НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

ФОКІНА Наталія Олександрівна

УДК 547.466 + 577.112.389

РОЗРОБКА МЕТОДІВ СИНТЕЗУ РАЦЕМІЧНИХ ТА ОПТИЧНО АКТИВНИХ ФТОРОВМІСНИХ ?-АМІНОКИСЛОТ

02.00.10 – біоорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі тонкого органічного синтезу Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України

Науковий керівник: Академік НАН України, професор, доктор хімічних наук

Кухар Валерій Павлович

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

завідувач відділу тонкого органічного синтезу,

директор Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор

Колодяжний Олег Іванович

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

завідувач відділу синтезу фізіологічно активних сполук фосфору

доктор хімічних наук

Пашинник Валерій Юхимович

Інститут органічної хімії НАН України,

провідний науковий співробітник відділу органічних сполук сірки

Провідна установа: Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, відділ хімії біологічно активних речовин

Захист відбудеться 25 жовтня 2002 р. о 10 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1).

Автореферат розіслано 25 вересня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вражаючі результати випробувань біологічних властивостей амінокислот стимулюють пошук нових, більш ефективних методів одержання цих сполук. Незважаючи на значні успіхи у синтезі амінокислот, ще існує багато проблем, що потребують свого вирішення. Особливо це відноситься до синтезу оптично активних сполук, бо тільки наявність энантіомерно чистих субстратів відкриває можливість детального вивчення їх біологічної активності і їх подальшого введення в пептидний синтез. Це пов'язано з тим, що біологічна поведінка енантіомерів хіральних сполук дуже різна. В той час, як один енантіомер може мати необхідні біологічні властивості, інший може бути менш активним, не активним або навіть токсичним.

При застосуванні хімічних підходів досягнення високої енантіо- та діастереочистоти продуктів супроводжується високою вартістю хіральних реагентів, що використовуються. У зв'язку з цим розробка методів одержання оптично активних амінокислот з доступних оптично активних природних сполук є особливо актуальною.

Крім численних “чисто” хімічних синтезів останнім часом розвиваються біокаталітичні методи одержання енатіомерних амінокислот, які завдяки доступності мікроорганізмів та ферментів є привабливими для препаративних цілей. В той же час більшість методів біокаталітичного розщеплення ?-амінокислот виявляється не ефективним для одержання оптично активних ?-амінокислот.

Враховуючи зростання інтересу до фторовмісних амінокислот, розвиток препаративних синтетичних методів ефективного та селективного введення фтору або фторовмісних угрупувань для одержання бажаних амінокислот безумовно є актуальним.

Зв'язок роботи з науковими планами та темами. Дослідження проводилось за науково-дослідною темою відділу тонкого органічного синтезу Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України “Асиметричний синтез елементорганічних аналогів природних сполук” (2.1.10.19-93, № держреєстрації 0101U003169).

Мета і задачі дослідження. Метою даного дослідження була розробка методів одержання рацемічних та оптично активних ?-амінокислот на прикладі різних представників цього класу сполук (?,?-дифтор-?-амінокислот, ?-арил-?-амінокислот, ?-фторалкіл-?-амінокислот та ?-алкіл-?-фторалкіл-?-амінокислот). Для досягнення поставленої мети вирішували декілька задач. В межах розробки біокаталітичного методу одержання енантіочистих амінокислот передбачалось з'ясувати можливість використання пеніцилінацилази (EC 3.5.1.11) з Escherichia coli ATCC 9637 для розщеплення ?-амінокислот різноманітної будови та фторовмісних амінокислот у тому числі. Для введення фтору в молекули проміжних сполук в синтезі оптично активних фторовмісних амінокислот передбачалось вивчити підходи основані на використанні CF2-синтону, а також здійснити регіо- та стереоселективне введення фтору із застосуванням фторуючого агенту М-DAST. Крім того, в межах даної роботи передбачалось дослідити можливість проведення реакції Міцунобу з метою введення аміногрупи у фторовмісні синтони.

Об'єкт дослідження – методи одержання амінокислот.

Предмет дослідження – методи одержання рацемічних та оптично активних фторовмісних амінокислот.

Методи дослідження – хімічний синтез (для одержання цільових сполук); стереоспрямований синтез (для одержання оптично активних амінокислот); спектрометрія 1Н, 31P і 19F ЯМР (для визначення та підтвердження структури одержаних сполук); ВЕРХ (для визначення енантіочистоти амінокислот); хроматомасспектрометричний аналіз (для визначення складу реакційних сумішей); рентгеноструктурний аналіз (для визначення абсолютної конфігурації амінокислот).

Наукова новизна одержаних результатів. В ході дослідження всебічно вивчена реакція Міцунобу, як частина запропонованого трьохстадійного шляху, що робить доступними ?,?-дифтор-?-амінокислоти з аліфатичних і ароматичних альдегідів та встановлені фактори, що впливають на ефективність проведення реакції. За допомогою методів 31P і 19F ЯМР досліджені фосфоровмісні інтермедіати та охарактеризовані не зафіксовані раніше побічні продукти реакції Міцунобу. Оскільки дані з використання цієї реакції для синтезу ?-амінокислот в літературі відсутні, а також враховуючи важливість реакції Міцунобу для синтезу і перетворень представників різних класів природних сполук, вивчення цього процесу представляло інтерес.

В ході дослідження розроблені методи синтезу оптично чистих фторовмісних амінокислот з доступного оптично чистого (R)-2,3-О-ізопропіліденгліцеральдегіду. При цьому було вивчено фторування поліфункціональних спиртів і кетонів М-DAST з метою одержання фторовмісних амінокислот та виявлені особливості регіо- і стереоселективного введення атому(ів) фтору в молекули проміжних сполук.

При розробці біокаталітичного методу одержання оптично активних ?-амінокислот досліджено стереоселективність дії пеніцилінацилази (з E.Coli) для розщеплення похідних ?-амінокислот різноманітної будови. Показано, що при ферментативному гідролізі їх N-фенілацетильних похідних стереодиференціація достатньо висока для одержання досліджуваних амінокислот з високою оптичною чистотою.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблений метод одержання рацемічних ?,?-дифтор-?-амінокислот, що включає реакцію Міцунобу як ключову стадію, є практично важливим, оскільки дозволяє в три стадії з хорошими виходами одержувати ?-арил- та ?-алкілдифторамінокислоти з відповідних альдегідів.

Запропоновані методи синтезу оптично чистих моно- та дифторовмісних амінокислот базуються на використанні (R)-2,3-О-ізопропіліденгліцеральдегіду, що легко одержується з природного D-маніту. Перевагою цих методів є те, що цільові амінокислоти отримують шляхом хімічних перетворень дешевої природної сполуки з повним збереженням її оптичної чистоти.

Розроблений біокаталітичний метод одержання оптично активних ?-амінокислот є перспективним як з точки зору переваг комерційної доступності ферментів та економічної привабливості їх практичного використання, так і з точки зору оптичної чистоти одержуваних в результаті амінокислот.

Особистий внесок автора. Експериментальна частина роботи, узагальнення одержаних результатів, аналіз спектральних даних та встановлення будови синтезованих сполук зроблені особисто дисертантом.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були представлені здобувачем на Європейській конференції з біоактивних фторорганічних сполук (Падуя, Італія, 1995 рік), 12-тому Європейському симпозіумі з хімії фтору (Берлін, Німеччина, 1998 рік), семінарі НАТО з ферментів у хімії гетероатомних сполук (Наймеген, Голандія, 1999 рік), 16-тому Міжнародному симпозіумі з хімії фтору (Дарем, Англія, 2000 рік).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей у наукових фахових журналах та 5 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, двох розділів, висновків, списку літератури та додатків. Робота викладена на 154 сторінках, містить 13 таблиць, 71 схему і 4 додатки. Список літератури нараховує 196 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Синтез амінокислот та їх елементорганічних аналогів є одним з найважливіших напрямків біоорганічної хімії. Це пов'язано в першу чергу з дослідженням біологічної активності амінокислот та їх значної ролі у створенні нових лікарських препаратів та тонких біохімічних інструментів. Взявши за мету розробку методів одержання рацемічних та оптично активних ?-амінокислот, ми здійснили це на прикладі різних представників цього класу сполук.

Одержання рацемічних ?,?-дифтор-?-амінокислот та дослідження реакції Міцунобу, як ключової стадії синтезу. В першій частині роботи було досліджено амінування по реакції Міцунобу фторовмісних ?-алкіл- та ?-арил-??-гідроксиестерів 2а-д, як ключової стадії у запропонованій трьохстадійній схемі одержання ???–дифтор-?-амінокислот 4а-д з аліфатичних та ароматичних альдегідів 1а-д (схема 1). Для стадії амінування ми взяли за основу оригінальну методику, запропоновану Міцунобу і в процесі дослідження змінювали час, за який додавали діетилазодикарбксилат, концентрацію, співвідношення реагентів, порядок змішування, розчинник і температуру.

Схема 1

Найкращі результати для гідроксиестеру 2а були досягнуті при проведенні процесу згідно з методом Г, при якому реагенти були взяті в надлишку по відношенню до вихідного гідроксиестеру 2а і розчин діетилазодикарбоксилату в толуолі додавали останнім до суміші реагентів (таблиці 1, 2).

Таблиця 1

Виходи в реакції Міцунобу для гідроксиестеру 2a в різних розчинниках

Розчинник Вихід 3a, % Вихідне 2a, що не прореагувало, % Молярне співвідношення, ROH/ DEAD/ Ph3P/PhthNH

CH2Cl2 26 25 1 : 1 : 1 : 1

ТГФ 66 30 1 : 1 : 1 : 1

Толуол 79 16 1 : 1 : 1 : 1

Таблиця 2

Виходи в реакції Міцунобу для гідроксиестеру 2a в різних умовах

Метод Порядок додавання реагентів Молярне cпіввідношенняа 2a / 5 / 6 / 7 Вихід 3a, % Вихідне 2a, що не прореагувало, %

A 2a, 6, 7 + 5 1 : 1 : 1 : 1 79 16

Б 6 + 7 + 5 + 2a 1 : 1 : 1 : 1 67 21

В 6 + 2a + 5 + 7 1 : 1 : 1 : 1 74 11

Г 2a, 6, 7 + 5 1 : 1.2 : 1.2 : 1.4 95 3

Д 6 + 7 + 5 + 2a 1 : 1.2 : 1.2 : 1.4 77 15

Е 6 + 2a + 5 + 7 1 : 1.2 : 1.2 : 1.4 88 3

а н-C5H11CH(OH)CF2CO2Et (2a), діетилазодикарбоксилат (5), Ph3P (6) і фталімід (7)

Для гідроксиестеру 2г такий спосіб проведення процесу давав низький вихід продукту та малу ступінь конверсії. Використання семикратного надлишку реагентів дозволило одержати продукт 3г з виходом 32% (таблиця 3).

Таблиця 3

Виходи в реакції Міцунобу для гідроксиестеру 2г

№ Молярний надлишок реагентів а Вихід 3г, %б Вихідне 2г, що не прореагувало, % в

1 1.2 10 46

2 3 25 8

3 7 32 0

a Ph3P, DEAD, PhthNH; б Препаративні виходи при тривалості реакції 20 год.; в Визначено на основі спектрів ЯМР 19F.

Для аналізу відмінностей проходження процесу для аліфатичних та ароматичних гідроксиестерів і з метою зафіксувати можливі інтермедіати ми проводили реакцію з гідроксиестерами 2a і 2г, використовуючи порядок змішування реагентів, відмінний від оптимального.

Схема 2

В результаті методом ЯМР 31P було виявлено, що на стадії після додавання гідроксиестеру до попередньо одержаного бетаїну 9, перед вводом кислотної компоненти, в реакційних сумішах не спостерігалось якісних відмінностей, тобто були присутні бетаїн 9, фосфорани 10, 12 і Ph3PO. Після ж додавання фталіміду (кислотна компонента), у разі алкілзаміщеного гідроксиестеру 2a, рівновага між фосфоранами 10, 12 та алкоксифосфонієвою сіллю 14 зсувалась у напрямку солі 14, в той час як у разі арилзаміщеного гідроксиестеру 2г, після додавання фталіміду спостерігались фосфорани 10 і 12, а алкоксифосфонієвої солі 14 не було виявлено.

Згідно зі спектральними даними ЯМР 19F (що вимірювали паралельно зі спектрами ЯМР 31P), аліфатичний гідроксиестер 2a давав на цій стадії проміжні фосфорани, що перетворювались у продукт після додавання кислотної компоненти. Реакція ж Ph3P та діетилазодикарбоксилату з ароматичним гідроксиестером 2г призводила до необоротного утворення, в доповнення до проміжних фосфоранів 10 і 12, N-алкільованого діетилазодикарбоксилату 8г та гідразоноестеру 16г, зафіксованих в реакції Міцунобу вперше. Після додавання фталіміду і завершення реакції, сполуки 8 і 16 були в числі продуктів реакції поряд з цільовим фталімідопохідним 3г, занижуючи його вихід.

Таким чином, проводячи процес в умовах, оптимізованих для кожного типу субстратів, були одержані ?-фталімідопохідні зі сполук 2a-д з виходами, що наведені в таблиці 4. Основні фторовмісні побічні продукти 8, 16 і 17 також були виділені та повністю охарактеризовані.

Таблиця 4

Продукти реакції Міцунобу для гідроксиестерів 2a-д

Звичайно для перетворення фталімідопохідних у вільні аміни використовується гідразиноліз, але в нашому випадку цей метод не призвів до утворення необхідних продуктів. Нам вдалося зняти фталімідний захист і одночасно перевести естерну групу в карбоксильну в одну стадію в кислотних умовах і одержати вільні амінокислоти 4 з виходами 53-57%.

Синтез оптично активних фторовмісних ?- і ?-амінокислот з (R)-2,3-О-ізопропіліденгліцеральдегіду. Далі було досліджено можливість синтезу оптично активних фторовмісних амінокислот з оптично активної природної сполуки. Як вихідне було використано доступний (R)-2,3-О-ізопропіліденгліцеральдегід 18. Наявність в його молекулі альдегідної групи і захищеного 1,2-діольного фрагменту відкривала можливості для його функціоналізації. Для одержання оптично активної N-захищеної 2-аміно-3-фторундеканової кислоти були здійснені перетворення згідно з вказаною ретросинтетичною схемою (схема 3).

Схема 3

На першому етапі була реалізована синтетична послідовність, що представлена на схемі 4.

Схема 4

Дією н-октилмагнійброміду на альдегід 18 отримували спирти 19 у вигляді суміші діастереомерів з переважним вмістом анти-ізомеру. З метою збільшення виходу заміна гідроксильної групи сполуки 19 на фтор проводилась через триметилсилільні етери 20. При цьому проходило збагачення продукту 21 діастереомером 21а і відбувалось обернення конфігурації. Діоли 22 одержували після гідролізу фторидів 21 в тому ж діастереомерному співвідношенні.

Для проведення реакції Міцунобу по гідроксильній групі біля C2-вуглецевого атому захищали гідроксильну групу біля первинного атому вуглецю (схема 5). Одержані захищені монофтордіоли 23а і 23б були розділені методом колонкової хроматографії на силікагелі, а їх діастереомерна чистота була підтверджена методами 1Н і 19F ЯМР. Реакцію Міцунобу проводили зі спиртом 23а і одержували фталімідопохідне 24 у вигляді індивідуального діастереомера. Оскільки з літератури відомо, що реакція Міцунобу, як правило, проходить з оберненням конфігурації, ми припустили, що одержане фталімідопохідне 24 має (2S,3R) конфігурацію і підтвердили його діастереомерну чистоту методами 1Н и 19F ЯМР.

Схема 5

Після зняття захисної групи та окиснення одержали N-захищену амінокислоту 26 з виходом 71%. Її оптичну чистоту підтвердили методами 1Н і 19F ЯМР.

Для синтезу оптично активної N-захищеної 3-аміно-2,2-дифторундеканової кислоти застосували аналогічну методологію, що базувалась на хімічних перетвореннях альдегіду 18 (схема 6).

Схема 6

Суміш спиртів 19 вводили в реакцію Міцунобу і одержували фталімідопохідне 27 у вигляді суміші діастереомерів (схема 7). В результаті реакції проходило обернення конфігурації біля С3-вуглецевого атому обох діастереомерів.

Схема 7

В одержаних після гідролізу діастереомерних діолах 28 захищали гідроксильну групу біля первинного вуглецевого атому. Продукти 29 розділяли на діастереомери методом колонкової хроматографії на силікагелі та підтверджували їх діастереомерну чистоту методом 1Н ЯМР.

Наступні перетворення проводили з переважаючим діастереомером 29а. Зіткнувшись з рядом проблем при фторуванні кетону 30 M-DAST, ми дослідили цю реакцію в різних умовах, що дозволило одержати дифторид 31 з препаративним виходом 20% (схема 8). З реакційної суміші були виділені також вихідний кетон 30 (з виходом 19%) і монофторид 34 (з виходом 20%). На основі одержаних даних ми зробили висновок, що фторування кетона 30 було ускладнено через наявність в ?-положеннях до групи, що фторується, об'ємистих замісників, що визначало низьку конверсію.

Схема 8

Після зняття захисту і окиснення була одержана N-захищена 3-аміно-2,2-дифторундеканова кислота 33. Враховуючи, що хімічні перетворення сполуки 29а не зачіпали хірального С-3 вуглецевого атому, ми припустили, що амінокислота 33 має (R)-конфігурацію.

Згідно з тією ж методологією для синтезу 2-аміно-3,3-дифторундеканової кислоти було послідовно проведено ряд перетворень, що наведені на схемі 9.

Схема 9

Однак при знятті трет-бутилдиметилсилільного захисту з фталімідопохідного 39 системою діоксан/соляна кислота очікуваний продукт з вільною гідроксильною групою біля С1-атому вуглецю виділити не вдалося. Замість нього несподівано одержали фторовмісний вторинний спирт 40. Крім згаданої були випробувані системи (CH3)3SiCl/NaI/CH3CN, а також I2/CH3OH, але в обох випадках одержали той самий продукт 40. Раніше в літературі подібне перегрупування було відмічено лише при знятті трет-бутилдиметилсилільного захисту тетрабутиламонійфторидом (схема 10). Таким чином, ?-аміно-?,?-дифторкарбонову кислоту цим методом не вдалось одержати через неможливість уникнути перегрупування при знятті захисту з гідроксильної групи біля первинного атому вуглецю.

Схема 10

Для синтезу ?2-фтор-3-аміноундеканової кислоти з тієї ж вихідної сполуки проводили перетворення, що наведені на схемі 11.

Схема11

На шляху до кінцевої сполуки передбачалось провести фторування M-DAST переважаючого діастереомера 29а. Однак, цільову ?-фтор-?-амінокислоту одержати не вдалося, так як виділений переважаючий продукт 42 не містив атому фтору. Фторування дизахищеної сполуки 41 давало той же продукт 42.

Таким чином, в цій частині роботи ми розробили методи синтезу оптично чистих ?-аміно-?-фторамінокислот і ??,?-дифтор-?-амінокислот на прикладі N-захищеної 2-аміно-3-фторундеканової 26 та N-захищеної 3-аміно-2,2-дифторундеканової 33 кислот з (R)-2,3-O-ізопропіліденгліцеральдегіду 18.

З літератури відомо, що однією з проблем в синтезі фторовмісних амінокислот, є збереження фтору в молекулі на заключній стадії гідролізу естерної групи до карбоксильної. Запропонована нами методологія побудови молекули амінокислоти, зокрема карбоксильної групи, дозволяє обійти цю проблему шляхом окиснення гідроксильної групи біля С1-атому вуглецю до карбоксильної.

Одержання оптично активних ?-амінокислот ензиматичним розщепленням їх похідних. Крім чисто хімічного підходу для одержання оптично активних ?-амінокислот значний потенціал має біокаталітичний метод. Незважаючи на широке застосування ферментативного розщеплення рацематів в синтезі ?-амінокислот, прикладів його використання для одержання ?-амінокислот відомо не багато. Для з'ясування стереоселективності дії пеніцилінацилази (EC 3.5.1.11) з Escherichia coli ATCC 9637 для розщеплення ?-амінокислот різноманітної будови, ми провели синтез рацематів їх N-фенілацетильних похідних.

N-фенілацетильні похідні ?-арил-?-амінокислот 44 одержували за методом Шотен-Баумана і проводили з ними ферментативну реакцію (схема 12). Хід гідролізу контролювали використовуючи метод спектрофотометричної реєстрації продукту взаємодії вільної амінокислоти з о-фталевим альдегідом. При досягненні 50%-ного ступеню конверсії вихідного 44 реакційну суміш підкисляли соляною кислотою і виділяли L-енантіомери амінокислот 46 методом іоно-обмінної хроматографії (cмола Дауекс-50, Н+-форма) та D-енантіомери N-фенілацетильних похідних 45, які далі гідролізували соляною кислотою.

Схема 12

Оптична чистота одержаних амінокислот 46 і 47 була підтверджена методом ВЕРХ на хіральному сорбенті. Абсолютна конфігурація амінокислоти 46а, одержаної ферментативно, і амінокислоти 47а, виділеної після хімічного гідролізу, була визначена як (R) і (S), відповідно, порівнянням їх виміряних кутів оптичного обертання з літературними даними. Ці дані, а також результати розщеплення за допомогою пеніцилінацилази N-фенілацетильних похідних ?- і ?-амінокислот дозволили вважати, що решта одержаних ферментативно амінокислот 46б-е є членами L-ряду і по аналогії з амінокислотою 46а мають (R)-конфігурацію. Цей висновок підтверджувався хроматографічною поведінкою в умовах хіральної ВЕРХ енантіомерів одержаних амінокислот: час утримання біокаталітично одержаного (R)-енантіомеру амінокислоти у всіх випадках був менший від часу утримання (S)-енантіомеру. Швидкості гідролізу за участю пеніцилінацилази (R)- і (S)-N-фенілацетильних похідних досліджених амінокислот відрізнялись суттєво. Стереоселективність дії пеніцилінацилази, виражена як відношення бімолекулярних констант швидкостей гідролізу L- і D-форми, для всіх амінокислот була близько 10000, що дозволило виділити амінокислоти 46а-е і 47а-е з високою оптичною чистотою (див. схему 12).

Ферментативну реакцію з рацематами N-фенацетильних похідних ?-фторалкіл-?-амінокислот 49 проводили при постійному рН і зупиняли її підкисленням соляною кислотою при досягненні 50%-ного ступеню конверсії вихідного матеріалу (схема 13).

Схема 13

Слід відмітити, що швидкість ферментативної реакції зменшувалась при збільшенні довжини фторалкільного замісника N-фенілацетильних похідних амінокислот. Так, тривалість реакції для досягнення 50%-ного ступеню конверсії змінювалась від 4.5 годин для 49а (Rf=CF3) до 48 годин для 49е [Rf=H(CF2)4]. Оптична чистота амінокислот 51 і 52, одержаних ферментативно і хімічним гідролізом була підтверджена методом ВЕРХ на хіральному сорбенті. Абсолютну конфігурацію одержаних амінокислот визначали на основі даних про те, що пеніцилінацилаза (з E.Coli) не гідролізує D-енантіомери N-фенілацетильних похідних ?-амінокарбонових, ?-аміноалкілфосфонових, ?-аміно- та ?-амінокислот. Ми припустили, що одержані ферментативно амінокислоти 51а-е будуть членами L-ряду і підтвердили це за допомогою рентгеноструктурного аналізу на прикладі ?-трифторметил-?-аланіну 51а. Приймаючи до уваги, що характер стереоселективності при ферментативному гідролізі повинен бути однаковим для всіх N-фенілацетильних похідних амінокислот 49а-е, а також аналогічність порядку елюювання в умовах хіральної ВЕРХ енантіомерів амінокислот, ми присвоїли (R)-абсолютну конфігурацію енантіомерам 51а-е, одержаним біокаталітично, і (S)-конфігурацію – енантіомерам 52а-е, виділеним після хімічного гідролізу. Стереодиференціація при ферментативному гідролізі похідних 49а-е була досить висока у всіх випадках для одержання ?-фторалкіл-?-амінокислот з високою оптичною чистотою (див. схему 13).

Широкі можливості пеніцилінацилази (з E.Coli) були також нами продемонстровані при одержанні діастереомерів 3-аміно-2-метил-4,4,4-трифторбутанової кислоти (схема 14).

Схема 14

N-Фенілацетильні похідні 54а,б одержували з індивідуальних амінокислот анти-53а та син-53б (95% de) за методом Шотен-Баумана. Ферментативний гідроліз та виділення амінокислот проводили аналогічно до ?-фторалкіл-?-амінокислот. Оптична чистота одержаних стереоізомерних амінокислот 56а, 56б і 57а, 57б складала >95% eе і була підтверджена методом ВЕРХ на хіральному сорбенті.

Абсолютна конфігурація одержаних продуктів була визначена на основі літературних даних, згідно з якими пеніцилінацилаза (з E.Coli) виключно стереоселективно гідролізує L-енантіомери N-фенілацетильних похідних ?-амінокарбонових та ?-аміноалкілфосфонових кислот незалежно від природи кислотної групи. Аналогічний характер стереодискримінації виявлено також у випадку розділення пеніцилінацилазою ?-аміно- і ?-амінокислот. Крім того, з літературних даних відомо, що ?-вуглецевий атом не приймає участі в енантіоселективній ферментативній стадії і природа ?-замісника не впливає на стереорезультат реакції. Ці дані дали нам підстави вважати, що при ферментативному розщепленні анти-N-фенілацетильних похідних амінокислот 54а були одержані N-фенілацетильне похідне 55а та амінокислота 56а, що мають абсолютну конфігурацію, відповідно, (2R,3S) і (2S,3R). Та аналогічно, при ферментативному розділенні син-N-фенілацетильних похідних амінокислот 54б були одержані N-фенілацетильне похідне 55б та амінокислота 56б, що мають абсолютну конфігурацію, відповідно, (2S,3S) і (2R,3R).

Таким чином при розробці біокаталітичного методу одержання оптично активних ?-амінокислот була досліджена стереоселективність дії пеніцилінацилази (з E.Coli) при розщепленні ?-амінокислот різноманітної будови і було показано, що при ферментативному гідролізі їх N-фенілацетильних похідних стереодиференціація достатньо висока для одержання цих амінокислот з високою оптичною чистотою (>95% ee).

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється в розробці різноманітних підходів для одержання рацемічних та оптично активних фторовмісних ?-амінокислот, серед переваг яких можна відмітити малу кількість стадій, хороші виходи, використання дешевої оптично активної сировини, вдале застосування ферментів та високу оптичну чистоту одержуваних амінокислот.

2. Запропоновано препаративний трьохстадійний метод одержання ?,?-дифтор-?-амінокислот з аліфатичних і ароматичних альдегідів та етилбромдифторацетату. Реакцію Міцунобу, як ключову стадію амінування, вперше реалізовано для ?,?-дифтор-?-алкіл-?та ?-арил-?-гідроксиестерів та встановлено фактори, що впливають на ефективність проведення процесу.

3. В результаті детального вивчення механізму реакції Міцунобу методом 31P і 19F ЯМР ідентифіковано фосфоровмісні інтермедіати та охарактеризовано не зафіксовані раніше побічні продукти реакції Міцунобу, структура яких несе додаткову інформацію щодо схеми реакції.

4. Розроблено методи синтезу енантіомерних моно- і дифторовмісних амінокислот з доступного (R)-2,3-О-ізопропіліденгліцеральдегіду. Можливість препаративного синтезу оптично чистих ?-аміно-?-фторкарбонових кислот та ?,?-дифтор-?-амінокислот продемонстровано на прикладі N-захищених 2-аміно-3-фторундеканової та 3-аміно-2,2-дифторундеканової кислот.

5. Вперше запропоновано біокаталітичний метод одержання оптично активних ?-амінокислот із застосуванням пеніцилінацилази (EC 3.5.1.11) з Escherichia coli ATCC 9637. Показано, що незважаючи на значний вплив замісників у субстраті на швидкість ферментативного гідролізу N-фенілацетильних похідних ?-амінокислот, субстратна стереоселективність достатньо висока для одержання цільових ?-арил-?-амінокислот, ?-фторалкіл-?-амінокислот та ?-алкіл-?-фторалкіл-?-амінокислот з високою оптичною чистотою.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Soloshonok V.A., Svedas V.K., Kukhar V.P., Kirilenko A.G., Rybakova A.V., Solodenko V.A., Fokina N.A., Kogut O.V., Galaev I.Yu., Kozlova E.V., Shishkina I.P., Galushko S.V. An enzymatic entry to enantiopure ??amino acids // Synlett – 1993. – P. 339-341.

2. Soloshonok V.A., Kirilenko A.G., Fokina N.A., Shishkina I.P., Galushko S.V., Kukhar V.P., Svedas V.K., Kozlova E.V. Biocatalitic resolution of ??fluoroalkyl-??amino acids // Tetrahedron: Asymmetry – 1994. – 5. – P. 1119-1126.

3. Soloshonok V.A., Kirilenko A.G., Fokina N.A., Kukhar V.P., Galushko S.V., Svedas V.K., Resnati G. Chemo-enzymatic approach to the synthesis of each of the four isomers of ?-alkyl-??fluoroalkyl-substituted ??amino acids // Tetrahedron: Asymmetry – 1994. – 7. – P. 1225-1228.

4. Soloshonok V.A., Fokina N.A., Rybakova A.V., Shishkina I.P., Galushko S.V., Sorochinsky A.E., Kukhar V.P., Savchenko M.V., Svedas V.K. Biocatalytic approach to enantiomerically pure ??amino acids // Tetrahedron: Asymmetry – 1995. – 7. – P. 1601-1610.

5. Fokina N.A., Kornilov A.M., Kukhar V.P. The Mitsunobu reaction in the synthesis of ?,?-difluoro-?-amino acids // J. Fluor. Chem. – 2001. – 111. – P. 69-76.

6. Fokina N.A., Sorochinsky A.E., Markovsky A.L., Soloshonok V.A., Kukhar V.P. ?,?-Difluoroimines in the synthesis of fluorine-containing amino acids and alcohols // Pan European Workshop on Bioactive Fluoroorg. Comp. – Padova (Italy). – 1995. – P5.

7. Kukhar V.P., Fokina N.A., Soloshonok V.A. Fluorine-containing ??amino acids and alcohols // 12th Europ. Symp. on Fluor. Chem. – Berlin (Germany). – 1998. – A13.

8. Fokina N.A., Kornilov A.M., Kukhar V.P. ?,?-Difluoro-??amino acids via Mitsunobu reaction // 12th Europ. Symp. on Fluor. Chem. – Berlin (Germany). – 1998. – PI-8.

9. Fokina N.A., Kukhar V.P., Soloshonok V.A. Application of Penicillin acylase (EC 3.5.1.11) from Escherichia Coli for the preparation of enantiomerically pure ??amino acids of different structure // NATO Advanced Study Inst. on Enzymes in Heteroatom Chem. – Nijmegen (Netherlands). – 1999. – P. 102.

10. Fokina N.A., Kornilov A.M., Kukhar V.P. Potentialities of the Mitsunobu reaction in the synthesis of ?,?-difluoro-??amino acids // 16th Intern. Symp. on Fluor. Chem. – Durham (UK). – 2000. – 1P-96.

Фокіна Н. О. Розробка методів синтезу рацемічних та оптично активних фторовмісних ?-амінокислот. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 – біоорганічна хімія. Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2002.

Дисертацію присвячено розробці методів одержання рацемічних та оптично активних ?-амінокислот на прикладі різних представників цього класу сполук (?,?-дифтор-?-амінокислот, ?-арил-?-амінокислот, ?-фторалкіл-?-амінокислот та ?-алкіл-?-фторалкіл-?-амінокислот).

Запропоновано препаративний трьохстадійний метод одержання рацемічних ?,?-дифтор-?-амінокислот з аліфатичних і ароматичних альдегідів та етилбромдифторацетату.

Розроблено методи синтезу оптично чистих моно- і дифторовмісних амінокислот з доступного (R)-2,3-О-ізопропіліденгліцеральдегіду. Ефективність методу показано на прикладі одержання N-захищених 2-аміно-3-фторундеканової та 3-аміно-2,2-дифторундеканової кислот.

Розроблено біокаталітичний метод одержання енантіомерних ?-амінокислот шляхом ферментативного розщеплення пеніцилінацилазою (з E.Coli) їх N-фенілацетильних похідних. Завдяки високій субстратній стереоселективності процесу цільові ?-арил-?-амінокислоти, ?-фторалкіл-?-амінокислоти та ?-алкіл-?-фторалкіл-?-амінокислоти одержано з високою оптичною чистотою.

Ключові слова: амінокислоти, етилбромдифторацетат, (R)-2,3-О-ізопропіліденгліцеральдегід, біокаталітичний метод, субстратна стереоселективність.

Фокина Н. А. Разработка методов синтеза рацемических и оптически активных фторсодержащих ?-аминокислот. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 – биоорганическая химия. Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2002.

Диссертация посвящена разработке методов получения рацемических и оптически активных ?-аминокислот на примере различных представителей этого класса соединений (?,?-дифтор-?-аминокислот, ?-арил-?-аминокислот, ?-фторалкил-?-аминокислот и ?-алкил-?-фторалкил-?-аминокислот).

Разработан препаративный трехстадийный метод получения рацемических ?,?-дифтор-?-аминокислот из алифатических и ароматических альдегидов. Для введения атомов фтора в молекулы промежуточных соединений использован СF2-синтон (этилбромдифторацетат). Изучено аминирование фторсодержащих ?-алкил- и ?-арил-??-гидроксиэфиров по реакции Мицунобу, как ключевой стадии предложенной схемы,. В результате детального исследования механизма реакции Мицунобу методом 31P и 19F ЯМР показано, что фосфораны Ph3P(OR)2 и Ph3P(OR)N(CO2R')NHCO2R', а также оксифосфониевые соли [Ph3P(OR)]+X? образуются в ходе реакции в качестве интермедиатов. Идентифицированы не зафиксированные ранее побочные продукты реакции Мицунобу, структура которых несет дополнительную информацию о схеме реакции. При исследовании влияния растворителя и порядка прибавления реагентов показано, что добавление раствора диэтилазодикарбоксилата последним к смеси фталимида, трифенилфосфина и гидроксиэфира в толуоле позволяет существенно улучшить конверсию и региоселективность.

Разработаны методы синтеза оптически чистых моно- и дифторсодержащих аминокислот из доступного (R)-2,3-О-изопропилиденглицеральдегида. Возможность проведения реакции Мицунобу с целью введения аминогруппы показана для различных полифункциональных гидроксипроизводных. Для введения атома(ов) фтора в молекулы промежуточных соединений использован фторирующий агент M-DAST. Выявлены особенности регио- и стереоселективного фторирования полифункциональных спиртов и кетонов. Возможность препаративного синтеза оптически чистых ?-амино-?-фторкарбоновых кислот и ??,?-дифтор-?-аминокислот продемонстрирована на примере N-защищенных 2-амино-3-фторундекановой и 3-амино-2,2-дифторундекановой кислот.

Разработан биокаталитический метод получения оптически активных ?-аминокислот. Изучена стереоселективность действия пенициллинацилазы (из E.Coli) при расщеплении ?-аминокислот различного строения. Показано, что несмотря на значительное влияние заместителей в субстрате на скорость ферментативного гидролиза N-фенилацетильных производных исследуемых аминокислот субстратная стереоселективность достаточно высока для получения энантиомеров ?-арил-?-аминокислот, ?-фторалкил-?-аминокислот и ?-алкил-?-фторалкил-?-аминокислот с высокой оптической чистотой.

Ключевые слова: аминокислоты, этилбромдифторацетат, (R)-2,3-О-изопропилиденглицеральдегид, биокаталитический метод, субстратная стереоселективность.

Fokina N. A. Elaboration of the Methods for the Synthesis of Racemic and Optically Active Fluorine-containing ?-Amino Acids. – Manuscript.

Thesis for the candidate's degree in chemical sciences on speciality 02.00.10 – bioorganic chemistry. Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2002.

The dissertation includes the elaboration of methods for the synthesis of racemic and optically active ?-amino acids, in particular ?,?-difluoro-?-amino acids, ?-aryl-?-amino acids, ?-fluoroalkyl-?-amino acids and ?-alkyl-?-fluoroalkyl-?-amino acids as representative examples.

Preparative three-stage strategy for the obtaining of racemic ?,?-difluoro-?-amino acids starting from aliphatic and aromatic aldehydes and ethyl bromodifluoroacetate has been proposed.

Methods for the synthesis of optically pure mono- and difluorinated amino acids from available (R)-2,3-О-isopropylideneglyceraldehyde have been elaborated. The efficiency of the method has been shown on the synthesis of N-protected 2-amino-3-fluoroundecanoic and 3-amino-2,2-difluoroundecanoic acids.

Biocatalytic method for the preparation of enantiomeric ?-amino acids through enzymatic resolution of their N-phenylacetyl derivatives by penicillin acylase (from E.Coli) has been elaborated. Target ?-aryl-?-amino acids, ?-fluoroalkyl-?-amino acids and ?-alkyl-?-fluoroalkyl-?-amino acids have been prepared with high optically purity due to the high substrate stereoselectivity of the process.

Key words: amino acids, ethyl bromodifluoroacetate, (R)-2,3-О-isopropylideneglyceraldehyde, biocatalytic method, substrate stereoselectivity.