АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

Інститут фармакології та токсикології

Чекаліна Наталія Ігорівна

УДК 615.36: 616.13/.16-092

Ангіопротекторні властивості

пептидної фракції аорти

при експериментальному атеросклеротичному та аутоімунному ураженні судин

14.03.05 – фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

К И Ї В — 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Українській медичній стоматологічній академії МОЗ України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Катрушов

Олександр Васильович, завідувач кафедри загальної гігієни та екології Української медичної стоматологічної академії МОЗ України

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Французова

Стелла Борисівна, Національний медичний університет імені акад. О.О. Богомольця МОЗ України, головний науковий співробітник лабораторії патофізіології та експериментальної фармакології Науково-дослідного лабораторного Центру

доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Зупанець Ігор Альбертович, Національна фармакологічна академія України, завідувач кафедри клінічної фармації

Провідна установа: Харківський державний медичний університет МОЗ України, кафедра фармакології.

Захист відбудеться "_20_"__листопада_________ 2002 року о 15-00_ годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України, за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14

Автореферат розісланий __20 серпня______ 2002 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

Д 26.550.01,

кандидат біологічних наук І.В. Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією з найактуальніших проблем сучасної медицини є серцево-судинна патологія, смертність від якої на Україні найбільш висока і складає 59 % в структурі загальної смертності населення. Притаманні сьогоденню стрес, гіподинамія, рафінізоване харчування, погіршення екологічної ситуації та соціального добробуту, поява великої кількості природних та синтетичних алергенів є неодмінними факторами розвитку склеротичних та аутоімунних уражень судин (M.J. Davies, 1992; B.F. Haynes, 1992; І.К. Кондаков, 1998; О.М. Клімов, Н.Г. Нікульчева, 1999).

Атеросклероз (АС) є головною причиною серцевих і мозкових судинних катастроф, облітеруючих захворювань кінцівок. Компонентом багатьох патологічних станів є васкуліт, оскільки процес ушкодження судинних структур, і особливо ендотелію, відбувається при різних впливах і часто набуває імунно-запального характеру (D. D'Cruz, G. Hughes, 1996).

Варто зауважити, що у клінічній практиці утруднене виявлення різних варіантів склеротичного ураження судин. Це пов'язано зі складністю прижиттєвого дослідження стану судинної стінки (Д.Д. Зербіно, 1993). Збільшення арсеналу ангіопротекторних лікарських засобів не призводить до суттєвого поліпшення ситуації щодо захворюваності на судинну патологію (І.М. Ганджа, М.В. Бобрик, 1991; Р.П. Піскун з співавт., 1997; Е.Н. Рябоконь, 2001). Саме тому для сучасної медицини актуальним є пошук нових ефективних шляхів та засобів лікування цієї поширеної групи захворювань.

Поява препаратів пептидної природи зумовила нові перспективні напрямки у клінічній терапії багатьох захворювань (В.Г. Морозов, В.Х. Хавінсон, 1983). Особливу увагу привертають пептидні біорегулятори – цитомедіни, що містяться у різних тканинах організму й беруть участь у міжклітинній взаємодії (Н.Н. Цыбиков, А.В. Степанов, 1992; О.А. Гомазков, 1996). Застосування екзогенних цитомедінів в умовах порушення клітинного гомеостазу, що неодмінно супроводжує більшість захворювань, дозволяє відновлювати функціональну активність відповідних фізіологічних систем та органів (О.В. Катрушов, 1995; І.П Кайдашев, 2000).

На даний час у клінічній практиці застосовуються деякі цитомедіни та синтетичні аналоги регуляторних пептидів (І.П. Кайдашев, 1995; В.Г. Морозов, В.Х. Хавінсон, 2001). Проте не існує специфічного пептидного лікарського засобу, що міг би ефективно відновлювати структурно-функціональні порушення судинної стінки в умовах судинної патології.

Тому ці аспекти потребують розробки та докладного вивчення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом науково-дослідної роботи МОЗ України – "Створення лікарських біопрепаратів — вермілат, панкреолат, нефролат (тваринного походження) та організація їх промислового виробництва", номер державної реєстрації – КФ-40103 № ДР 0199U001591 (1993-2001 рр.).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала у експериментальному обгрунтуванні доцільності використання в якості ангіопротектору цитомедіну з судинної стінки великої рогатої худоби — пептидної фракції аорти в умовах атероартеріосклерозу та аутоімунного васкуліту.

Для досягнення поставленої мети вирішувалися наступні задачі:

1. Дослідити фізико-хімічні властивості отриманої пептидної фракції аорти (ПФА).

2. Вивчити вплив ПФА на стан перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) та антиоксидантної (АО) системи організму, гемокоагуляцію, коефіцієнти маси (Кm) органів та морфофункціональний стан стінки аорти в умовах експериментального перекисного атероартеріосклерозу та порівняти його з дією Т-активіну.

3. Дослідити вплив ПФА на стан ПОЛ та АО системи організму, ліпідний спектр крові, гемокоагуляцію, Кm органів та морфофункціональний стан стінки аорти на моделі холестеринового атероартеріосклерозу (ААС) у порівнянні з дією даларгіну.

4. Вивчити вплив ПФА на стан ПОЛ та АО системи організму, імунологічні показники, ліпідний спектр крові, гемокоагуляцію, Кm органів та морфофункціональний стан стінки аорти в умовах моделювання аутоімунного васкуліту та порівняти його з дією тималіну.

Об'єкт дослідження. Ефективність експериментальної біорегуляторної терапії судинної патології.

Предмет дослідження. Фізико-хімічні властивості пептидної фракції аорти та її ангіопротекторні властивості в умовах експериментальної судинної патології.

Методи дослідження. В роботі використані: фармакологічні, гістологічні та гістохімічні, біохімічні, коагулологічні, гематологічні, імунологічні та статистичні методи досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Виявлено виражені ангіопротекторні властивості нового цитомедіну, отриманого за оригінальною методикою зі стінки аорти великої рогатої худоби — пептидної фракції аорти — при різних видах експериментального ураження судин. Доведено патогенетичну значимість порушення пептидної регуляції в умовах судинної патології та ефективність застосування екзогенних цитомедінів з метою корекції структурно-метаболічного стану уражених судин.

Практичне значення одержаних результатів.

Доведено високу специфічну фармакологічну активність нового цитомедіну з судинної стінки –– пептидної фракції аорти, що проявляється у відновленні еластичних структур та зменшенні ліпідної інфільтрації стінки аорти. Обгрунтовано доцільність подальшого вивчення пептидної фракції аорти з метою створення перспективного ангіопротекторного засобу, що зумовлено її позитивним впливом на морфо-функціональний стан стінки аорти в умовах різних видів експериментальної судинної патології.

Результати проведених досліджень впроваджено у науковий та учбовий процеси кафедри клінічної та експериментальної фармакології Української медичної стоматологічної академії, кафедри фармакології з медичною рецептурою Харківського Державного медичного університету, кафедри фармакотерапії Національної фармацевтичної академії України, кафедр фармакології Вінницького державного медичного університету ім. М.І. Пірогова, Луганського державного медичного університету, Дніпропетровського державного медичного університету та Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського.

Особистий внесок здобувача. Роботу виконано на кафедрі експериментальної і клінічної фармакології, імунології та алергології, на базі ЦНДЛ Української медичної стоматологічної академії, в умовах ЦНДЛ Харківського державного медичного університету та лабораторії фізико-хімічних процесів Державного науково-дослідного центру лікарських засобів за темою науково-дослідної роботи МОЗ України – "Створення лікарських біопрепаратів — вермілат, панкреолат, нефролат (тваринного походження) та організація їх промислового виробництва", номер державної реєстрації – КФ-40103 № ДР 0199U001591 (1993 – 2001 рр.). Автором особисто проведено патентний пошук, результати якого свідчать про відсутність аналогів наукових розробок, визначено мету та задачі дослідження, вибрано методики відтворення експериментальної судинної патології. Отримано ПФА при консультації д.мед.н., проф. І.П. Кайдашева, хроматографію ПФА проведено з консультативно-методичною допомогою к.фарм.н. А.В. Шовкового, вивчення морфо-функціонального стану стінки аорти в експериментах проведено при консультації д.мед.н, проф. Г.І. Губіної-Вакулік, за що автор висловлює їм глибоку подяку. Автором самостійно організовано та проведено експериментальні досліди, обробку та аналіз одержаних результатів, вивчення ангіопротекторних властивостей ПФА, обґрунтування висновків, практичних рекомендацій та впровадження результатів власних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися на звітних наукових конференціях Української медичної стоматологічної академії (1998-2001 рр.), на міжкафедральних наукових конференціях співробітників кафедр загальної гігієни, фармакології і медичної рецептури, нормальної фізіології та центральної науково-дослідної лабораторії Української медичної стоматологічної академії (2000-2001 рр.), на VI Конгресі кардіологів України (м. Київ, 18-21 вересня 2000 р.), на Республіканській науково-практичній конференції молодих вчених “Досягнення та перспективи розвитку терапії в канун ХХІ століття” (м. Харків, 5 жовтня 2000 року), на ІІІ Республіканській конференції “Нове у клінічній фармакології та фармакотерапії захворювань внутрішніх органів” (м. Харків, 16-17 листопада 2000 року), на ІІ Республіканській науково-практичній конференції “Досягнення, проблеми та перспективи наукових досліджень в області кардіології та пульмонології на рубежі ХХ-ХХІ століть” (м. Вінниця, 10-11 жовтня 2000 року), на XV науково-практичній конференції “Ліки – людині” (м. Харків, НФАУ, 14 червня 2001 року), на ІІ Національному з'їзді фармакологів України (м. Дніпропетровськ, 1-4 жовтня 2001 року), на науково-практичній конференції “Сучасні проблеми фармацевтичної науки і практики” (м. Харків, НФАУ, 18 жовтня 2001 року).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 20 друкованих наукових робіт, серед яких 7 статей у фахових виданнях, ліцензованих ВАК України, 12 тезів у матеріалах конгресів, з'їздів, конференцій, 1 патент на винахід (Патент 45251 А України від 15.03.2002).

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 162 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, 4 розділів власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків, списку використаних літературних джерел. Робота ілюстрована 18 таблицями і 42 рисунками, серед яких 28 мікрофотогафій. Бібліографія містить 225 джерел, з яких 51 іноземні.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Пептидна фракція аорти (ПФА), яка була виділена з аорт сільськогосподарських тварин, є речовиною, що містить комплекс водорозчинних поліпептидів з молекулярною вагою до 10 кДа. Нами був розроблений метод одержання ПФА, який включав у себе екстракцію пептидів з аорт великої рогатої худоби за допомогою 3 % розчину оцтової кислоти з додаванням іонів магнію та цинку, які покращують преципітацію пептидів (Патент 45251 А України від 15.03.2002). Застосування молекулярних фільтрів з порами 10 нм дозволило позбавити екстракт великих пептидних молекул. Тому ПФА, незважаючи на джерело отримання, не може бути носієм прионів, молекулярна маса яких 32-36 кДа (М.Д. Тер-Аванесян з співавт., 1999), і, таким чином, не здатна викликати латентні енцефаліти.

Для ідентифікації отриманої пептидної фракції аорти було проведено хроматографію на приладі “Міліхром 4 ВУФ” у режимі градієнтного елювання, а також визначено спектри поглинання, оптичну густину, розчинність та рН розчину, вміст пептидних речовин, цукру, концентрації важких металів за допомогою загальновизнаних методик, що наведені в “Государственной фармакопее ХІ, выпуск І”, (1988 р.)

Дослідження ангіопротекторних властивостей ПФА здійснено на моделях судинної патології, відтвореної на лабораторних тваринах (108 золотистих сірійських хом'яків та 51 білий щур лінії Wistar), які утримувалися у віварії у звичайних умовах та на стандартному раціоні. Препаратами порівняння були поліпептидні препарати (тималін, Т-активін, даларгін), які, за даними сучасних наукових джерел, мали позитивний вплив при атеросклеротичному та аутоімунному ураженні судин в експерименті та клініці. Проведено три серії експериментальних досліджень. Схема дослідів представлена у табл.1. Через добу після останньої ін'єкції ПФА та вищезазначених препаратів під ефірним наркозом у тварин забирали кров з правого передсердя,

вилучали аорту, печінку, нирки й серце.

Таблиця 1

Схема дослідів

Групи тварин К-сть тварин Моделювання патології Речовина, що вводилася Доза щоденного в/м введення Термін введення

І серія дослідів: Вплив ПФА в умовах перекисного ААС

Інтактна 15 — — — —

Контрольна 15 Перебування на безантиоксидантному раціоні 60 днів (О.Н. Воскресенский с соавт., 1972) З 50-ї доби відтворення ААС

Фізіологічний розчин 1 мл/кг 10 днів

Дослідна І 15 ПФА 0,12 мг/кг 10 днів

Дослідна ІІ 15 Т-активін 0,25 мкг/кг 10 днів

ІІ серія дослідів: Вплив ПФА в умовах холестеринового ААС

Інтактна 12 — — — —

Контрольна 12 Додавання до раціону холестерину 0,2 г/кг на добу 60 днів (Н.Н. Аничков, 1965) З 50-ї доби відтворення ААС

Фізіологічний розчин 1 мл/кг 10 днів

Дослідна І 12 ПФА 0,2 мг/кг 10 днів

Дослідна ІІ 12 Даларгін 0,08 мг/кг 10 днів

ІІІ серія дослідів: Вплив ПФА в умовах аутоімунного васкуліту

Інтактна 15 — — — —

Контрольна 12 Антиген аорти + повний ад'ювант Фрейнда (1:1), по 0,5 мл підшкірно, тричі через 7 днів (Kent A. et al, 1976) З 5-го дня після 3-ї ін'єкції АГ

Фізіологічний розчин 1 мл/кг 10 днів

Дослідна І 12 ПФА 0,2 мг/кг 10 днів

Дослідна ІІ 12 Тималін 0,15 мг/кг 10 днів

Стан ліпідного обміну визначали за вмістом атерогенних ліпопротеїдів (ЛП), загальних ліпідів та холестерину (ХС) в сироватці крові, стан процесів гемокоагуляції — за тромбіновим, протромбіновим часом, часом рекальцифікації та швидкістю фібринолізу. У периферичній крові, печінці та нирках досліджували стан перекисних процесів шляхом визначення перекисної резистентності еритроцитів (ПРЕ), вмісту дієнових кон'югатів (ДК), накопичення малонового діальдегіду (МДА) та стан АО захисту за показниками активності АО ферментів – каталази, супероксиддисмутази (СОД) та вмістом церулоплазміну (ЦП) у сироватці крові. Визначали Кm печінки, серця і нирок шляхом зважування на електронних вагах та математичного розрахунку. Стан імунних механізмів захисту визначали за фагоцитарною активністю нейтрофілів та реакцією бласттрансформації лімфоцитів селезінки. Підраховували кількість лейкоцитів у периферичній крові та лейкоцитарну формулу. Структурно-метаболічний стан стінки аорти оцінювали за характеристикою волокнистих структур (забарвлення за ван Гізоном та Хартом), інтими, клітинних елементів медії (забарвлення гематоксилін-еозином), основної речовини (забарвлення ШИК+Хейл) та за наявністю холестерину у інтимі та медії (забарвлення спиртовим розчином судану ІІІ, ІV, спирт-формаліновим розчином судану ІІІ за Г.Г. Непряхіним та шляхом мікроскопії у поляризованому світлі). Вивчалися зрізи з парафінових, желатинових блоків та заморожених препаратів аорти, а також інтима розрізаних вздовж та розправлених аорт дослідних тварин.

Використані в роботі методи досліджень наведені у табл. 2.

Таблиця 2

Методи досліджень

№ Показники, що вивчалися Біологічний матеріал Автори методик

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Морфофункціональний стан стінки аорти за даними гістологічних та гістохімічних методів дослідження Холестерин Загальні ліпіди Ліпопротеїди низької та дуже низької щільності ТБК-реагуючі продукти (МДА) Дієнові кон'югати Перекисна резистентність еритроцитів Супероксиддисмутаза Каталаза Церулоплазмін Час рекальцифікації Тромбіновий час Протромбіновий час Фібрінолітична активність плазми Фагоцитарна активність нейтрофілів Реакція бласттрансформації Лейкоцити (кількість) Лейкоцитарна формула Визначення коефіцієнту маси органу фрагменти стінки та зрізи грудної аорти сироватка крові сироватка крові сироватка крові сироватка крові, печінка, нирки сироватка крові еритроцити сироватка крові, печінка, нирки сироватка крові, печінка, нирки сироватка крові плазма крові плазма крові плазма крові плазма крові кров лімфоцити кров кров печінка, нирки, серце Мостофи Ф.К., Смит Д.Е., (1972) Меркулов Г.А., (1969) Непряхин Г.Г.,(1979) Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., (1996) Ilca S., (1962) Колб В.Г., Камышников В.С., (1982) Меньшиков Ю.В., (1985) Владимиров Б.А., Арчаков А.И., (1972) Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И., (1993) Спиричев В.В., Матусис И.И., (1979) Брусов О.С. и др., (1976) Архипова А.Г., (1988) Колб В.Г., Калашников В.С., (1976) Bergerhof H.D., Roka L., (1954) Biggs R.M., Macfarlane R.G., (1962) Балуда В.П., Баркаган З.С., (1985) Андреенко Г.В. и др., (1987) Лебедев К.А., Понякина И.Д., (1990) Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С., 1978) Меньшиков Ю.В., (1985) Меньшиков Ю.В., (1985) Непряхин Г.Г., (1979) Трахтенберг И.М., (1969)

Математичні результати досліджень оброблені статистично за допомогою критерію Стьюдента та Уайта на персональному комп'ютері з використанням пакету програм MS Office 97 фірми MICROSOFT.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для досягнення мети та вирішення задач дослідження нами було проведено вивчення фізико-хімічних властивостей отриманої ПФА.

ПФА являла собою водорозчинні поліпептиди з молекулярною масою, меншою за 10 кДа, з максимумом спектру поглинання в ультрафіолетовій ділянці 200-220 нм, що вказувало на наявність пептидних зв'язків, та мала характерну хроматографічну криву з 8 основними піками (рис.1).

Порівняння хроматографічних характеристик ПФА та інших пептидних речовин, досліджених за однакових умов, дозволило виявити певну схожість третього основного піку ПФА з даларгіном, що надало змогу припустити наявність можливих спільних рис у фармакологічній активності цих пептидів.

Рис. 1. Хроматограма розчину пептидної фракції аорти.

Визначення фармакологічної активності ПФА на моделях судинної патології, згідно меті та поставленим задачам, було спрямоване на пошук її ангіопротекторних властивостей. При експериментальному перекисному ААС оцінка ефективності ПФА проводилася у порівнянні з Т-активіном, оскільки при ААС спостерігається значне пригнічення активності Т-лімфоцитів-супресорів, і це є умовами для розвитку аутоімунної агресії та прогресування патології, а також враховуючи роль пептидів тимусу в регуляторному каскадному континуумі (Л.А. Громов, 1992; Sernery G., 1997).

Під впливом ПФА (у дозі 0,12 мг/кг) у дослідних тварин спостерігалося покращення загального стану. У крові відмічалося зменшення перекисних зрушень, що відбулися в умовах моделювання ААС: знизився приріст МДА на 16,8 %, активність АО ферментів залишалася зменшеною, як зазначено у табл. 3. Проте у тканинах печінки та нирок відмічалося збільшення приросту МДА на 68,9% та на 55% відповідно. Це супроводжувалося зростанням активності СОД на 200% у печінці та на 45% у нирках. Активність каталази зросла у печінці приблизно удвічі.

За нашими уявленнями, вплив ПФА на стан пероксидації у тканинах органів може бути проявом координуючого впливу цієї речовини на процеси, що забезпечують структурний та функціональний гомеостаз клітинних популяцій, оскільки напруження антиоксидантно-прооксидантного потенціалу органу, можливо, є компенсаторною реакцією в умовах метаболічного навантаження.

Таблиця 3

Вплив ПФА на показники стану ПОЛ та АО захисту крові

у хом'яків з перекисним атероартеріосклерозом (М+m, n=15)

Показники, що досліджувалися Групи тварин

Інтактна Контрольна Дослідна 1 (ПФА) Дослідна 2 (Т-активін)

МДА, % приросту 28,2 (19,2-32,7) 231,6 (190,0-266,0) 192,7 (149,8-226,6) 107,4 (73,7-128,7)

СОД, ум. од. акт. 0,57+0,04 0,62+0,03 0,60+0,03 0,91+0,04 **

Каталаза, ум. од. 1,30+0,06 1,53+0,06 * 1,61+0,09 1,65+0,06

Церулоплазмін, мг/мл 53,14+4,08 48,05+3,29 49,89+3,42 50,57+3,17

Примітки:

1. * - р<0,01 у порівнянні з інтактною групою.

2. ** - р<0,01 у порівнянні з контролем.

Застосування Т-активіну зумовило зменшення процесів пероксидації у крові (табл. 3), проте у тканинах печінки та нирок приріст МДА збільшився (на 143,9 % та 36,1 % відповідно), хоча підвищилася активність СОД та каталази — у ? 4 рази в тканинах печінки та у ? 2,5 рази у нирках.

Під впливом ПФА у дослідних тварин знизився рівень атерогенних ЛП та ХС у крові, чого не спостерігалося при введенні Т-активіну, як показано у табл. 4. ПФА може містити різні пептидні фракції з різноманітною спрямованістю регуляторної дії. Цим, на нашу думку, може бути зумовлений широкий спектр можливих неспецифічних ефектів ПФА. Одним з них, певно, є її гіполіпідемічна дія.

Під впливом ПФА нівелювалися зрушення у системі гемостазу, які відбулися у тварин з перекисним ААС (табл.4). Ми припускаємо, що це також є проявом неспецифічної дії цієї речовини, й, можливо, результатом покращення стану судинної стінки: відновленням тромбін-зв'язуючої, простациклін-синтетуючої функцій ендотелію (ЕТ), тощо. Застосування Т-активіну також сприяло нормалізації показників гемокоагуляції.

Таблиця 4

Вплив ПФА на ліпідний спектр крові та на деякі показники коагуляційного

гемостазу у хом'яків з перекисним атероартеріосклерозом (М+m, n=15)

Показники, що досліджувалися Групи тварин

Інтактна Контрольна Дослідна 1 (ПФА) Дослідна 2 (Т-актівін)

Холестерин, ммоль/л 2,17+0,15 3,44+0,11* 2,37+0,13 ** 3,32+0,11

Загальні ліпіди, г/л 2,74+0,12 2,64+0,09 2,76+0,18 2,61+0,21

ЛПНЩ та ЛПДНЩ, г/л 1,74+0,09 2,19+0,09 * 1,77+0,04 ** 1,99+0,06

Тромбіновий час, с 56,50+2,17 39,75+1,22 * 50,25+3,32 ** 55,54+2,75 **

Час рекальціфі- кації, с 79,04+3,50 102,87+6,35 * 81,75+4,06** 76,02+4,15 **

Примітки:

1. * - р<0,05 у порівнянні з інтактною групою.

2. ** - р<0,05 у порівнянні з контролем.

Дослідження морфофункціонального стану стінки аорти показали, що позитивні ефекти ПФА реалізувалися переважно у медії: стан еластичних мембран (ЕМ) та гладком'язових клітин (ГМК) відповідав рівню інтактних тварин, що сполучалося зі зменшенням вмісту кислих глікозаміногліканів (ГАГ) у міжмембранних просторах медії та в інтимі. ГМК медії мали світлі ядра, що свідчило про активацію метаболізму у цих клітинах. Проте залишалися вогнища деендотелізації та потовщення субендотеліальної субстанції з присутністю ГМК, хоча ліпідних включень у стінці аорти та колагену у інтимі не визначалося. Під впливом Т-активіну також відмічалися ознаки неоеластогенезу, покращення стану основної речовини, але у меншій мірі, ніж при дії ПФА.

Зазначені зміни можуть свідчити про нормалізацію метаболічних процесів на рівні уражених клітин (переважно ГМК та фібробластів), а також можуть бути наслідком гальмування еластолітичних процесів, зменшення модифікації ЛП та їх надходження до судинної стінки, тощо. Оскільки цитомедінам (ЦМ) притаманна специфічна дія на рівні тканин, з яких вони отримані, є зрозумілим позитивний результат застосування ПФА в умовах відтвореної патології. Молекулярні механізми дії ПФА, на наш погляд, реалізуються за загальним принципом функціонування регуляторних пептидів (І.П. Кайдашев, 2000): ЦМ захоплюються молекулами головного комплексу гістосумісності клітинних мембран і відновлюють синтетичні процеси та саморегуляцію клітинних популяцій відповідних уражених тканин.

Таким чином, узагальнюючи результати застосування ПФА (у дозі 0,12 мг/кг) при перекисному ААС, слід відмітити наявність вираженої протисклеротичної дії цього ЦМ та нормалізуючий вплив на показники ліпідного спектру крові, системи зсідання крові та, певною мірою, на процеси пероксидації й АО захист.

Оцінку ефективності застосування ПФА за умов моделювання холестеринового ААС проводили у порівнянні з даларгіном, оскільки цей пептидний препарат є синтетичним аналогом лей-енкефаліну і його введення у організм передбачає реалізацію відповідних регуляторних механізмів й специфічних та неспецифічних ефектів ЦМ ІІ та ІІІ порядку, а також виходячи з наукових даних про ефективність його застосування при атеросклерозі.

Під впливом ПФА (у дозі 0,2 мг/кг) у крові тварин з холестериновим ААС спостерігалося помірне зниження приросту МДА на 10,8 %, зменшення вмісту ДК на 24,1 %, зниження рівню перекисного гемолізу еритроцитів на 30,8 % та відновлення активності СОД та каталази, що свідчило про зменшення перекисних процесів та підвищення АО захисту крові. Вміст ЦП у сироватці крові наближався до показників інтактної групи. Ці дані відображені на рис. 2.

МДА ДК ПРЕ СОД Церуло- Каталаза

плазмін

Рис. 2. Показники ПОЛ і АО захисту крові при експериментальному холестериновому ААС та під впливом ПФА і даларгіну.

* - вірогідно у порівнянні з контрольною групою

Під впливом ПФА відбулося зниження приросту МДА у печінці (на 79,5 %), що супроводжувалося зменшенням Кm печінки до показників інтактних тварин. Активність СОД у тканинах печінки підвищилася на 14,6 %. Гальмування перекисних процесів у цьому органі є провідним фактором пригнічення ліпопероксидації. Зменшився також приріст МДА у нирках на 79,5 % та підвищилася активність СОД (р<0,01). Слід підкреслити, що за умов холестеринового ААС ПФА виявила більш виражені АО властивості, ніж при перекисному ААС.

Застосування ПФА при холестериновому ААС, на відміну від даларгіну, зумовило нормалізацію усіх показників ліпідного спектру крові, що досліджувалися. Ці дані відображені у табл. 5. Ми припускаємо, що такі ефекти можуть бути результатом відновлення активності мікросомальної 7-?-гідроксилази гепатоцитів, прискорення катаболізму ХС і, як наслідок, нормалізації ліпідного обміну. Під впливом ПФА відмічалося зменшення коагуляційного потенціалу крові (табл. 5).

Таблиця 5

Вплив ПФА на ліпідний спектр крові та деякі показники коагуляційного

гемостазу у хом'яків в умовах моделювання холестеринового ААС (М+m, n=12)

Показники, що досліджувалися Групи тварин

Інтактна Контрольна Дослідна 1 З ПФА Дослідна 2 з даларгіном

Холестерин, ммоль/л 2,60+0,08 4,83+0,16 * 3,33+0,13 ** 4,56+0,15

Загальні ліпіди, г/л 2,68+0,08 5,29+0,22 * 3,60+0,15 ** 5,07+0,28

ЛПНЩ та ЛПДНЩ, г/л 2,61+0,15 6,14+ 0,30 * 4,74+ 0,16 ** 6,67+ 0,17

Тромбіновий час, с 46,0+1,9 31,8+1,4 * 56,4+2,4 ** 37,9+1,2

Час рекальціфікації, с 103,4+2,7 78,3+3,1* 89,6+3,0 ** 123,5+4,5 **

Примітки:

1. * - р<0,05 у порівнянні з інтактною групою.

2. ** - р<0,05 у порівнянні з контролем.

Морфологічно у тварин з холестериновим ААС, які отримували ПФА, виявлено відновлення еластичного каркасу аорти, зменшення ліпідної інфільтрації, колагенізації медії, вакуолізації та ШИК-позитивних властивостей основної речовини. Ми вважаємо, що регуляторний вплив ПФА реалізувався шляхом її тканиноспецифічного впливу на клітинні елементи аорти з наступним відновленням метаболічних процесів у них та активацією регенераторних механізмів. Застосування даларгіну зумовило часткове відновлення ЕМ, зменшення ліпідної інфільтрації. Отримані результати підтверджують роль порушення пептидної регуляції у судинній стінці в умовах ААС.

Таким чином, за умов моделювання холестеринового ААС ПФА (у дозі 0,2 мг/кг) виявила ангіопротекторні властивості, що сполучалися з нормалізуючим впливом на ліпідний спектр та АО захист крові, печінки і нирок.

В контексті поставлених задач ми провели оцінку ефективності застосування ПФА при аутоімунному васкуліті. Препаратом порівняння було обрано тималін, оскільки, по-перше, ця речовина є ЦМ ІІ порядку і може здійснювати регуляторний вплив на різні тканини та органи. По-друге, за науковими даними, введення тималіну сприяє зменшенню аутоагресії та відновленню Т-супресорної функції лімфоцитів.

Під впливом ПФА (у дозі 0,2 мг/кг) у крові тварин з аутоімунним васкулітом відмічалося зростання активності СОД – від 1,80+0,06 до 2,13+0,06 од. акт., (р<0,01), каталази – від 1,13+0,06 до 1,37+0,05 ум. од. акт., (р<0,01), зменшився вміст ДК – з 39,67+1,18 до 33,97+1,19 мкмоль/л, (р<0,01) та % перекисного гемолізу еритроцитів – з 10,82+0,06 до 6,19+0,32, (р<0,01), що свідчить про нормалізацію процесів ПОЛ та АО захисту крові. Рівень ЦП залишався високим (рис.3). Відмічалося вірогідне зменшення перекисних процесів у тканинах нирок, що сполучалося зі зменшенням їх Кm. Застосування даларгіну також сприяло нівелюванню перекисних зрушень у крові (рис. 3) та нирках.

МДА ДК ПРЕ СОД Каталаза ЦП

(% гемолізу)

Рис. 3. Показники ПОЛ і АО захисту крові при експериментальному аутоімунному васкуліті під впливом ПФА і тималіну.

* - вірогідно у порівнянні з контрольною групою

При дослідженні ліпідного спектру крові відмічено гіпохолестеринемічну дію ПФА (1,53+0,04 проти 1,89+0,05 ммоль/л у контрольній групі, р<0,05), що, враховуючі дані попередніх експериментів, може бути проявом її специфічної фармакологічної активності. Під впливом тималіну вірогідно зменшився вміст у крові атерогенних ЛП.

Під впливом ПФА в умовах відтвореного аутоімунного васкуліту відбулося підвищення фагоцитарної активності нейтрофілів (69,50+0,29 % проти 47,27+2,29 % у контрольних тварин), (р <0,01), відновилося характерне для інтактних щурів співвідношення лімфоцитів і нейтрофілів, зменшився, відносно контролю, % моноцитів та еозинофілів, що свідчить про нормалізацію регуляторних механізмів імунної відповіді. Відмічалося зменшення здатності перетворення лімфоцитів у бласти, що може бути проявом підвищення імунологічної толерантності організму. Аналогічні ефекти відбулися й при застосуванні тималіну. Позитивного впливу ПФА на систему зсідання крові не визначалося (залишалися ознаки гіперкоагуляції). Під впливом тималіну відмічалася активація фібринолізу.

Застосування ПФА у тварин з аутоімунним васкулітом зумовило відновлення ЕМ аорти, покращення морфофункціонального стану ГМК, фібробластів, основної речовини, а також зменшення інфільтрації стінки аорти клітинами гематогенного походження, яка відбулася в умовах аутоімунної патології. Інтима залишалася потовщеною, з присутністю колагену. Відмічалася проліферація ЕТ. Тималін також сприяв частковому відновленню ЕМ, проте залишалися ознаки колагенізації і суттєве збільшення гематогенної клітинної інфільтрації стінки аорти, що може бути наслідком специфічного імунологічного впливу тимічних пептидів.

В цілому, застосування ПФА (у дозі 0,2 мг/кг) при експериментальному аутоімунному васкуліті зумовило зменшення перекисних зрушень у крові та нирках дослідних тварин, зменшення вмісту ХС у крові, покращення функціонального стану лейкоцитів та структурно-метаболічного стану стінки аорти.

Таким чином, проведені дослідження показали, що в умовах моделювання різних видів судинної патології ПФА сприяє відновленню морфофункціонального стану стінки аорти та виявляє регуляторні ефекти щодо інших систем та органів. Приведені дані обгрунтовують доцільність подальшого доклінічного вивчення ПФА з перспективою створення ангіопротекторного препарату.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, яка визначається експериментальним обгрунтуванням доцільності використання цитомедіну з судин великої рогатої худоби — пептидної фракції аорти — в умовах моделювання різних видів атероартеріосклерозу та васкуліту, що відкриває перспективи її подальшого дослідження з метою створення лікарського препарату.

1. Пептидна фракція аорти, яка отримана шляхом оцтово-кислої екстракції з аорт великої рогатої худоби, являє собою комплекс водорозчинних поліпептидів з молекулярною масою до 10 кДа, з максимумом спектру поглинання в ультрафіолетовій ділянці (200-220 нм) та має хроматографічну криву з 8 основними піками.

2. Пептидна фракція аорти в дозі 0,12 мг/кг маси тіла при введенні хом'якам внутрішньом'язово щоденно протягом 10 діб в умовах перекисного атероартеріосклерозу сприяє зменшенню накопичення кислих глікозаміногліканів у основній речовині медії та відновленню еластичного каркасу стінки аорти. Ефекти препарату порівняння Т-активіну щодо морфофункціонального стану стінки аорти виражені у меншій мірі.

3. При експериментальному перекисному атероартеріосклерозі пептидна фракція аорти позитивно впливає на ліпідний спектр крові, що проявляється у зменшенні вмісту холестерину (з 3,44+0,11 до 2,27 +0,13 ммоль/л, р<0,01) та атерогенних ліпопротеїдів (з 2,19+0,09 до 1,77+0,04 г/л, р<0,01), сприяє зменшенню накопичення у крові малонового діальдегіду на 16,8 %, призводить до нормалізації значень показників гемокоагуляції. Т-активін не впливає на ліпідний спектр крові та сприяє нівелюванню порушень у системі гемостазу.

4. В умовах експериментального холестеринового атероартеріосклерозу пептидна фракція аорти в дозі 0,2 мг/кг маси тіла при введенні хом'якам внутрішньом'язово щоденно протягом 10 діб сприяє відновленню еластичних мембран медії, зменшенню ліпідної інфільтрації та вакуолізації основної речовини. Препарат порівняння даларгін сприяє відновленню еластичних структур, проте у меншій мірі зменшує ліпідну інфільтрацію стінки аорти.

5. Пептидна фракція аорти в умовах експериментального холестеринового атероартеріосклерозу більш суттєво впливає на показники ліпідного обміну, ніж в умовах перекисного атероартеріосклерозу, що проявляється у вірогідному зниженні в крові вмісту холестерину на 31,0 %, атерогенних ліпопротеїдів на 28,8 %, загальних ліпідів на 31,9 %; сприяє зменшенню коагуляційного потенціалу крові: подовжує час рекальцифікації (від 78,3+3,1 до 89,6+3,0 с, р<0,001) та тромбіновий час (від 31,8+1,39 до 56,4+2,44 с, р<0,001), а також позитивно впливає на показники перекисного окислення ліпідів та антиоксидантного захисту, що проявляється у вірогідному зменшенні у крові відсотку приросту малонового діальдегіду на 10,8 %, вмісту дієнових кон'югатів на 24,1 %, збільшенні активності супероксиддисмутази на 29,0 %, вірогідному зниженні вмісту малонового діальдегіду у тканинах печінки (на 79,5%) і нирок (на 79,5%) та підвищенні активності супероксиддисмутази у тканинах печінки на 14,5 %. Даларгін не впливає на показники ліпідного обміну, проте сприяє нормалізації перекисних процесів і гемокоагуляції.

6. Застосування пептидної фракції аорти в дозі 0,2 мг/кг маси тіла при введенні щурам внутрішньом'язово щоденно протягом 10 діб в умовах експериментального аутоімунного васкуліту викликає зменшення колагенізації інтими і медії, сприяє відновленню еластичних мембран, зниженню інфільтрації стінки аорти клітинами гематогенного походження. Препарат порівняння тималін сприяє відновленню еластичного каркасу, проте збільшує гематогенну клітинну інфільтрацію стінки аорти.

7. В умовах експериментального аутоімунного васкуліту пептидна фракція аорти, як і при моделюванні різних видів атероартеріосклерозу, вірогідно знижує вміст дієнових кон'югатів на 14,3 %, підвищує активність супероксиддисмутази на 18,3 % та каталази на 21,2 %, покращує перекисний метаболізм у тканинах нирок, що проявляється у вірогідному зменшенні вмісту малонового діальдегіду на 69,5 % та підвищенні активності антиоксидантних ферментів. За впливом на вищевказані показники ПФА не поступається тималіну.

8. При аутоімунному васкуліті пептидна фракція аорти, як і тималін, нормалізує кількість та співвідношення різних популяцій лейкоцитів, вірогідно підвищує фагоцитарну активність нейтрофілів на 53,5 % та зменшує здатність лімфоцитів до бласттрансформації на 15,8 %.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

Наявність виражених ангіопротекторних властивостей пептидної фракції аорти свідчить про можливість подальшого вивчення цієї речовини з визначенням амінокислотної послідовності для створення синтетичного фармакологічного препарату.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Чекаліна Н.І., Катрушов О.В., Кайдашев І.П. Експериментальна терапія атеросклеротичного ураження судин пептидним комплексом аорти // Експериментальна і клінічна медицина. – 2000. - № 2. – С. 73-75 (внесок здобувача – 70 %).

2. Чекаліна Н.І. Фармакологічна активність пептидного комплексу аорти в умовах експериментальної гіперхолестеринемії // Медицина сьогодні і завтра. – 2000. - № 3. – С. 64-67

3. Чекаліна Н.І., Губіна-Вакулік Г.І., Куценко Л.А. Вплив пептидного комплексу аорти на морфофункціональний стан стінки аорти при експериментальному атероартеріосклерозі // Вісник морфології. – 2000. - № 2. – С. 194-196 (внесок здобувача – 70 %).

4. Чекаліна Н.І. Вплив пептидного комплексу аорти та інших препаратів поліпептидної природи на стан вільнорадикальних процесів у тканинах органів та коефіцієнти маси органів в умовах експериментальної судинної патології // Вісник Вінницького державного медичного університету. – 2001. - № 1. - С. 78-81

5. Чекаліна Н.І. Вплив пептидного комплексу аорти на морфофункціональний стан стінки аорти при експериментальному холестериновому атероартеріосклерозі // Лекарства — человеку: Материалы научно-практической конференции 14 мая 2001 года. – Т. 15, № 1-2. – С. 495-501

6. Чекаліна Н.І. Вплив цитомедінів аорти та тимусу на перебіг експериментального аутоімунного васкуліту // Вісник фармації. – 2001. - № 3. – С. 168

7. Чекаліна Н.І. Ангіопротекторні властивості пептидних біорегуляторів при експериментальному аутоімунному пошкодженні судин // Вісник наукових досліджень. – 2001. - № 3. – С. 85-87

8. Пат. № 45251 А України від 15.03.2002, А 61 К 35/30, 38/00. Спосіб отримання поліпептидів // Чекаліна Н.І., Кайдашев І.П., Катрушов О.В. (Україна). - № 2001074761; Заявл. 09.07.2001; Опубл. 15.03.2002; Бюл. № 3/109 (внесок здобувача – 60 %).

9. Чекаліна Н.І. Фармакологічна активність пептидного комплексу аорти при експериментальному перекисному атероартеріосклерозі // Матеріали ІV Міжнародного медичного конгресу студентів і молодих вчених. – Тернопіль: Укрмедкнига. - 2000. – С. 332

10. Казаков Ю.М., Чекаліна Н.І. Експериментальна терапія атероартеріосклерозу пептидним комплексом аорти // Матеріали ІV Конгресу кардіологів України. – Київ, 2000.- С. 142 (внесок здобувача – 80 %).

11. Казаков Ю.М., Чекалина Н.И., Кудинец Ю.В. Терапия экспериментального атероартериосклероза пептидным комплексом аорты // Материалы Российского национального конгресса кардиологов "Кардиология, основанная на доказательствах". – М., 2000. – С. 123 (внесок здобувача – 70 %).

12. Чекаліна Н.І., Кудинець Ю.В. Фармакологічна активність пептидного комплексу аорти у порівнянні з іншими препаратами поліпептидної природи в умовах експериментального холестеринового та перекисного атероартеріосклерозу // Материалы республиканской научно-практической конференции молодых учёных "Достижения и перспективы развития терапии в канун ХХІ века". – Харьков, 2000. – С. 80-81 (внесок здобувача – 80 %).

13. Чекліна Н.І., Кудинець Ю.В. Фармакологічна активність пептидного комплексу аорти в умовах експериментального перекисного атероартеріосклерозу // Материалы ІІІ Республиканской научно-практической конференции "Новое в клинической фармакологии и фармакотерапии заболеваний внутренних органов". – Харьков, 2000. - С. 28-30 (внесок здобувача – 80 %).

14. Чекаліна Н.І., Казаков Ю.М., Катрушов О.В. Застосування пептидного комплексу аорти в експериментальній терапії атероартеріосклерозу // Матеріали Міжнародного конгресу студентів і молодих вчених “Клініко-морфологічні аспекти серцево-судинної системи”. – Дніпропетровськ, 2000. – С. 20-21(внесок здобувача – 60 %).

15. Чекаліна Н.І., Усенко М.М. Порівняння фармакологічної активності пептидного комплексу аорти та даларгіну при експериментальному холестериновому атероартеріосклерозі // Матеріали 5-го Міжнародного медичного конгресу

студентів та молодих учених. – Тернопіль: Укрмедкнига. – 2001. – С. 207 (внесок здобувача – 80 %).

16. Чекалина Н.И., Катрушов А.В. Эффективность применения пептидного комплекса аорты при экспериментальном аутоиммунном поражении сосудов // Матеріали об'єднаного Пленуму правління Українського наукового товариства кардіологів та Асоціації лікарів-інтерністів “Нові напрямки профілактики і лікування ішемічної хвороби серця та артеріальної гіпертензії”. – Київ, 2001. - С. 185-186 (внесок здобувача – 80 %).

17. Чекаліна Н.І., Тимошенко К.В. Ефективність поліпептидних біорегуляторів — цитомедінів при експериментальному аутоімунному ураженні судин // Тези міжнародної наукової конференції студентів і молодих вчених “Актуальні проблеми клінічної і теоретичної медицини”.- Дніпропетровськ, 2001. - С. 180-181 (внесок здобувача – 80 %).

18. Чекаліна Н.І., Кудинець Ю.В. Порівняльна характеристика впливу пептидного комплексу аорти та інших препаратів поліпептидної природи на морфофункціональний стан стінки аорти при моделюванні різних видів атероартеріосклерозу // Матеріали ІІ Української конференції молодих вчених, присвяченої пам'яті академіка В.В. Фролькіса. – Київ, 2001. - С. 127-128 (внесок здобувача – 80 %).

19. Чекаліна Н.І., Катрушов О.В., Казаков Ю.М. Фармакологічна активність пептидного комплексу аорти порівняно з Т-активіном та даларгіном при експериментальному атероартеріосклерозі // Тези доповідей ІІ Національного з'їзду фармакологів України “Фармакологія 2001 - крок у майбутнє”. – Дніпропетровськ, 2001. – С. 270 (внесок здобувача - 60 %)

20. Чекалина Н.И. Фармакологическая активность пептидных биорегуляторов при экспериментальном атероартериосклерозе // Материалы ІІ Российского Национального конгресса кардиологов. – М., 2001. – С. 397

АНОТАЦІЇ

Чекаліна Н.І. Ангіопротекторні властивості пептидної фракції аорти при експериментальному атеросклеротичному та аутоімунному ураженні судин.- Рукопис.

Дисертація на здобуття