоксирибозному кільцю, проведено сиквенційне віднесення. По термодинамічній стабільності самокомплементарні дуплекси олігонуклеотидів розташо-вуються таким чином: d(CGCGCG) 2 > d(GACATGTC)2 > d(CGTACG) 2 > d(TACGTA) 2> d(CGCG)2 > d(GCGC)2 > d(TGCA)2 > d(ACGT)2 > d(AGCT)2; для несамокомплементарних дезокситетрануклеотидів стабільність димірних комплексів має вигляд: d(CGAA)2 ” d(AAGC)2 > d(CTGA)2 > d(GAAG)2. Міцність дуплексів залежить від нуклеотидного складу і числа пірімідін - пуринових дільниць в послідовності. Особливе положення по термічній

Таблиця 2

Параметри самоасоціації дезоксиолігонуклеотидів у водному розчині (pD 7.1, T=298K)

Олігомір K, л/моль ниток -DG°, кДж/моль -DH°, кДж/моль -DS°, Дж /моль·K

d(GpCpGpC) 575 ± 60 15,5± 0,2 63 ± 8 160 ± 30

d(CpGpCpG) 650 ± 80 15,8 ± 0,3 87 ± 12 240 ± 40

d(TpGpCpA) 180 ± 30 12,7 ± 0,6 64 ± 11 175 ± 30

d(ApGpCpT) 80 ± 15 10,7 ± 0,3 67 ± 9 192 ± 32

d(ApCpGpT) 80 ± 15 10,7 ± 0,3 67 ± 9 192 ± 32

d(CpGpApA) 23,4 ± 6,8 7,8 ± 0,7 39 ±2 104 ± 6

d(ApApGpC) 23,4 ± 6,8 7,8 ± 0,7 39 ±2 104 ± 6

d(CpTpGpA) 8,2 ± 3,5 5,2 ± 1,2 32 ± 1 90 ± 2

d(GpApApG) 4 ± 0,8 3,4 ± 0,5 18,5 ± 6,1 51 ± 19

d(TACGТА) (4,5±0,8)Ч103 20,8±0,5 163±14 478±42

d(CGTACG) (31 ± 3) Ч103 25,6±0,5 198±14 579±62

d(CGCGCG) (521±73)Ч105 44,0±1,2 248±26 685±93

d(GCGAAGC) (113±13)Ч103 28,8±0,2 169±16 471±53

d(GCGAAGC) (57 ± 5) Ч103 * 27,1±0,2 64 ± 3 * 182 ± 8 *

d(GACATGTG) (415±190)Ч103 33,7±0,6 205 ± 38 580±65

*) параметри утворення шпильки

стабільності серед вивчених дезоксиолігонуклеотидів займає дезоксигептануклеотид d(GCGAAGC), що містить паліндромну послідовність в ланцюзі і здатний утворювати шпилькову

структуру у водному розчині. Гептамір d(GCGAAGC) утворює шпильку з короткою GAA - петлею, винятково тривку до дії температури (Тm=78є ? ). При цьому стебло шпильки гептаміра, складається з двох пар основ, приймає конформацію близьку В - формі.

В четвертому розділі викладено результати дослідження взаємодії барвника бромистого етидію з дезоксиолігонуклеотидами d(CpGpCpG), d(GpCpGpC), d(TpGpCpA), d(ApCpGpT), d(ApGpCpT), d(CpGpApA), d(ApApGpC), d(CpTpGpA), d(GpApApG), d(GpCpGpApApGpC), d(GpApCpApTpGpTpC) і методика розрахунку параметрів комплексоутворення цих молекул у водному розчині за експериментальними даними одномірної і двомірної ЯМР - спектроскопії. Аналіз 2M ЯМР - спектрів показав, що молекули барвника здебільшого інтеркалюють в пірімідін – пуринові сайти самокомплементарних олігонуклеотидних дуплексів і несамокомплементарних одноланцюгових фрагментів ДНК. Виявлено типи реакцій, яки адекватно відбивають процеси комплексоутворення барвника з дезоксиолігонуклеотидами різноманітної довжини і вторинної структури.

Для кількісної оцінки взаємодії молекул бромистого етидію з дезоксиолігонуклеотидами використовувались різні схеми утворення молекулярних комплексів, які враховують зв'язування з одні-єю (N) і двома (N2) нитками олігомерів ароматичного ліганда (D) (см. табл. 3). Математичні моделі комплексоутворення молекул засновано на адитивній схемі для спостерігаємих протонних хімічних зсувів в розчині:

де - хімічні зсуви протонів ліганда в мономірі (D1), димірі (D2) і в складі комплексів з олігоміром;,, - мольні частки барвника в мономірі, димірі і в складі комплексів з однією і

двома нитками дезоксиолігонуклеотидів відповідно; n – кількість молекулярних форм. При визначенні параметрів комплексоутворення молекул враховувалися закон збереження маси і закон діючих мас для молекулярних реакцій в розчині. Розрахунок параметрів моделей проводився шляхом мінімізації квадратичного функціонала – нев'язки експериментальних ( концентраційні і температурні залежності протонн их хімічних зсувівь ЕВ) і розрахункових залежностей хімічних зсувів протонів ліганда. Мольні частки барвника розраховувались за законом діючих мас, з урахуванням рівнянь матеріального балансу для ЕВ і дезоксиолігонуклеотидів. Розрахункові значення констант утворення комплексів ЕВ з олігомірами ДНК, дозволяючими зробити висновок

про селективність зв'язування барвника з різними сайтами нуклеотидних послідовностей наведено

в табл. 3. Термодинамічні параметри визначено шляхом встановлення температурних залежностей мольних часток комплексів (рівноважних констант реакцій) виходячи з експериментальних температурних залежностей протонних хімічних зсувів досліджуємих молекул. Використали регресійні рівняння у формі многочленів другого і третього порядків для апроксімації експериментальних залежностей. Термодинамичні параметри DH, DS і DG комплексоутворення

Таблиця 3

Термодинамічні параметри K (л/моль), DG, DH (кДж/моль) і D S (Дж/(мольKЧ)) комплексо-утворення ЕВ з олігонуклеотидами при 298 K

Комплекс K,103 -DG0 -DH0 -DS0

5'-d(GpCpGpC) + ЕВ

D1+N1 “ D1N1 9,5 ± 3,7 25.9 ± ,4 100 ± 5 250 ± 18

D1+D1N1“ D2N1 1,3 ± 0,5 19.7 ± 1,9 60 ± 13 136 ± 42

D1+N2“ D1N2 96 ± 18 31,1 ± 1,3 83 ± 15 174 ± 49

D1+D1N2“D2N2 0,46 ± 0,24 18,1 ± 1,7 90 ± 30 243 ± 93

5'-d(СpGpCpG) + ЕВ

D1+N1“ D1N1 21,9 ± 5,8 28,1 ± 1,1 104 ± 4 254 ± 19

D1+D1N1“ D2N1 9,9 ± 1,7 25,2 ± 2,1 71 ± 6 154 ± 18

D1+N2“D1N2 63,1 ± 12,7 29,9 ± 1,9 78 ± 5 160 ± 15

D1+D1N2“D2N2 87 ± 12 31,6 ± 0,9 107 ± 3 253 ± 13

5'-d(ApGpCpT) + EВ

D1+N1“D1N1 4,4 ± 1,5 21,4 ± 1,1 108 ± 5 280 ± 20

D1+D1N1“D2N1 2,5 ± 0,7 20,0 ± 2,0 114 ± 23 306 ± 61

D1+N2“D1N2 8,8 ± 1,5 23,2 ± 2,1 82 ± 16 190 ± 38

5'-d(ApCpGpT) + EВ

D1+N1“D1N1 14,3 ± 3,3 23,0 ± 1,2 95 ± 5 234 ± 16

D1+D1N1 “D2N1 1,7 ± 0,6 19,0 ± 1,7 86 ± 8 216 ± 41

D1+N2 “D1N2 51,1 ± 6,7 23,9 ± 2,2 67 ± 13 140 ± 40

D1+D1N2 “D2N2 2,3 ± 0,8 19,8 ± 2,0 124 ± 21 339 ± 68

5'-d(TpGpCpA) + EВ

D1+N1 “D1N1 27 ± 6 23,7 ± 0,5 127 ± 7 321 ± 18

D1+D1N1 “D2N1 19 ± 4 21,0 ± 0,7 114 ± 16 304 ± 41

D1+N2 “D1N2 72 ± 9 26,9 ± 0,2 80 ± 63 176 ± 27

D1+D1N2 “D2N2 141 ± 25 28,0 ± 0,4 111 ± 11 271 ± 29

5'-d(CpGpApA) + EВ

D1+N1 “D1N1 20,0 ± 1,9 24,3 ± 0,4 86 ± 4 207 ± 13

D1+D1N1 “D2N1 11,3 ± 2,1 22,7 ± 0,8 63 ± 6 136 ± 20

N1+D1N1 “D1N2 6,6 ± 1,8 21,5 ± 0,9 69 ± 9 158 ± 33

5'-d(ApApGpC) + EВ

D1+N1 “D1N1 17,6 ± 3,2 23,8 ± 0,7 80 ± 3 189 ± 10

D1+D1N1 “D2N1 7 ± 1 21,7 ± 0,3 60 ± 17 129 ± 56

N1+D1N1 “D1N2 6,0 ± 0,8 21,2 ± 0,7 63 ± 20 139 ± 66

Продовження табл. 3

5'-d(CpТpGpА) + EВ

D1+N1“D1N1 17,0 ± 1,5 24.1± 0.2 99 ± 10 253 ± 33

D1+D1N1“D2N1 3,3± 1,7 20.4±1.1 70 ± 12 167 ± 37

N1+D1N1“D1N2 2,9 ± 1,4 19.4 ± 2.1 66 ± 5 155 ± 26

5'-d(GpApApG) + EВ

D1+N1“D1N1 2,0 ± 0,5 18.7 ± 0.9 45 ± 9 105 ± 30

D1+D1N1“D2N1 3,3± 1,7 18.3 ± 0.8 47 ± 13 95 ± 27

N1+D1N1“D1N2 2,9 ± 1,4 17 ± 1 34 ± 8 56 ± 14

5'-d(GpApCpApTpGpTpC) + EВ

D1+N1“D1N1 11.7 ± 1.7 23.2 ± 0.3 61± 8 125 ± 24

D1+NL“D1NL 3.9 ± 1.4 20.5 ± 0.7 48 ± 7 93 ± 22

D1+N2“D1N2 17.7 ± 1.9 24.2 ± 0.3 70 ± 4 152 ± 13

D1+D1N2“D2N2 0.51± 0.16 15.4 ± 0,7 38 ±10 75 ± 34

5'-d(GpApCpApTpGpTpC) + EВ

D1+N2“ D1N2 718 ± 65 33.4 ± 3.3 48 ± 3 49 ± 8

D1+D1N2“D2N2 315 ± 41 31.4 ± 4.1 76 ±4 149 ± 26

D1+D2N2“D3N2 47 ± 7 26.6 ± 4.0 100 ± 4 245 ± 43

D1+D3N2“D4N2 18 ± 4 24.3 ± 5.4 86 ± 4 208 ± 51

молекул (табл. 3) визначено з використанням формалізму Вант - Гоффа. Аналіз показує, що вміст в розчині різноманітних типів комплексів “дезоксиолігонуклеотид - барвник” залежить від температури розчину, співвідношення вхідних концентрацій взаємодіючих молекул, послідовності основ і довжини ланцюга дезоксиолігонуклеотидів.

Аналіз динамічної рівноваги різних типів комплексів в розчині дозволяє встановити внесок

кожного комплексу в експериментальний хімічний зсув і визначити в них значення граничних хімічних зсувів протонів, дозволяючих з'ясувати структурні особливості утворюємих молекулярних асоціатів. Значення термодинамичних параметрів комплексоутворення EB з вивченими дезоксиолігонуклеотидами (табл. 3, мал. 2) свідчать, що всі реакції комплексоутворення ЕВ з дезоксиолігонуклеотидами є екзотермічними, але абсолютні значення ентальпій цих реакцій суттєво розрізняються. Утворення 1: 2 комплексів барвника з дуплексами дезокситетрануклеотидів характеризується близькими значеннями DH і DS, при цьому при зв'язуванні бромистого етидію з одноланцюговими тетрануклеотидами величини DH і D S значно більші за абсолютною величиною (на малюнку 2 трикутники (5) і квадрати (¦)). Для 1: 1 комплексів барвника з одинокою формою тетрануклеотидів розрахункові параметри DH і D S мають близькі значення як для само-, так і несамокомплементарних дезокситетрануклеотидів, виняток складає лише послідовність d(GAAG), яка містить тільки пуринові основи в ланцюзі

Мал. 2. Термодинамічні параметри DН і DS досліджених комплексів бромистого етидію з дезо-ксиолігонуклеотидами у водному розчині. ( u - EB + ДНК тимуса теля (W. David Wilson, etc. Biopolymers. -1990. -V. 29. - P. 449 - 459)).

(самий нижній квадрат (¦)). При утворенні 2 : 2 комплексів барвника з самокомплементарними дезокситетранук-леотидами абсолютні значення ентальпії і ентропії вищі, ніж DH і DS при зв'язуванні однієї молекули барвника з тетрануклеотид-ними дуплексами. В 2: 2 комплексах, імовірно, деякий вклад в негативне значення DS вноситься збільшенням жорсткості дуплекса внаслідок інтеркаляції молекул барвника, що призводить до зменшення ентропії внаслідок обмеження числа можливих конформаційних станів молекул. Спостерігаємі відмінності в значеннях термординамічних параметрів комплексоутворення ЕВ з дезоксиолігонуклеотидними дуплексами можуть бути зумовлені внеском від декількох факторів вклю-чаючи: молекулярні взаємодії (водневі зв'язки, гідрофобні, Ван- дер - Ваальсові і электростатичні взаємодії); конформаційні зміни в олігонуклеотидах; вивільнення протиіонів або протонів і зміни гідратаціі при зв'язуванні молекул. Позитивний ентропійний внесок визначається гідрофобними взаємодіями, зумовленими переносом молекул барвника з розчинника в інтеркаляційний сайт. Значний внесок від гидрофобних взаємодій має місце для 1:2 комплексів ЕВ з дезоксиолігонук-леотидними дуплексами, які характеризуються меншими абсолютними значеннями ентропії у порівнянні з реакціями утворення інших типів молекулярних комплексів в розчині (мал. 2).

Цікаво відзначити, що величина DH для 1: 2 комплексу з дуплексом гептаміра, "що містить балжи" приймає проміжне значення (верхній плюс (:)) між самокомплементарними тетрануклеотідами і дезоксиоктануклеотидом (чорно-білі трикутники і нижнє коло (n)). Що стосується комплексів ЕВ зі стеблом шпильки, то DH (другий знизу плюс (:)) декілька менша, ніж при зв'язуван-ні барвника з самокомплементарним дезокситетрануклеотидом, а з петлею шпильки -DH (нижній плюс (:)) порівняна з ентальпією комплексоутворення ЕВ з одноланцюговою послідовністю d(GAAG) (нижній чорно - білий квадрат). Особливе місце займає дезоксиоктануклеотид, де 1:2 комплекс відповідає найменшому значенню DS, яке зростає по абсолютній величині із збіль-шенням числа інтеркальованих молекул в дуплекс октаміру (кола (n)). Останнє, певно, пов'язане із збільшенням жорсткості і, відповідно, обмеженням можливих конформаційних станів молекул по мірі збільшення числа інтеркальованих лігандів. Слідує підкреслити, що кожний з знайдених термодинамічних параметрів є величина, що враховує різноманітні вигляди взаємодій при утворенні комплексів. Ентальпію реакції комплексоутворення барвника з двоспіральною ДНК можна уявити в вигляді суми, принаймі, шести факторів(DНi): розсуву знаходящихся в стані вертикальної стэкинг-взаємодії пар основ в дуплексі з утворенням порожнини для вбудови молекули (DН1); стекинг – взаємодії азотистих основ з хромофором барвника в місці інтеркаляції (DН2); электричні взаємодії між катіонами ліганда і негативним зарядом фосфатних груп нуклеотиів (DН3); зміна сольватної оболонки при утворенні комплексу (DН4); зміна конфігурації ліганда при зв'язуванні з ДНК (DН5); специфічні водневі зв'язки, що може утворювати барвник в комплексі (DН6). Негативний ентальпійний вклад звичайно вносять складові DН2, DН3 і DН6, а позитивний - DН1, DН4 і DН5. При оцінці величини DН можуть бути враховані також додаткові складові, зокрема, у тому випадку, якщо інтеркалятор викликає значні конформаційні зміни в ДНК.

В п'ятому розділі викладено основні результати дослідження комплексоутворення дауноміци-на з самокомплементарними фрагментами ДНК (d(CGCG), d(GCGC), d(TGCA), d(ACGT), d(AGCT), d(CGTACG), d(CGCGCG), d(TACGTA)) і з несамокомплементарним дезоксигеп-тануклеотидом d(GCGAACG)). Дауноміцин – антибіотик антрациклинової групи, використо-вується в клінічній практиці для хіміотерапії ракових захворювань. Хромофор придає його структурі схожість з молекулами ароматичних барвників. Медикобіологічну дію дауноміцину зв'язують з впливом на ядро клітини і його інтеркаляцією в ДНК. Аналіз гомоядерних і гетероядерних спектрів ЯМР розчинів DAU з дослідженими самокомплементарними дезоксиолігонуклеотидами показав, що місцем переважного зв'язування антибіотика з олігомірами є термінальний сайт олігонуклеотидних дуплексів.

Порівняння розрахованих рівноважних констант утворення різноманітних типів комплексів DAU з дослідженими дезокситетрануклеотидами показує (табл. 4), що якісно вони співвідносяться один з іншим приблизно однаковим чином. Разом з тим, значення констант для реакцій комплек-соутворення ЕВ з аналогічними тетрануклеотидами в ідентичних експериментальних умовах сут-тєво відрізняються як в якісному, так і в кількісному відношенні (см. табл. 3). Імовірність утворення комплексу 1: 2 DAU з будь - якою з розглянутих послідовностей суттєво вище, ніж інших комплексів у водному розчині. При цьому K2 приблизно на порядок перевищує відповідні значення констант для реакцій утворення подібного типу комплексів між вивченими тетрануклеотидами і бромистим етидієм. З таблиці 4 видно, що значення рівноважної константи K4, яка характеризує імовірність утворення в розчині комплексу 2:2 DAU з будь - яким з розглянутих дезокситетрануклеотидів, незалежно від числа пірімідін-пуринових або пурин-пірімідінових сайтів в послідовності, досить низькі, тобто зв'язування другої молекули антибіотика з дуплексом тетрамірів має явно антикооперативний характер. Цей факт, з урахуванням даних 2М - NOESY і результатів дослідження комплексоутворення ароматичних барвників профлавіну і бромістого етидію з аналогічними дезокситетрануклеотидами в ідентичних експериментальних умовах, однозначно свідчить, що місцями переважної посадки антибіотика DAU є як мінімум триплетні нуклеотидні послідовності. При цьому порівняльний аналіз равноважних констант K2 дозволяє зробити висновок, що три послідовні GC-пари основ в ланцюгах двоспиральних тетрамірів d(GCGC) 2 і d(CGCG)2 є більш прийнятними місцями

Таблиця 4

Рівноважні константи утворення різноманітних типів комплексів молекул дауноміцина з дезоксиолігонуклеотидами у водному розчині (pD 7.1, T= 303K)

DAU + ОЛІИГОМІР РЕАКЦІЇ КОМПЛЕКСОУТВОРЕННЯ І ЇХ КОНСТАНТИ

D1+N1 “D1N1 D1+N2 “D1N2 D1+D1N1 “D2N1 D1+D1N2 “D2N2

K1,103 л/моль K2,103л/моль K3,103 л/моль K4,103 л/моль

DAU + 5ў-d(CpGpCpG) 35 ± 10 580 ±160 5,9 ± 2,5 35 ± 12

DAU + 5ў-d(GpCpGpC) 31 ± 9 520 ±100 7,4 ± 2,3 11,0 ± 1,7

DAU + 5ў-d(TpGpCpA) 31 ± 8 430 ±100 5,4 ± 0,4 12,5 ± 0,5

DAU + 5ў-d(ApCpGpT) 37 ± 12 441 ± 106 1,8 ± 0,7 22,6 ±