НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії

Дубицька Лідія Петрівна

УДК 579.873.71.

Конструювання та селекція штаму Streptomyces peucetius subsp. caesius - продуцента даунорубіцину та доксорубіцину

03.00.15 - генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2002

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у Львівському національному університеті ім. Івана Франка. Міністерство освіти і науки України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент

Федоренко Віктор Олександрович,

Львівський національний університет ім. І. Франка,

завідувач кафедри генетики та біотехнології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

член – кореспондент НАН України

Мацелюх Богдан Павлович,

Інститут мікробіології та вірусології

ім. Д. К. Заболотного НАН України (м. Київ),

завідувач відділу генетики мікроорганізмів;

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

Карпова Ірина Сергіївна.

Інститут молекулярної біології і генетики

НАН України (м. Київ), старший науковий

співробітник.

Провідна установа: Національний університет імені Т.Г. Шевченка, кафедра загальної і молекулярної генетики, Міністерство освіти і науки України, м. Київ.

Захист відбудеться “19” листопада 2002 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01. Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАНУ.

Автореферат розісланий 17 жовтня 2002 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Науменко В. Д.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Одним з важливих та перспективних завдань вітчизняної біотехнології є виробництво ефективних протипухлинних антибіотиків. Їх потреба в Україні висока у зв'язку із постійним зростанням числа онкологічних захворювань. Висока вартість цих препаратів насамперед зумовлена відносно низькою антибіотичною активністю штамів – продуцентів та їх здатністю синтезувати складні суміші кінцевих продуктів, серед яких лише декілька становлять терапевтичну цінність. Це безпосередньо стосується і штамів Streptomyces peucetius – продуцентів даунорубіцину (DNR) та доксорубіцину (DXR)– антрациклінових антибіотиків, які широко використовуються в хіміотерапії онкологічних захворювань. Тому існує потреба в розробці методів конструювання і селекції стабільних, високопродуктивних штамів S. peucetius, які б переважно утворювали необхідні метаболіти антибіотичної природи.

Високий рівень продукції антибіотиків актиноміцетами обумовлений не лише експресією генів біосинтезу, але й залежить від генів резистентності як до власного, так і до інших антибіотиків. [Чиненова и др., 1996; Grameri et al., 1986]. Однією з можливостей отримання високоактивних штамів є клонування генів біосинтезу та регуляторних генів в штами – продуценти [Scotti et al., 1996]. Велике практичне значення має ідентифікація та вивчення ампліфікованих послідовностей ДНК, оскільки вони є важливим елементом для створення інтегративних векторів із зміненою кількістю копій на геном при конструюванні високоактивних штамів – продуцентів антибіотиків.

Відсутність достатньої бази даних у цьому напрямку обмежує можливості розробки методів підвищення біосинтезу DNR та DXR штамами – продуцентами.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами Дана робота виконувалась у рамках науково – дослідної теми БГ-356Д “Конструювання і селекція штаму Streptomyces peucetius – продуцента протипухлинного антибіотика рубоміцину” (номер державної реєстрації 0197U015671). БГ-12б “Розробка методів генетичного та генно – інженерного конструювання штамів актиноміцетів – продуцентів протиракових антибіотиків” (номер державної реєстрації 0197U018080). Дана робота також частково підтримана грантами INTAS - Україна 95 - 0020 та BMBF0311308.

Мета та завдання дослідження. Мета роботи полягала у розробці методів генетичного та генно – інженерного конструювання штамів S. peucetius - продуцентів DNR та DXR. Порівнянні ознак стійкості у цих штамів та у інших штамів – продуцентів протипухлинних антибіотиків. Дослідженні зв'язку між антибіотикорезистентністю та антибіотичною активністю у штамів S. peucetius. Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

- вивчити антибіотичну активність та стійкість штамів S. peucetius ATCC 29052 та S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952 до антибіотиків з різним механізмом дії і порівняти ознаки стійкості у цих штамів та у S. globisporus 1912 – продуцента ангуциклінового антибіотика ландоміцину Е;

- дослідити вплив глюкозної катаболітної репресії на ріст, стійкість до антибіотиків та антибіотичну активність штаму S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952;

- створити і дослідити колекцію мутантів штамів S. peucetius, стійких до антрациклінових антибіотиків (даунорубіцину та доксорубіцину), рифампіцину та хлорамфеніколу;

- дослідити зв'язок між антибіотикорезистентністю і синтезом антрациклінів у отриманих мутантів та оцінити їх перспективність в селекції штаму S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952;

- вивчити можливості утворення DXR з екзогенно доданого до культурального середовища DNR, DNRr- та DXRr- мутантами штаму S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952, а також рекомбінантними штамами S. lividans TK24 та S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952, які несуть гени S. griseus: cpx (кодує цитохром Р-450 подібний фермент) та dnrI (позитивний активатор генів біосинтезу та стійкості до антрациклінів).

- Обєкт дослідження: Штами: S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952; S. peucetius ATCC 29050.

- Предмет дослідження: Звязок між антибіотикорезистентністю та біосинтезом антрациклінів. Конструювання високопродуктивних продуцентів даунорубіцину та доксорубіцину.

- Методи дослідження: Генетичні, мікробіологічні, біохімічні та молекулярно – біологічні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне дослідження впливу мутацій стійкості до DNR, DXR, рифампіцину (RIF) та хлорамфеніколу (CML) у S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2 на антибіотичну активність та стійкість до антибіотиків з різним механізмом дії. Встановлено, що одним з механізмів стійкості до DNR, є його модифікація з утворенням менш токсичний для даного штаму – DXR. Доведено, що утворення DXR з DNR можна досягнути шляхом введення генів cpx та dnrI S. griseus IMET 3339 у штам 27952-2, що також спричинює зростання рівня синтезу антрациклінів.

Показано перспективність пошуку продуцентів DXR серед DNRr і N-метил-N/-нітро-N-нітрозогуанідин (НГ) – індукованих CMLr – мутантів штаму 27952-2, тоді як DXRr – мутанти перспективні для відбору продуцентів обох антибіотиків.

Отримано НГ – індуковані мутанти штаму 27952-2, здатні рости на повноцінних середовищах з 2 – 5 % глюкози (glr – мутанти), на яких відсутній ріст вихідного штаму. Показано, що у таких мутантів зростає антибіотична активність та стійкість до DNR i DXR, і вони є перспективними для селекції даного штаму.

Науково – практичне значення результатів. Розроблено підходи для селекції штамів S. peucetius з підвищеною антибіотичною активністю з використанням мутацій стійкості до DNR, DXR, CML та до підвищених концентрацій глюкози в поживному середовищі. На основі цього отримано варіанти, які є матеріалом для подальшого конструювання високоактивних штамів – продуцентів DNR та DXR.

Встановлено можливість перетворення DNR в DXR рекомбінантними штамами S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2 pIJ486 cpx+, dnrI+ (позначений нами як pIJ486+) та DNRr – мутантами штаму 27952-2, що є важливим для отримання більш цінного [Булкина, 1991] у порівнянні з DNR, хіміотерапевтичного антибіотика – DXR .

Ідентифіковані ампліфіковані послідовності серед DNRr – мутантів можуть бути використані для конструювання векторів з метою створення генно – інженерного продуцента DNR і DXR, а мутації стійкості до антибіотиків в якості маркерів при картуванні та інших генетичних маніпуляціях із штамом S. peucetius.

Особистий внесок здобувача. Під час виконання дисертаційної роботи автором особисто виконано весь обсяг експерементальних досліджень. Запропоновано селекцію високоактивних штамів за якісним та кількісним вмістом DNR та DXR. Підібрано та налагоджено методики, щодо визначення якісного та кількісного вмісту цих антибіотиків а також вмісту С-14 гідроксилази (забезпечує перетворення DNR у DXR). Передбачено та показано, що підвищена резистентність до DNR, зумовлена, також, за рахунок ферментативного перетворення більш токсичної сполуки (DNR) в менш токсичну та більш комерційно і терапевтично цінну сполуку – DXR. Проведено статестичне опрацювання та проаналізовано одержані результати досліджень, сформульовано основні висновки та підготовлено до друку публікації.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались на міжнародних конференціях для студентів і молодих науковців “Conference on genetics and molecular biology” (Львів, 2000), “Medicine at the turn of Millenia” (Lublin, Poland, 2000), “Conference on molecular biology and genetics” на ІІ з'їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000), на наукових конференціях Львівського університету (1997 - 1998 рр.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано п'ять статей в профільних наукових журналах та тези чотирьох доповідей. Отримано рішення про видачу деклараційного патенту на винахід від 6 серпня 2002 р. по заявці № 2001031765 БГ-3560 від 16.03.2001.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини (Матеріалів та методів досліджень, результатів та їх обговорення), висновків та списку використаних джерел, що охоплює 320 найменувань. Роботу викладено на 165 сторінках машинописного тексту і проілюстровано 47 рисунками та 35 таблицями.

основний зміст

Матеріали та методи

Бактеріальні штами. У роботі використані штами S. peucetius ATCC 29050 і S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952 із музею культур РНЦА (м. Москва, Росія) та їх мутанти, отримані автором в даній роботі. Використано також штами S. globisporus 1912 (отриманий з Інституту мікробіології та вірусології НАНУ м. Київ) та S. lividans TK24. В експериментах по клонуванню генів як реципієнти використовували S. lividans TK24. Як вектор для клонування ДНК в актиноміцетах використовували плазміду pIJ486.

Середовища. Для вирощування штамів актиноміцетів використовували середовища Чапека, ПКА -5, соєве, кукурудзяне (КС) та вівсяне (ВС) [Гаузе и др., 1983]. Визначення рівня та спектрів стійкoсті штамів до антибіотиків проводили на мінімальному середовищі (МС) [Hopwood et al., 1985.]. Для визначення антибіотичної активності штаму S. peucetius використовували КС та соєве середовище [Гаузе и др., 1983]. Тест - культуру B. mycoides НВ2 вирощували на сухому поживному середовищі для культивування мікроорганізмів (НПО "Питательные среды", Росія). Для отримання протопластів, виділення сумарної та плазмідної ДНК штами вирощували в рідких середовищах YEME та TSB. Регенерацію та злиття протопластів проводили на середовищі R2YE [Hopwood et al., 1985].

Визначення резистентності штамів до антибіотиків та відбір антибіотик резистентних мутантів проводили як описано [Настасяк и др., 1990].

Мутагенну обробку клітин та виділення індукованих мутантів проводили за методикою описаною [Hopwood et al., 1985].

Отримання, злиття та трансформацію протопластів проводили відповідно до методики, описаної [Hopwood et al., 1985.].

Визначення антибіотичної активності штамів S. peucetius проводили біологічним методом дифузії в агар з тест – культурою B. mycoides НВ2.

Тонкошарову хроматографію метаболітів, синтезованих мутантами S. peucetius проводили за методом [Шаршунова и др., 1980].

Визначення кількості антрациклінових сполук проводили за методами, описаними [Segura et. al., 1997.; Dornberger et al., 1985].

Визначення концентрації цитохром Р-450 вмісного ферменту проводили за методикою [Omura et al., 1964].

Вміст білку у екстрактах визначали за методом Лоурі [Lowry et al. 1951].

Визначення перетворення екзогенно доданого DNR у DXR проводили методами описаними [Dickens et al., 1996; Dornberger et al., 1985].

Утилізацію глюкози штамами S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2 визначали ферментативним методом за допомогою діагностичного набору “Діаглюк”.

Виділення плазмідної і сумарної ДНК проводили за модифікованим методом [Мазин и др., 1990.; Hopwood et. al., 1985].

Гідроліз сумарної і плазмідної ДНК ендонуклеазами рестрикції проводили за методом описаним [Hopwood еt al., 1985].

Електрофорез ДНК в агарозному гелі проводили в горизонтальних пластинах 0,7 - 1,0 % (м/об) агарозного гелю за методом [Маниатис и др., 1984].

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою комп'ютерної програми ''Statgraphics''. Кореляційний аналіз проводили, як описано [Жукова и др., 1978].

Результати дослідження та їх обговорення

Незважаючи на значний прогрес у вивчені шляху біосинтезу DNR і DXR та його генетичного контролю ці антибіотики все ще синтезуються у незначних кількостях. Враховуючи їх терапевтичну цінність та можливість використання в якості субстрату для отримання нових протипухлинних сполук, інтенсивно ведуться роботи щодо підвищення рівня біосинтезу цих антибіотиків.

Об'єктом проведених досліджень були штами – продуценти протипухлинних антибіотиків: S. peucetius ATCC 29050 (позначений нами як 29050), S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952 (позначений як 27952) та S. globisporus 1912 (позначений як 1912). Штами S. peucetius здатні синтезувати антрациклінові антибіотики, серед яких клінічно важливі – даунорубіцин (DNR) та доксорубіцин (DXR). Штам 1912 є продуцентом іншого полікетидного антибіотика протипухлинної дії – ландоміцину Е.

1. Характеристика штамів S. peucetius ATCC 29050 та S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952 за антибіотичною активністю та стійкістю до антибіотиків

На МС та середовищі Чапека досліджувані нами штами характеризуються морфологічною гетерогенністю. Штам 29050 утворює 28 % клонів із білим забарвленням спор (морфологічний тип 29050-1) та 72 % із сірим забарвленням спор (морфологічний тип 29050-2). Штам 27952 на вказаних середовищах утворює три типи колоній: 27952-1 – з білим (21 % клонів), 27952-2 – з сірим (48 % клонів) і 27952-3 – із світло – сірим забарвленням спор (31 % клонів). 16 % клонів штаму 1912 утворювали білі спорулюючі колонії (морфологічний тип 1912-1), а решта – сірі олігоспорові колонії (морфологічний тип 1912-2).

У 160 та 194 незалежних клонів відповідно штамів 29050 та 27952 визначено рівень загальної антибіотичної активності за здатністю до пригнічення росту тест – культури B. mycoides HB2 (табл. 1). Виявлено, що штам 29050-2 володіє вищою антибіотичною активністю, мінливістю ознаки антибіотикоутворення та часткою “плюс” – варіантів, порівняно з 29050-1. Штами з високою частотою (відповідно 34,3 та 30,8 %) утворюють варіанти позбавлені антибіотичної активності, а розподіл клонів за індексами продуктивності не підлягає нормальному розподілу, що свідчить про порушення в генах біосинтезу антрациклінів.

Таблиця 1

Характеристика мінливості антибіотичної активності штамів S. peucetius ATCC 29050 та S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2.

Показники Штам

29050-1 29050-2 27952-1 27952-2 27952-3

Чисо досліджених клонів, n 53 107 54 89 51

1Середнє значення антибіотичної активності, % 100 109,0±2,1 2100 95,6±2,8 106,2±3,2

Середнє квадратичне відхилення, s 0,2 0,3 1,1 1,7 1,3

Частка "мінус"- варіантів, % 34,3 30,8 0,0 0,0 0,0

Частка "плюс"- варіантів, % 0,0 2,8 0,0 1,1 0,0

Коефіцієнт варіації СV,% 14,1 19,7 19,7 31,6 23,8

Примітки:

1. За 100% прийнато середнє значення антибіотичної активності штамів 29050-1 та 27952-1, відповідно.

2. Антибіотична активність 27952-1 в 3,7 рази перевищує активність 29050-1.

Середні значення антибіотичної активності штамів 27952-1, 27952-2 та 27952-3, відповідно в 3,7; 3,6 та 4 рази перевищують такі значення для 29050-2. Найвище середнє значення антибіотичної активності виявлено у 27952-3. Однак, тільки серед клонів 27952-2 виявлено “плюс” – варіанти (1,12 %). Він характеризувався також вищим значенням мінливості ознаки антибіотикоутворення порівняно з іншими досліджуваними штамами.

Лише штами 27952-1, 27952-2 і 27952-3 синтезують хроматографічно тестовані антрациклінові сполуки, в тому числі DNR та DXR (табл. 2). Поряд з неідентифікованими сполуками у екстрактах 30,4 % клонів штаму 27952-2 виявлено DXR, у 26,1 % - DNR, а у 13 % - DNR та DXR. Під час аналізу клонів штаму 27952-1, DXR виявлено у 21,4 %, а у 23,5 % – DNR. Тоді, як у 57,1 % клонів штаму 27952-3 виявлено DNR та DXR, у 10,7 % - DNR, і тільки у 3,6 % - DXR.

Таблиця 2

Якісний склад антрациклінових сполук, які виявлені в екстрактах морфологічних варіантів штамів S.peucetius АТСС 29050 та S.peucetius subsp. caesius АТСС 27952.

Ідентифіковані антрациклінові сполуки Число штамів у яких виявлено дану сполуку

29050-1 29050-2 27952-1 27952-2 27952-3

DXR, *НІС 0 0 9 7 1

DNR, НІС 0 0 5 6 2

DXR, DNR,НІС 0 0 0 3 16

DNR, 13-DHD, НІС 0 0 5 0 0

13-DHD, НІС 0 0 9 0 0

НІС 0 0 14 7 9

Кількість перевірених штамів 47 38 42 23 28

Примітка.* НІС– Неідентифіковані сполуки, що розділяються в системі розчинників CHCl3:CH3COOH:C2H5OH:H2O (80:20:16:6).

Порівняльна характеристика ознак стійкості до антибіотиків у штамів – 29050, 27952 та 1912 показала, що як і більшість актиноміцетів [Hotta et al., 1983; Hotta et al., 1982], вони володіють природною множинною резистентністю до ряду антибіотиків (табл. 3). Для них характерна стійкість до b - лактамних антибіотиків та пептидного антибіотика поліміксину М. Проте штам 27952 чутливіший до рифампіцину, макролідних антибіотиків та тетрацикліну порівняно з 29050 та 1912. Штам 1912-2, з вищою антибіотичною активністю [Дубицька та ін., 2000] стійкіший до еритроміцину, стрептоміцину та тетрацикліну і чутливіший до рифампіцину порівняно з 1912-1. Така ж особливість характерна і для штаму 29050-2, антибіотична активність якого є вищою порівняно з 29050-1. Проте між штамами 29050-2 та 29050-1 не виявлено відмінностей у стійкості до тетрацикліну і менш виражені відмінності у стійкості до еритроміцину та канаміцину. Штам 27952-2, який синтезує в основному кінцевий продукт біосинтезу DXR – стійкіший до рифампіцину та еритроміцину, порівняно з 27952-1 та 27952-3.

Таблиця 3

Спектри стійкості штамів S. globisporus 1912, S. peucetius ATCC 29050 та S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952 до антибіотиків.

Антибіотик мкг/диск Діаметр зони пригнічення росту штаму (мм)

S. globisporus 1912 S. peucetius АТСС 29050 S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952

1 2 1 2 1 2 3

Eритроміцин 15 9,0± 0,0 16,0±1,0 13,0±1,5 8,7±0,3 37,7±3,7 27,5±6,5 30,3±4,7

Олеандоміцин 15 15,0±1,5 17,7±2,0 12,0±1,2 9,7±0,3 38,7±3,7 33,0±2,0 34,7±2,4

Лінкоміцин 15 11,3±1,9 13,0±0,0 27,7±0,3 20,7±4,1 17,5±7,5 16,5±1,5 16,7±1,7

Стрептоміцин 30 36,7±2,7 33,7±9,8 36,0±2,1 25,0±2.9 31,3±4.3 28,0±7,0 29,7±4.2

Мономіцин 30 23,5±1,0 27,7±6,3 29,7±4,5 21,3±3,8 25,6±6,2 25,5±7,5 26,7±4,7

Канаміцин 30 23,7±0,2 33,7±7,3 27,3±0,6 24,3±4,8 26,3±3,9 20,0±1,0 23,7±1,6

Гентаміцин 10 18,5±2,0 26,0±4,6 20,0±0,0 19,0±2,7 15,5±0,5 18,5±4,5 18,3±2.9

Тетрациклін 30 31,3±0,7 13,3±0,9 20,3±4.3 20,3±3,2 30,0±2,9 32,5±9,5 32,0±4,2

Рифампіцин 5 18,2±0,7 28,0±0,6 0 0 43,0±1,0 34,5±0,5 39,7±0,9

Хлорамфенікол 30 20,0±0,6 14,3±0,7 25,3±1,5 23,7±0,7 23,3±1,5 18,0±0,0 25,3±3,4

Ампiцилін 10 0 0 0 0 0 0 0

Карбеніцилін 25 0 0 0 0 7,3±4,1 11,0±1,0 0

Оксацилін 10 0 0 0 0 0 0 0

Бензилпеніцилін 10 0 0 0 0 0 0 0

Цефалотин 15 0 0 0 0 0 0 0

Поліміксин М 30 8,6±0,4 10,0±1,2 10,0±0,6 9,3±0,3 9,0±0,6 9,0±1,0 9,7±0,7

Ристoміцин 30 23,5±0,3 28,0±1,0 28,3±1,2 24,0±0,6 30,7±0,7 23,5±1,5 27,3±3,5

Незважаючи на те, що штами 29050 та 27952 є продуцентами DNR та DXR, їх стійкість до власних антибіотиків значно нижча, ніж до актиноміцину D (Act D). Якщо ACT D повністю пригнічує ріст цих штамів (на МС) лише у концентрації 200 мкг/мл то DNR та DXR – у концентрації 30 та 50 мкг/мл. Хоч DNR та DXR є продуктами одного шляху біосинтезу та дуже близькі за будовою [Dickens et al. 1997; Hutchinson et al., 1997], всі досліджені штами мають вищі рівні стійкості до DXR, ніж до DNR. Це, очевидно, пояснюється одночасним функціонуванням декількох механізмів стійкості до власного антибіотика, що характерно для багатьох штамів актиноміцетів [Hutchinson et al., 1997; Сазыкина и др., 1986].

Штам 1912-2 з вищою антибіотичною активністю, стійкіший до DNR та DXR, однак чутливіший до ACT D, порівняно з штамом 1912-1. Проте, серед варіантів штаму 27952 вищою стійкістю до ACT D та DNR володіє штам 27952-1 з середнім рівнем антибіотичної активності, а серед варіантів штаму 20050- штам 29050-1 з низьким значенням антибіотичної активності. Штам 29050-1 також стійкіший і до DXR тоді, як рівні стійкості до цього антибіотика між морфологічними типами штаму 27952 не відрізнялись.

Отримані дані антибіотико-резистентності важливі для конструювання, відбору, підтримання стабільності високоактивних продуцентів та їх генетичного аналізу.

Подальшу селекційну роботу проводили із штамом 27952-2, оскільки він володіє вищими значеннями коефіцієнту варіації та часткою утворення “плюс” – варіантів, а у 43,4 % досліджених клонів виявлено найбільш цінний в терапевтичному відношенні антибіотик – DXR.

2. Вплив N-метил-N/-нітро-N-нітрозогуанідину, ультрафіолетового опромінення, регенерації та злиття протопластів на антибіотичну активність S. peucetius ATCC 29050 та S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952

Проаналізовано 825 та 657 незалежних клонів штамів 29050-2 та 27952-2, що пройшли різні мутагенні обробки. Встановлено, що опромінення ультрафіолетом (УФ) (виживає 0,1 % клонів) викликає зростання кількості клонів, антибіотична активність яких не перевищує 50 % активності вихідного штаму і приводить до зниження середніх значень антибіотичної активності штамів.

Найбільш ефективною для селекції штамів 27952-2 та 29050-2 виявилась обробка НГ (за якої виживає відповідно 0,1 ± 0,05 та 0,9 ± 0,1 % спор). Така обробка приводить до найвищих середніх значень антибіотичної активності та найвищої кількості “плюс” – варіантів.

Регенерація протопластів штаму 27952-2 супроводжується збільшенням частоти клонів з низькими значеннями антибіотичної активності, що не перевищують 100 % активності вихідного штаму, а після злиття протопластів зростає кількість клонів з антибіотичною активністю, близькою до її середнього значення у вихідному штамі.

Відібрано 48 незалежних варіантів штаму 27952-2 (після мутагенної обробки) з антибіотичною активністю вищою, ніж середнє значення активності вихідного штаму. У екстрактах таких мутантів виявлено DNR та DXR, а спектр синтезованих антрациклінів у них був як ширшим, так і вужчим, ніж у штаму 27952-2.

Похідні штаму 29050 з підвищеною антибіотичною активністю не синтезують сполук червоного кольору, але містять метаболіти жовтого кольору. Очевидно, дані штами дефектні по dnrF, який відповідає за С-11 гідроксилювання антрациклінів, що надає їм червоного забарвлення та вищої антибіотичної активності порівняно з їх С-11 дегідро похідними [Filippini et al., 1995].

Отже, метод обробки спор НГ виявився найефективнішим для селекції штаму 27952-2 на підвищення антибіотичної активності.

3. Вплив глюкози на антибіотичну активність та стійкість до антибіотиків у S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2 та його мутантів

. Формування повітряного міцелію штаму 27952-2 та його антибіотична активність інгібуються на КС та мінімальному середовищі з крохмалем (КМС), що містять більше 0,1 % глюкози. На КС, КМС та у середовищі YEMY, що містили більше 2 % глюкози, ріст культури повністю відсутній. У рідкому МС з 1 – 2 % глюкози виявлено найкращий ріст даного штаму, а найгірший - у МС з 0,5 % глюкози. У рідкому безглюкозному середовищі YЕМY, штам 27952-2 ріс значно краще, ніж у безглюкозному рідкому МС.

Відібрано 36 НГ- індукованих мутантів штаму 27952-2 здатних рости на КС, що містить глюкозу у концентрації більше, ніж 2%. У 6 з них, позначених як glr1 - glr6, рівень антибіотичної активності вищий, ніж у вихідного штаму, як на безглюкозному КС, так і на КС з 1 – 5 % глюкози (рис.1). Антибіотична активність у таких мутантів значно менше, ніж у вихідного штаму, пригнічується глюкозою. Антибіотична активність 12 glr- мутантів була на рівні вихідного штаму, а решти 18 glr- мутантів - в 1,6 - 2,5 рази нижчою.

Висока антибіотична активність мутантів glr1 - glr6 зумовлена підвищеним синтезом антрациклінів. Їх сумарний рівень в 1,6 - 3,1 рази вищий, ніж у вихідного штаму (рис. 2). Однак тільки мутанти glr1 і glr2 утворюють DNR та DXR. Під час вирощування в МС, в якому глюкоза є єдиним джерелом вуглецю, штами glr1 і 27952-2 швидше за інші використовують глюкозу та утворюють більше біомаси. Інші glr- мутанти утилізують глюкозу повільніше, ніж вихідний штам 27952-2 (рис. 3. А). Штами glr1, glr3 і glr6 нагромаджують в КМС більшу біомасу, ніж штам 27952-2, хоч рівень утилізації ними глюкози нижчий (рис. 3. Б). Це свідчить про їх здатність використовувати інші джерела вуглецю при наявності глюкози в середовищі, тоді як у вихідного штаму 27952-2 глюкоза, очевидно, репресує засвоєння інших джерел вуглецю, хоча і сама слабо використовується для накопичення біомаси.

Рис.1. Залежність антибіотичної активності штаму S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2 та його мутантів від концентрації глюкози в середовищі. За віссю абсцис – загальна антибіотична активність, %. За віссю ординат – концентрація глюкози в середовищі КС, %. За 100 % прийнято антибіотичну активність штаму S. рeucetius subsp. caesius ATCC 27952-2 на середовищі без глюкози. Рис.2. Рівень синтезу антрациклінів у S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2 та його мутантів (glr1 - glr6). За віссю абсцис – назва штаму. За віссю ординат– концентрація антрациклінів, мкг/мг білка.

Рис. 3. Утилізація глюкози та накопичення біомаси штамом S. peucetius subsp. caesius АТСС 27952-2 і його мутантів під час вирощування на середовищах МС (А) та КМС (Б). За віссю абсцис – час вирощування штамів (год). За віссю ординат: I- концентрація глюкози, ммоль/л. ІІ- кількість біомаси, мкг/л. 1- штам 27952-2; 2- glr1; 3- glr3; 4- glr4.

Ми порівняли рівні стійкості штамів 27952-2 і його мутантів glr1, glr2 і glr3 до антибіотиків з різним механізмом дії на МС з 0,1 - 5 % глюкози та на КС з 0 – 1 % глюкози. glr – мутанти чутливіші, ніж вихідний штам до RIF. Штам 27952-2 та glr – мутанти стійкіші до еритроміцину і лінкоміцину та чутливіший до тетрацикліну на КС з 0,5 - 1,0 % глюкози, ніж на цьому ж середовищі без глюкози. Стійкість штаму 27952-2 і його glr – мутантів до DNR та DXR не змінювалась залежно від концентрації глюкози в МС. Проте рівень стійкості мутантів до цих антибіотиків вищий, ніж у 27952-2. В той же час, на повноцінному безглюкозному середовищі КС штам 27952-2 і glr - мутанти чутливіші до DNR і DXR, ніж на цьому ж середовищі з 0,5 і 1 % глюкози.

Штам 27952-2, очевидно, має дефекти по метаболізму глюкози, які сповільнюють, але не припиняють її утилізацію. Глюкоза в свою чергу, репресує засвоєння інших джерел вуглецю штамом 27952-2. glr – мутанти з підвищеною антибіотичною активністю використовують глюкозу повільніше, ніж вихідний штам, а біосинтез антрациклінів у цих мутантів менш підлягає глюкозній репресії. Тому отримання glr – мутантів може бути одним з етапів селекції штаму S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2 на підвищений синтез антрациклінів.

4. Отримання та характеристика мутантів S. рeucetius стійких до антибіотиків

Досліджено виникнення спонтанних та індукованих НГ RIFr – і CMLr – мутантів штаму 27952-2. У 123 CMLr- та 209 RIFr- мутантів визначено рівні стійкості до цих антибіотиків, а у 6 CMLr- та 5 RIFr – мутантів визначено спектри стійкості до антибіотиків з різним механізмом дії. Усі CMLr – мутанти стійкі до еритроміцину, два з них чутливі до тетрацикліну, а два – до стрептоміцину. Усі RIFr – резистентні мутанти стійкіші до еритроміцину та стрептоміцину, а два до олеандоміцину. У 192 та 239 незалежних RIFr – та CMLr – мутантів визначено рівні антибіотичної активності. Антибіотична активність 67,6 % RIFr- мутантів нижча за середнє значення активності вихідного штаму. У всіх RIFr- мутантів відсутні DNR та DXR.

У 28,6 % (з 14 проаналізованих) спонтанних та 92,8 % (з 28) НГ – індукованих CMLr – мутантів виявлено найбільш цінний в терапевтичному відношенні антибіотик – DXR. Кількість синтезованих антрациклінових сполук у 4 досліджених CMLr – мутантів, відібраних за підвищеною антибіотичною активністю та даними хроматографічного аналізу у 1,7 - 3,2 рази вища, ніж у вихідному штамі. У 2 таких мутантів в 1,8 та 2 рази зростав біосинтез DXR.

Мутанти штамів 29050-2 та 27952-2, стійкі до DXR виникали з вищою (в 103 - 104 рази) частотою, ніж до DNR. Обробка штамів НГ підвищує утворення DNRr – мутантів, але частоти таких мутантів не перевищують рівня спонтанних DXRr – мутантів. У 10 з 13 DNRr – мутантів штаму 27952-2 зростала стійкість до DXR. Серед DXRr – мутантів частка тих, що володіють перехресною стійкістю до DNR нижча (3 з 10).

У 142 спонтанних та 140 НГ – індукованих, незалежних, DNRr – мутантів штаму 29050-2 визначено рівні антибіотичної активності. Антибіотичну активність досліджено також у 783 DNRr- та 745 DXRr – мутантів штаму 27952-2, (спонтанні, НГ – індуковані та отримані після регенерації протопластів). У 65 DNRr - та 68 DXRr – мутантів штаму 27952-2 з підвищеною антибіотичною активністю проведено дослідження якісного складу синтезованих антрациклінів (табл. 4). Серед DNRr- мутантів були такі, в екстрактах яких виявлено лише DXR, і з огляду на це вони перспективні для подальшої селекційної роботи. В екстрактах більшості спонтанних та всіх НГ- індукованих DXRr – мутантів виявлено як DNR, так і DXR. У більшості антибіотично активних DNRr - та DXRr – мутантів отриманих після регенерації протопластів штаму 27952-2, не виявлено DNR та DXR.

Таблиця 4.

Якісний склад антрациклінових сполук, які виявлені в екстрактах DNRr- та DXRr - мутантів штаму S. peucetius subsp. coesius АТСС 27952-2.

Ідентифіковані антрациклінові сполуки Число штамів, у яких виявлено дану сполуку

Спонтанні НГ- індуковані Отримані після протопластування

Клони 27952-2 DNRr DXRr Клони 27952-2 DNRr DXRr Клони 27952-2 DNRr DXRr

DXR 0 5 0 0 6 0 2 0 0

DNR 0 0 0 0 0 0 0 1 0

DXR і DNR 0 4 8 0 0 2 0 0 0

DXR і 13-DHD 0 3 0 0 0 0 0 0 0

*НІС 7 2 1 9 0 3 2 16 7

DXR, НІС 7 5 1 1 0 0 2 0 1

DNR, НІС 6 0 8 15 0 0 0 1 0

DXR DNR, НІС 3 2 7 7 8 9 0 0 3

DXR, 13-DHD, НІС 0 10 0 0 0 0 4 0 0

DNR, 13-DHD, НІС 0 0 0 1 0 0 1 0 0

DNR, DXR, 13-DHD, НІС 0 2 3 1 0 1 3 0 0

13-DHD, НІС 0 0 0 2 0 0 0 0 14

Кількість перевірених штамів 23 33 28 39 14 15 14 18 25

Примітка.* НІС-сполуки які розділяються в системі CHCl3 :CH3COOH:C2H5OH:H2O (80:20:16:6).

У 15 DNRr- та DXRr – мутантів з високою антибіотичною активністю і здатністю синтезувати DNR та DXR досліджено кількість біосинтезу антрациклінів (рис. 4). Вони переважали вихідний штам за сумарною кількістю утворених антрациклінів (у 1,8 - 10,6 рази), DNR (в 2,6 - 28,3 рази) та DXR (в 1,6 – 20,7 рази). Максимальний рівень біосинтезу характерний для мутанта dxr109.

Рис. 4. Вміст антрациклінових сполук у міцелії DNRr- та DXRr - мутантів штаму S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2. За віссю ординат– кількість синтезованих антрациклінів, мкг/мг білка. За віссю абсцис– тестовані штами. 1- загальна кількість антрациклінів, 2- кількість DNR, 3- кількістьDXR.

У 4 DNRr – та 8 DXRr – мутантів досліджено здатність утворювати DXR з доданого DNR. Оцінено відсоток такого перетворення та визначено вміст цитохром Р-450 ферментів. У більшості dxrr – мутантів на 48 годину культивування його вміст не відрізнявся від вмісту у штаму 27952-2 (табл. 5). У DNRr – мутантів вміст даного ферменту у 5,4 - 36,0 рази вищий, ніж у вихідному штамі. Всі такі мутанти перетворюють 57,7 - 93,4 % DXR з доданого (30 мкг/мл) DNR.

Зростання синтезу DXR серед DNRr – мутантів та відсутність змін у стійкості до DXR серед деяких з них може свідчити про існування вибіркового забезпечення стійкості до DNR. Вищі рівні стійкості штаму 27952-2 до DXR у порівнянні з DNR (рис. 5) дозволили припустити, що DNRr- мутанти набувають підвищеної стійкості до DNR не лише за рахунок функціонування власне генів резистентності до антрациклінів [Hutchinson et al., 1997; Kaur et al., 1997], але і за рахунок активації ферментативної конверсії більш токсичної для штаму сполуки (DNR) в менш для нього токсичну (DXR).

У 100 – 123 клонів 4 DNRr – мутантів перевірено стабільність збереження стійкості до DNR. Клони чутливі до 20 мкг/мл DNR виникали з частотою 2,2 Ч 10-3 – 9,6 Ч 10-4. У 14 таких ревертантів перевірено здатність утворювати DXR з DNR і виявлено, що кількість утвореного DXR у них знижується на 24,2 - 68,3 %, порівняно з вихідними мутантами. Відомо, що активність DoxA забезпечує С-14 гідроксилювання DNR з утворенням DXR. Однак, зростання концентрації DXR в клітинах міцелію інгібує активність DoxA та пригнічує синтез DNR [Walczak et al., 1999]. Тому експорт DXR важливий не лише для забезпечення стійкості, але і для підтримання активності DoxA та продовження синтезу DXR.

Рис. 5. Залежність виживання спор штаму S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2 від концентрації DNR або DXR в МС. За віссю ординат– десятковий логарифм відсотка виживання спор даного штаму. За віссю абсцис– концентрація антибіотика, мкг/мл. 1- виживання штаму на середовищі з DNR; 2- виживання штаму на середовищі з DXR.

Таблиця 5

Концентрація антрациклінів, DNR та DXR а також ефективність перетворення DNR в DXR та кількість цитохром Р-450 ферментів у DNRr – мутантів штаму S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2.

Штам Вміст, мкг/мл білка Перетворення за 24 год. DNR у DXR, % Кількість цитохром Р-450 ферментів, нмоль/мг білка

Антрацикліни DNR DXR

27952-2 11,3±3,4 1,5±1,2 2,4±1,1 0 6,1±1,3

dnr100 15,7±6,3 0 10,0±2,3 93,4±4,2 219,8±8,7

dnr101 12,9±4,6 0 8,1±2,6 86,5±2,3 122,1±6,3

dnr2042 21,8±7,8 5,4±1,95 12,6±3,0 57,7±3,4 33,0±3,4

dnr2043 102,9±10,4 14,2±3,1 45,1±4,9 82,0±1,1 109±4,3

dxr1010 62,4±4,9 15,7±6,2 26,1±7,4 36,5±2,7 21,9±4,1

dxr2025 13,6±4,6 15,6±1,3 3,8±0,9 0 7,85±1,7

З метою вивчення перебудов нуклеотидних послідовностей ДНК проведено електрофоретичний аналіз Вam HI фрагментів 23 DNRr – та 26 DXRr – мутантів штаму 27952-2. ДНК вихідного штаму та DXRr – мутантів не відрізняються за картиною розподілу Вam HI фрагментів. В той же час у геномі усіх DNRr – мутантів виявлені ампліфіковані фрагменти розміром 6 та 7 т.п.н. (рис. 6 A). У сумарній ДНК штамів, здатних до біотрансформації DNR у DXR, виявлено ампліфікацію розміром 3 т.п.н. (2 та 4 доріжки рис. 6 A). На наявність ампліфікованих послідовностей, досліджено також сумарну ДНК 7 DXRr- та 5 DNRr – мутантів штаму 27952-2, отриманих після регенерації протопластів. Серед фрагментів деяких DXRr – мутантів, виявлено ампліфіковані послідовності розміром приблизно 12; 11; 6,5; 3 т.п.н. (доріжка 4, рис. 6 Б).

Рис. 6. Електрофоретичне розділення Bam HI фрагментів ДНК спонтанних та індукованих НГ DNRr (A) – мутантів штаму S. peucetius subsp. сaesius ATCC 27952-2, а також DNRr – та DXRr – мутантів цього штаму отриманих після регенерації протопластів (Б) 1- фаг l (Pst I); А) 2- dnr2043; 3- dnr2041; 4- dnr100; 5- dnr50; 6- штам 27952-2. Б) 2- dxr206; 3- dxr502; 4- dxr1026; 5- dxr303; 6- dnr2025; 7- dxr50; 8- dxr54; 9- штам 27952-2.

Найвищу кількість ампліфікованих фрагментів виявлено у DNRr – мутанта, що пройщов ступінчасту селекцію за стійкістю до DNR (dnr50). Ці дані, однак, не дозволяють визначити прямі кореляції між наявністю ідентифікованих перебудов з фенотипом антибіотичної активності та здатністю мутантів перетворювати DNR у DXR.

5. Отримання та характеристика штамів S. peucetius з підвищеним рівнем біосинтезу DXR за рахунок клонування в ці штами генів cpx та dnrI S. griseus IMET 3339

З метою вивчення можливостей генно – інженерного конструювання штамів з підвищеним синтезом DXR проведено трансформацію штамів S. lividans TK24 та 27952-2, висококопійною рекомбінантною плазмідою pIJ486+, що несе гени S. griseuc ATCC 3339 dnrI (позитивний активатор генів біосинтезу антрациклінів, та стійкості до них [Kim et al., 1992]) та cpx (гомолог doxA) (рис. 7).

У 27952-2 pIJ486 трансформантів зростала кількість антрациклінових сполук (в 1,1 - 1,8 рази), DNR (в 1,3 - 2,3 рази) та DXR (в 1,4 - 2,3 рази), порівняно з синтезом цих сполук у вихідному штамі. Подібні ефекти описані раніше [Kim et al., 1992; Seno, 1990]. Проте причини цього явища не встановлені.

Рівні синтезу антрациклінів, DNR та DXR у 27952-2 pIJ486+ відповідно в 2,5 - 3,9; 4,5 - 5,4 та 3,9 - 7,6 рази вищі, порівняно з синтезом цих сполук штамом 27952-2. А кількість синтезованого DXR у таких штамів в 1,3 - 2,3 рази перевищує кількість синтезованого DNR.

Штами 24 pIJ486+ та 27952-2 pIJ486+, вік яких становить 48 год, на відміну від вихідних штамів та їх pIJ486 трансформантів перетворюють відповідно 20,2 - 22,0 % та 24,0 - 36,3 % доданого DNR (10 мкг/мл) у DXR. Концентрація Cpx у 27952-2 pIJ486+ зростала в 6,5