МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ЦІПОВЯЗ Сергій Васильович

УДК 616.37-002.2-02:616.89-008+557.146.1

ЕФЕКТИВНІСТЬ ЛІПОСОМАЛЬНИХ ФОРМ

АНАЛОГІВ НЕЙРОПЕПТИДІВ ПРИ ЛІКУВАННІ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ПАНКРЕАТИТУ

(експериментальне дослідження)

14.03.05 - фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового

ступеня кандидата медичних наук

Одеса – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті Міністерства охорони здоров’я України

Науковий керівник: | доктор медичних наук, професор, Демидов Володимир Михайлович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, професор кафедри загальної хірургії

Офіційні опоненти:

Доктор медичних наук, професор, Воскресенський Олег Миколайович, інститут стоматології АМН України, завідувач відділу фармакології та токсикології, м.Одеса

Доктор медичних наук, професор, Лук’янчук Віктор Дмитрович, Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри фармакології

Провідна установа: Інститут фармакології та токсикології АМН України, відділ нейрофармакології, м.Київ

Захист відбудеться 22.03.2002 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті МОЗ України. (65026, м. Одеса, пров. Валіховський, 2).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеського державного медичного університету за адресою: 65026, м. Одеса, пров. Валіховський, 3.

Автореферат розісланий 20.02.2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

к. мед. н. Соболєв Р.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ураження підшлункової залози (ПЗ), їх точна та своєчасна діагностика, розробка та удосконалення нових діагностичних методів при цих захворюваннях, вдосконалення методик комплексного лікування з урахуванням патогенетичних аспектів захворювання - все вказане є суттєвою проблемою для медицини, вирішення котрої набуває важливого значення не тільки з медичної, але й з економічної та соціальної точки зору (Шалімов О.О., 1993, 1998; Демидов В.М. та співавт., 1998-2001; Dugernier T. et al., 1996; Varga I.S.Z. et al., 1997; Tsai K., 1998).

Актуальною проблемою сучасної фармакології в аспекті вищезазначеного є розробка нових методів фармакологічної корекції цього захворювання на основі вивчення та аналізу патогенезу запальних процесів, що уражують паренхіму ПЗ.

Високі показники летальності при гострих панкреатитах (ГП), велика кількість ускладнень при консервативному лікуванні цього захворювання пов’язані із незадовільними результатами комплексного лікування хворих на ГП, що в свою чергу пояснюється неповними і недостатніми даними про роль біорегуляторів, а саме, нейропептидів в патогенезі цього захворювання.

Останнім часом показані ефекти oпіoїдних пептидів - ефектoрів ендoгеннoї oпіoїднoї cиcтеми – у фoрмуванні cтреcoрних реакцій при запальних захворюваннях органів черевної порожнини, в тому числі і при ураженнях паренхіми ПЗ (Дробков О.Л., 1996; Кадочніков В.С., 1997; Демидoв В.М. та співавт., 1998-2001). Встанoвленo пoзитивну терапевтичну дію сандостатину при експериментальному гострому панкреатиті, а також за клінічних умов (Геoргиевcкий В.П. и coавт., 1989). Даларгін показав свою ефективність за експериментальних умов на моделі ГП (Демидов В.М., 1999). Але ефективність застосування пептидів обмежується активністю пептидаз, котрі руйнують дані пептиди у кровоносному руслі.

Показано, що при сумісному введенні даларгіну і Д-фенілаланіну можна досягти подовження терміну знаходження препаратів у кровоносному руслі (Демидов В.М. та співавт., 1997-2001). У той же час отриманий патент України на розроблений спосіб “зберігання” нейропептидів у ліпосомальній оболонці (Запорожан В.М. та співавт., 1998, №30214), захисту їх від агресивної дії пептидаз і підвищення таким чином їх ефективності показав доцільність проведення досліджень, спрямованих на вивчення захисної ролі ліпосомальних форм аналогів нейропептидів при патологічних станах у черевній порожнині.

Необхідність проведення досліджень, присвячених як подальшому вивченню детальних патогенетичних механізмів ГП, так і розробці, і експериментальній перевірці ефективності нових схем лікування захворювання, є тим самим “підгрунтям”, на котрому базуються сучасні методи лікування ГП.

З’ясуванню ефективності методики лікування ГП за експериментальних умов присвячена ця дисертаційна робота, у котрій, у вигляді складової частини комплексної терапії, будуть визначені ефекти ліпосомальних форм сандостатину й даларгіну.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Наші дослідження продовжують та розвивають науковий напрямок, котрий розробляє кафедра загальної хірургії Одеського державного медичного університету, - вивчення регуляторних гормональних систем та їх природніх метаболітів, впровадження їх синтетичних аналогів як лікарських препаратів, - в рамках виконання НДР кафедри, затвердженої МОЗ України, “Розробка патогенетично обгрунтованих методів корекції ендотоксикозу і змін дифузної ендокринної системи у хворих з гострими захворюваннями черевної порожнини і запальними захворюваннями м’яких тканин (№ держреєстрації 0196U001839)

Мета дослідження. Патогенетичне обгрунтування ефективності застосування ліпосомальних форм сандостатину й даларгіну в комплексному лікуванні гострого експериментального панкреатиту.

Завдання дослідження

1.

2.

3.

4.

Об’єкт дослідження – гострий експериментальний панкреатит (ГЕП).

Предмет дослідження – показники, що характеризують вираженість гострого експериментального панкреатиту у щурів – показники системи протеолізу, функціональної системи “ПОЛ-антиоксидантний захист” в тканині підшлункової залози та печінки, резистентності мембран еритроцитів - та їх зміни під впливом комплексного лікування із додаванням ліпосомальних форм сандостатину та даларгіну.

Методи дослідження – для досягнення висунутої в роботі мети були використані експериментальні моделі, фармакологічні, біохімічні та статистичні методи.

Наукова новизна. Показано, що формування ГЕП у щурів характеризується зростанням активності нейтральних і кислих протеаз, збільшенням концентрації 1-антитрипсину і зниженням концентрації білка в крові. Це супроводжується інтенсифікацією процесів ПОЛ і пригніченням антирадикального захисту в тканині підшлункової залози і печінки.

Вперше визначено, що впродовж ГЕП у тварин тривають виразні зрушення резистентності мембран еритроцитів, що підтверджується зменшенням показників

перекисної резистентності еритроцитів і збільшенням показників сумарної пероксидазної активності крові, що свідчить про системний характер уражень, які розвиваються.

Вперше визначено та досліджено, що вживання щурами із ГЕП ліпосомальних форм сандостатину й даларгіну (50 мкг/кг, внутрішньочеревно) сприяло розвитку виразної фармакотерапевтичної дії, про що свідчить нормалізація досліджуваних показників. Вперше показано, що за нормалізацією показників активності системи протеолізу, виразності процесів ліпопероксидації та антирадикального захисту в тканині підшлункової залози і печінки, за показниками резистентності мембран еритроцитів, а також за вмістом загального холестерину та загальних фосфоліпідів ефективність ліпосомального сандостатину перевищувала таку у ліпосом і сандостатину, а активність ліпосомального даларгіну перевищувала таку у даларгіну.

На підставі проведених досліджень зроблений висновок про те, що нівелювання зазначених зрушень за умов ГЕП свідчить про те, що для реалізації захисної дії сандостатину й даларгіну необхідно пролонгування терміну їх дії в кровоносному руслі, що досягалося через їх залучення до ліпосомальної оболонки. При цьому захисна дія препаратів реалізується через їх переважне накопичення у тканині підшлункової залози, а також завдяки антиоксидантним ефектам як ліпосом, так і пептидів.

Науково-практична цінність роботи. За експериментальних умов опробовано оригінальну модель ГЕП, котра є легко відтворюваною та адекватною клінічному стану.

Отримані дані розширюють уявлення про патогнез ГЕП з точки зору врахування процесів ПОЛ та антирадикального захисту в тканині підшлункової залози і печінки у розвитку даного захворювання.

Виявлена висока фармакологічна ефективність ліпосомальної форми сандостатину, порівняно з нативними ліпосомами і неліпосомальною формою сандостатину, а також з ліпосомальною і неліпосомальною формами даларгіну, при ГЕП дозволяє рекомендувати її для подальшого клінічного вивчення і впровадження у виробництво в якості нової лікарської форми.

Особистий внесок дисертанта у розробку наукових результатів. Дисертація є самостійною науковою працею автора, внесок якого полягає у виборі напрямку, об’єму і методів дослідження, формулюванні мети і завдань дослідження. Автор самостійно виконав експериментальні дослідження і статистичну обробку отриманих результатів, провів науковий аналіз і обговорення даних, що отримав, сформулював основні положення і висновки дисертації.

Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи отримали позитивну оцінку фахівців на пленумі хірургів-гепатологів Росії та країн СНД (Москва,

1999), ІІ Конгресі гепатологів України (Київ, 2000), російсько-германському симпозиумі “Хирургия поджелудочной железы на рубеже веков” (Москва, 2000), Міжнародній конференції “Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы” (Донецьк, 2000), VIII Конгресі Міжнародної Федерації Українських медичних товариств (Львів-Трускавець, 2000), ІІ Укр. Конгресі гастроентерологів (Дніпропетровськ, 2000), міжнародній науково-практичній конференції “Актуальные вопросы хирургического лечения заболеваний гепатопанкреатодуоденобилиарной зоны” (Одеса, 2001), ІІ Національному з’їзді фармакологів України (Дніпропетровськ, 2001).

Публікації. За матеріалами досліджень опубліковано 13 наукових праць, з них 10 статей у фахових журналах, решта робіт – у матеріалах конференцій та симпозіумів.

Обсяг та структура дисертації. Роботу викладено на 153 сторінках машинописного тексту. Вона складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків та списку використаних джерел. Дисертацію ілюстровано 18 таблицями, 12 рисунками. Список літератури містить 245 джерел, з них 150 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Експериментальні дослідження у цій роботі були проведені на 202 статевозрілих щурах-самцях лінії Вістар масою від 180 до 250 г на моделі ГЕП, котрий моделювали у щурів шляхом одноразового здавлення ПЗ, доступ до котрої забезпечували через розтинання черевної порожнини щурів (Синовець А.С. та співавт., 1971). За даними низки авторів, на 3-ю добу після зазначеного травматичного впливу у 95% тварин було отримано морфологічну картину, що відповідає ГЕП (Вансович В.Є., 1992; Кадочніков В.С., 1997; Демидов В.М. і співавт., 1999; Hughes C.B.. et al., 1995). Впродовж цього інтервалу часу, за умов експериментальної моделі, котрою ми користувалися, тривають максимально виражені біохімічні та нейрогуморальні зміни (Демидов В.М. і співавт., 2000; Синовець О.А. і співавт., 1999; Grewal H.P. et al., 1994; Hughes C.B.. et al., 1995). Виведення тварин із досліду для подальших біохімічних досліджень проводили декапітацією після передозування етаміналу натрію (85 мг/кг) на 3-ю добу з моменту індукції ГЕП.

У дослідженнях тестували ефекти сандостатину, даларгіну, нових ліпосом (Запорожан В.М. та співавт., 1998; Патент України №28868) і ліпосомальних форм нейропептидів сандостатину та даларгіну, (Запорожан В.М. та співавт., 1998; Патент України №30214). Всі речовини вводили в однакових дозах – 50 мкг/кг внутрішньочеревно, щоденно впродовж 3 діб. Сандостатин – синтетичний октапептид, похідний соматостатину. Даларгін – пептидна речовина – тирозіл-2-аланіл-гліцил-фенілаланіл-лейцил-аргинін. Ліпосоми готували шляхом обробки ультразвуком суміші лецитину, фосфатилсерину, холестерину у водному середовищі, в атмосфері гелію. При цьому змішували токоферол, лецетин, фосфатилсерин і холестерин у мольному співвідношенні відповідно: 0.06 : 1.0 : 0.18 : 1.2, при цьому, поряд з використанням гелію, застосовували неон у співвідношенні 85:15% і води не більше 1 ppm, а кисню - не більше 3 ppm з можливістю отримання стабільних ліпосом, що руйнуються через 10-12 діб після їх отримання, не більше, ніж на 10%. Ліпосомальні форми нейропептидів готували таким чином: обробляли суміш лецитину, фосфатилсерину, холестерину ультразвуком у водному середовищі, в атмосфері гелію і неону; до водного середовища додатково вводили розчин аналогів нейропептидів при загальному співвідношенні компонентів у суміші 1:2:1 у співвідношенні гелію і неону 85:15%, при цьому застосовували ультразвук частотою 20-22 кГц, а обробку проводили за повної відсутності кисню.

Експерименти виконували у таких групах тварин:

1 серія - інтактні щури (n=14). 2 серія – травматичний експериментальний гострий панкреатит (n=21). 3 серія – вплив ліпосом (50 мкг/кг, в/чер) на перебіг ГЕП (n=9). 4 серія – вплив сандостатину (50 мкг/кг, в/чер) на перебіг ГЕП (n=11). 5 серія – вплив ліпосомального сандостатину (50 мкг/кг, в/чер) на перебіг ГЕП (n=11). 6 серія – вплив даларгіну (50 мкг/кг, в/чер) на перебіг ГЕП (n=14). 7 серія – вплив ліпосомального даларгіну (50 мкг/кг, в/чер) на перебіг ГЕП (n=10). 8 серія – дослідження виживаємості тварин із ГЕП за різних умов лікування (n=32).

Контрольними були дві групи тварин – інтактні щури, котрим уводили аналогічні об’єми 0.9% розчину NaCl, і щури з ГЕП, котрим не надавалося лікування, а вводилися аналогічні об’єми 0.9% розчину NaCl.

Дослідження поглинання і накопичення мічених за I131 вільних і ліпосомальних форм даларгіну й сандостатину (400-1000 мкKю/кг; питома активність = 55.8 кКю/мoль; НВО "Ізoтoп") здійснювали таким чином. Після уведення мічених нейропептидів щурів забивали і забирали кров, в сироватці котрої підраховували радіоактивність мічених нейропептидів після введення ліпосомальних і неліпосомальних форм нейропептидів. Підрахунок радіoактивнocті після попередньої обробки тканин (coлюбілізація і гасіння хемілюмінеcценції) здійснювали за допомогою тoлуoл-тритoнoвoгo cцинцилятoра на рідинному cцинтиляційному лічильнику “1219-Rackbeta” (LKB-Wallac) і виражали кількістю актів розпаду за секунду (або беккерелей) у 1 мл сироватки крові щурів.

В сироватці крові загальновідомими засобами визначали активність трипсину за Ерлангером-Шатерниковим, інгібітора трипсину - за Хавербеком у модифікації Шатерникова, -амілази - за методом Каравея. Активність ліпази визначали спектрофотометрично. Враховували результати реакції на cпектрoфoтoметрі "Hitachi" (Японія) при довжині хвилі 410 нм. Крім цього, визначали активність нейтральних і кислих протеаз, вміст 1-антитрипсину за Левицьким А.П. (1973) і концентрацію білка крові за Лоурі.

У щурів із ГЕП в ПЗ і печінці визначали активність перебігу процесів ПОЛ і стан системи антиоксидантного захисту. Для приготування гомогенатів ПЗ і печінки після евтаназії тварин виділяли ці органи і виготовляли їх гомогенат у гомогенізаторі в середовищі 10 мМ трис-HCl буфера (рН=7.4) у співвідношенні 1:9, котрий потім центрифугували протягом 10 хв при 5000 g (t=02оС). Супернатант використовували для визначення концентрації малонового діальдегіду (МДА; Cтальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977), дієнових кон’югат (ДК; Костюк В.А. и соавт., 1984) і активності антиоксидантних ферментів - супероксиддисмутази (СОД), глутатіон-пероксидази і глутатіонредуктази. Активність СОД визначали за рівнем інгібування відновлення нітросинього тетразолію у присутності NADH і феназинметасульфата (Дубинина Е.Е. и соавт., 1983). Активність глутатіонпероксидази визначали за швидкістю окислення глутатіону в присутності гідроперекису третинного бутилу (Моин В.М., 1986), активність NADРH-глутатіонредуктази – за швидкістю відновлення окисленого глутатіону в присутності NADРH (Власова С.Н. и соавт., 1990). Вміст відновленого глутатіону визначали за методикою Прохорової М.І. (1982).

У щурів із ГЕП визначали перекисну резистентність еритроцитів (ПРЕ), що є об’єктивним критерієм забезпеченості біологічних мембран структурними антиоксидантами (Бенисович В.И., Идельсон Л.И., 1973). Принцип методу полягає у визначенні процента гемоглобіну, що вийшов із еритроцитів при їх пошкодженні екзогенним перекисом водню, котрий входить до складу інкубаційного середовища. Сумарну пероксидазну активність (СПА) визначали у плазмі крові (Микаэлян Э.М. и соавт., 1984). В основі методу визначення СПА є здатність гемопротеїдів у присутності пероксиду каталізувати окис бензидину з утворенням зафарбованих продуктів. Вміст загального холестерину визначали за методом Ілька, концентрацію загальних фосфоліпідів – за методом Folch J. et al. (1957).

Крім того, в якості об’єктивного критерію ефективності лікування оцінювали виживаємість щурів в кожній групі.

Всі отримані результати обробляли за допомогою загальноприйнятих у медико-біологічних дослідженнях параметричних і непараметричних методів статистичного аналізу Статистичну обробку проводили за допомогою програми статистичного аналізу “Statgraph”. Критерієм достовірності обирали P<0.05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1.

Панкреатит моделювали шляхом травматизації тканини ПЗ. Проведені біохімічні дослідження показали наявність характерних для ГП зростання ферментативної активності крові, що виражалося зростанням концентрації трипсину, ліпази та амілази та зниженням активності інгібітору трипсину. Таким чином, обрана модель ГЕП є легковідтворюваною та адекватною клінічному стану, що підтверджується біохімічними показниками ферментативної активності сироватки крові щурів за модельних умов.

2.

Через 30 хв від початку відтворення ГЕП радіоактивність ліпосомального сандостатину перевищувала такий показник у групі щурів, котрим уводили неліпосомальну форму пептиду в 5.6 разів (P<0.001; рис. 1). Починаючи з 1-ї год перебігу ГЕП, у сироватці крові щурів, котрим уводили сандостатин, залишалися залишкові концентрації пептиду, при цьому, після 1-ї доби ГЕП цей препарат був повністю відсутнім у крові. У протилежність цьому, в сироватці крові тривала висока радіологічна активність ліпосомального сандостатину. Так, порівняно з початковим рівнем радіологічної активності, досліджувані показники через 1 і 24 год складали, відповідно, 75% і 70%. Високий рівень концентрації препарату в сироватці крові зберігався до 4-ї доби, посля чого його радіологічна активність зменшувалася у 4.5 рази відносно початкових показників (рис. 1). Аналогічні показники були отримані при радіологічному дослідженні концентрації в крові ліпосомальної і неліпосомальної форм даларгіну (рис. 1).

Рис. 1. Вміст ліпосомального і неліпосомального сандостатину і даларгіну в сироватці крові щурів із ГЕП.

За віссю абсцис – досліджувані показники, послідовно, впродовж ГЕП (години).

За віссю ординат – показники (%) вмісту пептидів у сироватці крові щурів із ГЕП.

Позначки: * - P<0.001 – вірогідні відмінності відносно таких показників у щурів із ГЕП, которим уводили неліпосомальний сандостатин;

# - P<0.001 – вірогідні відмінності відносно таких показників у щурів із ГЕП, которим уводили неліпосомальний даларгін (критерій Вілкоксона).

Отже, проведені дослідження мають важливе значення з точки зору обрання методологічного напрямку проведення досліджень. Показано, що у сироватці крові зберігається більш висока концентрація ліпосомальних форм аналогів нейропептидів порівняно з їх неліпосомальними формами, що підтверджує нашу думку про руйнуючий вплив пептидаз на досліджувані пептиди. Так, у подальших дослідженнях доцільно вивчати ефективність ліпосомальних форм сандостатину й даларгіну у щурів за умов ГЕП, оскільки їх концентрація в крові значно перевищує концентрацію неліпосомальних У подальшому ми з’ясували, що при знадходженні до кровоносного русла ліпосомальні форми сандостатину і даларгіну у більшому ступені акумулюються в тканини ПЗ порівняно з акумуляцією неліпосомальних форм нейропептидів. З того випливає, що перевага накопичення ліпосомальних форм пептидів в тканині ПЗ є одним із механізмів реалізації їх захисної дії за умов ГЕП.

3.

З того, формування ГЕП супроводжується зростанням концентрації трипсину в сироватці крові, різкою активацією трипсиноподібних протеаз і лізосомальних ензимів (катепсину D). Підвищення активності останніх свідчить також про наявність запально-деструктивних змін у печінці та інших органах. Зазначені зміни функціональної активності системи протеолізу є одним із патогенетичних ланок патологічного стану, що підтверджує адекватність обраної нами моделі ГЕП такому клінічному стану (Веремеенко К.Н., 1971).

За цих умов, на 3-ю добу перебігу ГЕП, уведення ліпосомального сандостатину сприяло нормалізації активності нейтральних і кислих протеаз у сироватці крові щурів дослідної групи. Препарат зменшив також концентрацію 1-антитрипсину, але не впливав на концентрацію білка (Рис. 2).

Аналогічні, але менш виразні захисні ефекти, ми спостерігали при уведенні ліпосомальної форми даларгіну щурам із ГЕП, коли його вживання сприяло нормалізації активності нейтральних і кислих протеаз. Ефективність ліпосомальної форми препарата була значно вищою, ніж у даларгіна, що є однією з переваг використання ліпосомальних форм лікарських речовин у комплексній терапії ГЕП (Рис. 2).

Вплив ліпосомальних форм сандостатину (ЛС) та даларгіну (ЛД) на зміни активності процесів протеолізу в сироватці крові щурів із ГЕП.

За віссю абсцис – групи щурів, за котрими спостерігали.

За віссю ординат: досліджувані показники - фрагменти А-Г, відповідно, активність нейтральних і кислих протеаз, концентрації 1-антитрипсину і білка крові.

Позначки: * - P<0.05, *** - P<0.001 вірогідні відмінності досліджуваних показників порівняно з такими в контрольній групі; # - P<0.05, ## - P<0.01, ### - P<0.001 вірогідні відмінності досліджуваних показників порівняно з такими в групі щурів із ГЕП (АНОВА + Ньюман-Куллз).

мальних форм аналогів нейропептидів в аспекті їх впливу на систему протеолізу значно перевищує таку, що є у їх неліпосомальних формах. Більш того, більш виразна нормалізація активності системи протеолізу відзначається у випадку застосування ліпосомального сандостатину, ніж у випадку уведення ліпосомального даларгіну, що, очевидно, може бути наслідком панкреатичного походження сандостатину. Це – важливий аспект результатів, що ми їх отримали. Враховуючи панкреатичне походження сандостатину, слід наголосити про замістний характер його вживання, в разі чого восповнюється його недостатність.

4.

Таким чином, за умов ГЕП в тканині ПЗ щурів відзначається значна інтенсифікація процесів пероксидації ліпідів, що, в свою чергу, супроводжується виснаженням активності всіх компонентів системи антиоксидантного захисту. Відзначені зрушення, разом із інтенсифікацією процесів ПОЛ в сироватці крові, являють собою один із варіантів патогенетичних ланок ГЕП, що також підтверджує адекватність обраної нами моделі такому клінічному стану.

Застосування за умов даної модельної патології на 3-ю добу захворювання ліпосомальних форм аналогів нейропептидів сприяло гальмуванню проявів ПОЛ. Результати, що ми їх отримали в даній серії досліджень, подані в таблицях № 1 і 2.

Таким чином, за умов ГЕП у щурів чітко прослідковується антиоксидантна дія ліпосомальних форм сандостатину й даларгіну, котра проявляється як зниженням вмісту проміжних та кінцевих продуктів ліпопероксидації, так і зростанням активності антиоксидантних ферментів. Самі ліпосоми виявляли незначну антиоксидантну дію, лише нормалізували вміст МДА. Цей ефект пояснюється мембраностабілізуючим ефектом фосфоліпідів ліпосом .

Звертає на себе увагу більш виражена ефективність ліпосомальних форм сандостатину й даларгіну за усіма тестованими параметрами, що дає змогу говорити про те, що залучення пептидів в ліпосомальну оболонку є корисним в аспекті нормалізації дисбалансу в функціональній системі “ПОЛ- антиоксидантний захист” в тканині ПЗ у щурів із ГЕП. Слід також відзначити більш виразну антиоксидантну дію ліпосомальної форми сандостатину порівняно з ліпосомальною формою даларгіну, що свідчить на користь доцільності подальшого дослідження панкреатопротекторних ефектів даного пептиду. Відзначене є, на нашу думку, одним із найбільш валідних експериментальних підтверджень перспективності використання ліпососомального сандостатину при ГЕП.

Наші подальші дослідження показали, що перебіг ГЕП у щурів супроводжується активацією процесів вільнорадикального окислення ліпідів в тканині печінки, що свідчить про безпосереднє залучення даного органа до патологічного процесу. Ці зміни озвалися різкою активацією процесів ліпопероксидації, про що свідчить накопичення проміжних та недокислених продуктів та зниження активності антиоксидантних ензимів. Отримані результати підтверджують дані деяких інших авторів та дають змогу

Рис. 3. Зміни показників процесів ліпопероксидації і антиоксидантного захисту в тканині ПЗ і печінки у щурів із ГЕП.

За віссю абсцис – групи щурів, за котрими спостерігали.

За віссю ординат: досліджувані показники - фрагменти А-Е, відповідно, концентрації МДА і ДК, активність глутатіону, СОД, глутатіонпероксидази і глутатіонредуктази. Темний стовпчик – ПЗ, світлий стовпчик – печінка.

Позначки: * - P<0.05, ** - P<0.01 і *** - P<0.001 вірогідні відмінності досліджуваних показників порівняно з такими в відповідній контрольній групі (АНОВА + Ньюман-Куллз).

нам відносити активацію процесів ПОЛ в печінці до патогенетичних ланок при ГЕП у у щурів Рис. 3).

При цьому принциповими є дані дані про інгібування процесу ПОЛ в паренхімі печінки під впливом ліпосомальних форм сандостатину і даларгіну, що проявлялося нормалізацією процесів ліпопероксидації. Перспективним при цьому є ефективність лі-

Таблиця 1

Вплив ліпосомального сандостатину на зміни процесів ліпопероксидації і

антиоксидантного захисту в тканині ПЗ щурів із ГЕП

№ | Досліджувані | Групи тварин

показники | ГЕП, n=21 | ГЕП + ліпо-соми,

n=9 | ГЕП + сандостатин, n=11 | ГЕП + ліпосо-мальний сандостатин, n=11

1 | МДА, нмоль/л | 4.72±0.38 | 3.95±0.11 * | 3.74±0.19 * | 2.41±0.14 *** #

2 | ДК, мкмоль/л | 0.89±0.04 | 0.72±0.09 | 0.61±0.08* | 0.47±0.08 ** #

3 | Глутатіон загальний, мМ | 16.6±0.6 | 17.6±0.7 | 18.3±0.8 | 19.8±0.7 * #

4 | СОД, од/мл | 1.18±0.09 | 1.39±0.11 | 1.52±0.09 | 1.74±0.08 *** #

5 | Глутатіонпе-роксидаза, од/г | 2.11±0.07 | 2.40±0.08 * | 2.57±0.11 * | 2.68±0.09 * #

6 | Глутатіонре-дуктаза, од/г | 2.14±0.14 | 2.24±0.12 | 2.30±0.10 | 2.45±0.10 #

Таблиця 2

Вплив ліпосомального даларгіну на зміни процесів ліпопероксидації і

антиоксидантного захисту в тканині ПЗ щурів із ГЕП

№ | Досліджувані | Групи тварин

показники | ГЕП, n=21 | ГЕП + ліпо-соми,
n=9 | ГЕП + даларгін, n=14 | ГЕП + ліпо-сомальний даларгін, n=10

1 | МДА, нмоль/л | 4.72±0.38 | 3.95±0.11 * | 4.04±0.17

* | 3.51±0.18 *** #

2 | ДК, мкмоль/л | 0.89±0.04 | 0.72±0.09 | 0.74±0.08 | 0.56±0.08 * #

3 | Глутатіон загальний, мМ | 16.6±0.6 | 17.6±0.7 | 17.7±0.6 | 19.1±0.8 * #

4 | СОД, од/мл | 1.18±0.09 | 1.39±0.11 | 1.41±0.13 | 1.66±0.08 * #

5 | Глутатіонпе-роксидаза, од/г | 2.11±0.07 | 2.40±0.08 * | 2.41±0.08

* | 2.51±0.10 ** #

6 | Глутатіонре-дуктаза, од/г | 2.14±0.14 | 2.24±0.12 | 2.25±0.14 | 2.30±0.10

Примітки: * - P<0.05, ** - P<0.01 і *** - P<0.001 – вірогідні відмінності відносно таких показників у щурів із ГЕП; # - P<0.05 вірогідні відмінності відносно таких показників у щурів із ГЕП, котрим уводили неліпосомальну форму пептидів.

посомального сандостатину, котра суттєво перевищувала таку у ліпосомального даларгіну.

Таким чином, можна підсумувати, що антиоксидантні ефекти ліпосомальних форм сандостатину і даларгіну переважають такі у пептидів, що не є залученими у ліпосомальну оболонку. Це дозволяє вважати, що ведучим у механізмах реалізації захисних ефектівнейропептидів є їх “захист” від агресивної дії пептидаз шляхом захисту ліпосомальною оболонкою. Ми також отримали дані щодо інтенсифікації процесів ПОЛ у паренхімі ПЗ та печінки, що є, на наш погляд, важливим у дослідженні патогенетичних механізмів ГЕП.

Іншим важливим висновком є більш висока антиоксидантна активність ліпосомальної форми сандостатину стосовно такої у ліпосомальної форми даларгіну, що може мати перспективу при проведенні подальших досліджень, спрямованих на розробку нових схем експериментальної корекції ГЕП.

5.

Дані зміни в плазмі крові мають подвійне значення та свідчать як про системний характер пошкоджень, які виникають при ГЕП, так і про розвиток синдрому пероксидації за умов цієї патології.

Цікавим і корисними є ефекти досліджуваних субстанцій за нормалізацією показників ліпідного складу крові і резистентності еритроцитів. Ефективними при цьому виявилися ліпосомальні форми сандостатину і даларгіну. Їх ефекти полягали у зменшенні показників ПРЕ та збільшенні показників СПА крові, а також у зменшенні рівня загального холестерину і підвищенні концентрації загальних фосфоліпідів. Слід також відзначити значно більшу активність за всіма параметрами, що досліджувалися, ліпосомальної форми сандостатину порівняно з ліпосомальною формою даларгіну. З іншого боку, ефективність ліпосомальних форм нейропептидів за даних умов суттєво перевищувала таку у незалучених до ліпосомів нейропептидів.

Ці дані вказують на додаткові переваги ліпосомальних форм нейропептидів: компоненти ліпосом (фосфоліпіди) сприяють замістному восповненню компонентів мембран клітин і еритроцитів. Отже, це дозволяє припустити мембранопротекторний ефект ліпосом по відношенню до клітин ПЗ і печінки.

Об’єктивним критерієм є тест на виживаємість тварин. Так, в контрольній групі загинули 87.5% щурів. В групах із вживанням ліпосомальних форм сандостатину й даларгіну ці показники становили, відповідно, 17% та 25% (P<0.01).

Таким чином, наші результати свідчать про високу ефективність ліпосомальної форми сандостатину й даларгіну у щурів за умов ГЕП, що, окрім всього, показує доцільність продовження цих досліджень з метою з’ясування подальшого профілю захисних ефектів пептидів, а також складання можливих схем фармакологічної корекції даного патологічного стану.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове розв’язання наукової проблеми – пошуку нових шляхів комплексного лікування гострого експериментального панкреатиту. На підставі дослідження відомих та встановлення нових суттєвих механізмів реалізації захисної дії ліпосомальних форм сандостатину та даларгіну за умов експериментального панкреатиту, запропоновано принципово новий ефективний метод його фармакологічної корекції за допомогою вживання розроблених ліпосомальних форм аналогів нейропептидів.

1.

2.

3.

4.

ліпосомального даларгіну перевищувала таку ж у вільного даларгіну.

5.

6.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Влияние аналога энкефалинов на нейрогуморальную регуляцию при остром панкреатите // Вісник морської медицини. –1999. -№2. –С.100-101 (у співавт. з Демидовим В.М., Торбинським А.М., Торбинським А.А.).

2. Нейрогуморальные нарушения при остром панкреатите и их коррекция // Анналы хир. гепатол. -1999. -Т.4, №2. -С.283-284 (у співавт. з Марковим В.О.).

3. Антиоксидантні ефекти ліпосомального сандостатину у щурів за умов моделі хронічного стресу // Одеський медичний журнал. –2000. -№1. –С. 27-29 (у спів-

авт. з Демидовим В.М., Марковим В.О.).

4. К вопросу о механизмах реализации корригирующего действия липосомальных форм аналогов нейропептидов в экспериментальных условиях различных форм патологии органов брюшной полости при модуляции активности симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы // Архив клин. и эксперим. медицины. –2000. –Т.9, №1. –С.119-122 (у співавт. з Демидовим В.М., Демидовим С.М., Кошельнік О.Л., Марковим В.О., Лапшиним Д.Є.).

5. Патогенетичне обгрунтування застосування ліпосомальної форми сандостатину в комплексній терапії гострого експериментального панкреатиту // Львівський медичний часопис. –2000. –Т.6, №2. –С.45-48 (у співавт. з Демидовим В.М., Дмитрієвим Б.І., Торбинським А.М., Котіком Ю.М.).

6. Экспериментальное подтверждение эффективности липосомальной формы даларгина в отношении стабилизации клеточных мембран эритроцитов в условиях хронического панкреатита // Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л.Шупика. –2000. –Книга 4, Вип. 9. –С.979-982 (у співавт. з Торбинським А.М.).

7. Ліпосомальні форми даларгіну та сандостатину сприяють розвиткові позитивного ефекту за умов експериментального гострого панкреатиту у щурів //

Гастроентерологія. –2000. –Вип. 31. –С.80-87 (у співавт. з Демидовим В.М., Демидовим С.М.).

8. Подовження терміну фармакодинамічної дії сандостатину через залучення його до ліпосомальної оболонки // Вісник морської медицини. –2001. -№1(13). –С.125-127.

9. Эффективность аналогов липосомальных форм нейропептидов в отношении изменения липидного состава мембран эритроцитов у крыс с острым экспериментальным панкреатитом // Вісник морської медицини. –2001. -№2(14). –С.113-117 (у співавт. з Демидовим В.М.).

10. Антиоксидантна ефективність ліпосомальних форм сандостатину і даларгіну в тканині підшлункової залози у щурів при лікуванні експериментального панкреатиту // Одеський медичний журнал. –2001. -№5. –С.6-9.

11. Дослідження ролі активування синтезу окису азоту у патогенезі експериментального гострого панкреатиту у щурів // Тез. доп. VIII Конгресу СФУЛТ. –Львів-Трускавець, 2000. –С.444 (у співавт. з Демидовим В.М., Демидовим С.М.).

12. Хирургическая тактика лечения хронического панкреатита, осложненного псев-

докистой // Хирургия поджелудочной железы на рубеже веков. –Матер. Россий-ско-германского симп. –М., 2000. –С.46-47 (у співавт. з Демидовим В.М., Марковим В.О.).

13. Застосування нової фармакологічної сполуки – ліпосомального сандостатину при лікуванні експериментального панкреатиту // Фармакологія 2001 – крок у майбутнє. –Тези ІІ Нац. з’їзду фармакологів України. –Дніпропетровськ, 2001. –С.267.

АНОТАЦІЯ

Ціповяз С.В. Ефективність ліпосомальних форм аналогів нейропептидів при лікуванні експериментального панкреатиту (експериментальне дослідження). - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05. - фармакологія. - Одеський державний медичний університет МОЗ України, Одеса, 2002.

В дисертації досліджується ефективність ліпосомальних форм сандостатину та даларгіну за умов гострого експериментального панкреатиту у щурів з метою розробки методики комплексної патогенетичної корекції даної патології.

Показано, що розвиток ГЕП у щурів супроводжується зростанням активності нейтральних і кислих протеаз, збільшенням концентрації 1-антитрипсину і зниженням концентрації білка в крові. Це супроводжується інтенсифікацією процесів ПОЛ і пригніченням антирадикального захисту в тканині підшлункової залози і печінки. Зазначене є можливими патогенетичними механізмами формування ГЕП.

За нормалізацією показників активності системи протеолізу, виразності процесів

ліпопероксидації та антирадикального захисту в тканині підшлункової залози і печінки, показниками резистентності мембран еритроцитів, а також за вмістом загального холестерину і загальних фосфоліпідів