НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О. В. ПАЛЛАДІНА

ГОЛТВЯНСЬКИЙ АНАТОЛІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ

УДК 574.64.08: 57.017.6

БІОАКУМУЛЯЦІЯ ІОНІВ МЕТАЛІВ КЛІТИНАМИ ЗЕЛЕНИХ

ВОДОРОСТЕЙ ТА ОДЕРЖАННЯ БІОМАСИ,

БАГАТОЇ НА МІКРОЕЛЕМЕНТИ

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі молекулярної біології та біотехнології Науково-дослідного інституту біології Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Божков Анатолій Іванович,

НДІ біології Харківського національного університету

ім. В.Н.Каразіна, директор,

зав. відділу молекулярної біології та біотехнології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Пархоменко Юлія Михайлівна,

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України,

провідний науковий співробітник;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Шнюкова Єлизавета Іллівна,

Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України,

провідний науковий співробітник.

Провідна установа - Національний університет харчових технологій Міністерства освіти і науки України, кафедра біотехнології мікробного синтезу, м. Київ.

Захист відбудеться 23 грудня 2002 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради

Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (м. Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий “22“ листопада 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Інтенсивне забруднення навколишнього середовища іонами важких металів є одним із факторів інвайронментальної кризи [Сытник, Вассер, 1995]. У зв’язку з цим розробка сучасних біотехнологій очищення середовища від іонів металів є актуальною та перспективною. Як відомо, організми виявляють різну чутливість до іонів металів у навколишньому середовищі. У зв’язку із цим великий інтерес становлять клітини водоростей, оскільки вони є первинними продуцентами і формують велику біомасу водойм [Вассер, и др., 1989]. Враховуючи високу інтенсивність розмноження, метаболічну пластичність та їхню роль у біоценозах, являє інтерес дослідження можливості цих організмів адаптуватися до високих концентрацій іонів металів у середовищі. Знання механізмів адаптації водоростей до іонів металів та інших хімічних компонентів має не тільки теоретичний інтерес з точки зору розуміння еволюційних процесів, але й велике практичне значення, зокрема, при розробці сучасних технологій очищення водного середовища [Саванина и др., 1999].

Численні роботи показують, що клітини водоростей здатні адаптуватися до іонів металів [Visviki, Rachlin, 1994; Божков, Могилянская, 1996 ], разом з тим, стійкость цих об’єктів до високих концентрацій іонів металів за умов їхньої токсичної дії залишається малодослідженою. Найбільша кількість робіт із вивчення механізмів адаптації присвячена синтезу металотіонеїнів та інших стрес-білків [Лебедева и др., 1998 ]. Разом із тим, роль металотіонеїнів у формуванні стійкості організму до високих концентрацій токсиканту потребує додаткових досліджень, оскільки іони металів зв’язуються не тільки зі стрес-білками [Macfie et all., 1994; Тропин, Золотухина, 1996; Божков, 1997].

Дослідження процесів біоакумуляції іонів металів клітинами водоростей становить інтерес не тільки для розробки технологій біоочищення води, але й для одержання біологічно активних добавок, які вміщують необхідні для організму вітаміни та мікроелементи [Mazo et all., 1999; Van Stuijvenberg et all., 1999]. Це важливо, оскільки мікроелементи в клітинах водоростей утворюють комплекси з різними органічними сполуками, що забезпечує їхню високу біологічну активність [Саут, Уиттик, 1990]. Значний інтерес у дослідженні механізмів адаптації і подальшому використанні являють водорості відділу Chlorophyta, і зокрема, роду Dunaliella. Цей рід представлений поодинокими еукаріотичними клітинами, вони не мають клітинної оболонки, здатні накопичувати великі концентрації каротиноїдів, синтезувати гліцерин, багаті на білок, вітаміни та інші цінні біологічно активні речовини [Масюк, 1973].

Отже, водорості роду Dunaliella можна вважати унікальним об’єктом біотехнології та перспективною моделлю для біологічних досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводили у відділі молекулярної біології та біотехнології НДІ біології Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна (тема 32-16-00 за проблемою 01 “Фундаментальні дослідження найважливіших проблем природничих, суспільних і гуманітарних наук”, в рамках теми “Сучасні біотехнології. Використання фізичних та хімічних методів у біотехнології “ № ДР 0100U003317).

Мета й завдання дослідження. Дослідити особливості біоакумуляції іонів металів клітинами зелених водоростей і можливі механізми адаптації до високих концентрацій іонів міді з метою одержання біомаси, збагаченої мікроелементами. Відповідно до поставленої мети були визначені наступні завдання:

1.

2.

3.

4.

5.

Об’єкти дослідження - водорості Dunaliella viridis і Chlorella vulgaris, біоакумуляція та екскреція іонів міді, метаболізм білків, нуклеїнових кислот.

Предмет дослідження - показники синтезу нуклеїнових кислот, білків, склад водорозчинної фракції білків клітин, умови та характеристика росту культури водоростей.

Методи дослідження - культивування клітин водоростей; біохімічні методи визначення вмісту білків і нуклеїнових кислот; електрофоретичні методи аналізу білків клітин водоростей; радіоізотопні методи; спектрофотометричні методи визначення мікроелементів; морфометричні методи аналізу; методи статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Показана спроможність клітин Dunaliella viridis адаптуватися до високих концентрацій іонів міді (10, 20, 50 мг/л), яка забезпечується за рахунок накопичення та тривалого зв’язування частини іонів металів, а також за рахунок функціонування дозозалежної системи екскреції іонів металів у середовище. Виявлено, що переведення культури Dunaliella viridis на середовище без іонів міді супроводжується швидким вивільненням іонів міді із клітин у культуральне середовище тобто біоакумуляція є оборотним процесом.

Отриманий мідєрезистентний штам, який відрізнявся від вихідного штаму вмістом нуклеїнових кислот та білків. Вміст тотальних білків у клітинах мідє-резистентного штаму був меншим порівняно з вихідною культурою. Однак у клітинах цього штаму був значно вищий вміст білка з молекулярною масою близько 25 кДа.

Вперше виявлена висока морфологічна і функціональна гетерогенність клітин в культурі Dunaliella viridis. Клітини культури Dunaliella viridis були розділені методом диференційного центрифугування на “важку” та “легку” фракції. До складу “легкої” фракції входили клітини з вихідною низькою функціональною активністю, однак вони характеризувалися високою швидкістю зростання показників функціонального стану. До складу “важкої” фракції входили клітини з високою вихідною функціональною активністю, яка незначно змінювалася протягом часу. Показано, що клітини “легкої” та “важкої” фракції зв’язують різну кількість іонів міді в конкретних умовах культивування.

Сформульовано селективно-метаболічну гіпотезу, яка пояснює формування різної стійкості клітин водоростей до токсиканту залежно від рівня метаболізму. Суть її полягає в тому, що в популяції клітин водоростей присутні відносно стійкі до іонів міді клітини, які мають селективну перевагу та їхня кількість поступово збільшується. Окрім того, в цих клітинах індукуються метаболічні зміни, які формують резистентність до іонів міді. Ці зміни можуть бути пов’язані з посиленням системи депонування або екскреції іонів міді.

Практичне значення отриманих результатів. Отримано штам водоростей Dunaliella viridis, резистентний до високих концентрацій іонів міді, який може бути використаний як об’єкт у розробці сучасних біотехнологій очищення водного середовища від іонів міді. Показана можливість одержання біомаси водоростей Dunaliella viridis, збагаченої мікроелементами (залізо, селен, мідь), яка може бути використана як перспективна харчова добавка при лікуванні мікроелементозів.

Одержані результати використовуються при читанні лекцій і проведенні практичних занять з біотехнології Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна.

Особистий внесок здобувача. Самостійно проведені робота з літературою та написання огляду літератури, експерименти з дослідження здатності водоростей накопичувати іони міді та інші мікроелементи, експерименти з отримання резистентних штамів, дослідження морфологічної гетерогенності клітин у культурі водоростей, одержання біомаси, багатої на мікроелементи. Експерименти з вивчення функціональної гетерогенності клітин водоростей у культурі, можливих механізмів резистентності до іонів металів, розробка методу отримання біомаси, проведені разом із науковим керівником. Аналіз та інтерпретація одержаних результатів проведені самостійно.

Апробація результатів дисертації. Результати та основні положення роботи доповідалися на II Міжнародній конференції "Актуальные проблемы современной альгологии" (Киев, 1999), міжвузівській конференції молодих учених "Растение, микроорганизмы и среда" (Санкт-Петербург, 2000), IV Міжнародному симпозіумі "Биологические механизмы старения" (Харьков, 2000) і на наукових семінарах у НДІ біології Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна.

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковані 3 статті, отримано свідоцтво про державну реєстрацію прав автора на твір, 3 тези доповідей.

Структура та об’єм дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу та трьох розділів: огляд літератури, матеріали та методи дослідження, результати власних досліджень та їхнє обговорення; висновків, списку цитованої літератури з 223 найменувань. Робота викладена на 125 сторінках друкованого тексту, вона вміщує 8 таблиць та 20 рисунків.

Основний зміст роботи

Огляд літератури. В огляді літератури представлені результати наукових досліджень дії іонів металів, зокрема міді, які свідчать про поліфункціональний характер їхньої дії на біологічні системи. Показано, що клітини водоростей здатні адаптуватися до іонів металів, використовуючи різні механізми (внутрішньоклітинне зв’язування, екскреція іонів металів у культуральну рідину, зв’язування метаболітами культуральної рідини) і мають унікальний склад біомаси. Показано використання водоростей, зокрема, водоростей роду Dunaliella як біологічно активних добавок, в розробці технології очистки водного середовища.

Матеріали й методи дослідження.

Альгологічно чисті культури Chlorella vulgaris Beyerink, штам 875 та Dunaliella viridis Teodoresco, штам 29 культивували на рідкому середовищі Тамія і Артарі, відповідно, у скляних конічних колбах об’ємом 250 см3 у люміностаті при температурі 26-28 С° при цілодобовому освітленні 6 клк. Пересів культур здійснювали кожні три тижні (стаціонарна фаза росту), розводячи їх свіжим культуральним середовищем до концентрації клітин 3,5 млн. кл/мл (для Chlorella vulgaris) і 1,3-1,4 млн./мл (для Dunaliella viridis).

Водний розчин сульфату міді (CuSO4 . 5H2 O) вносили через 30-40 хв. після пересіву культури до кінцевих концентрацій 5, 10, 50, 75 і 100 мг/л.

В експериментах використовували два способи внесення сірчанокислої міді в культуру: разом із середовищем Артарі (перший спосіб) та разом із культуральною рідиною, яку отримували з культур Dunaliella viridis відповідного віку (другий спосіб). При культивуванні мідєрезистентного штаму Dunaliella viridis в культуру вносили мідь у концентрації 10 і 20 мг/л і кожні три тижні росту клітини водоростей переводили на свіже середовище Артарі із сірчанокислою міддю тієї ж концентрації.

Вміст міді визначали через 1, 3, 5 і 7 діб після її внесення з N,N-діетилдитіокарбаматом натрію [Новиков и др., 1990]. Вміст міді розраховували в мкг на клітину. Постклітинну фракцію повторно центрифугували 20 хв. при 3000g. До супернатанту додавали ТХО до кінцевої концентрації 50 г/л. Інкубували 12 год. при 4 С°, центрифугували при 3000g, 10 хв., а в супернатанті визначали вміст іонів міді, як і в клітинах. Вміст міді розраховували на 1 мл культурального середовища.

Розподіл клітин на фракції здійснювали диференційним центрифугуванням на центрифузі ЦЛР-1 при температурі 20-25 С°. Клітини “важкої” фракції осаджували при 1000 g, 5 хв., потім центрифугували супернатант при 3000g, 10 хв., в осаді – клітини “легкої” фракції. Отримані фракції клітин культивували за стандартних умов. При дослідженні дії сірчанокислої міді на клітини водоростей її вносили після пересівання клітин (без розподілу на фракції) на свіже середовище Артарі до кінцевих концентрацій 5, 10 і 50 мг/л (рН культурального середовища залишався незмінним – 7,8). Через 6, 24 і 48 годин інкубації із сірчанокислою міддю клітини розділяли на дві фракції, в яких визначали швидкість синтезу нуклеїнових кислот, білків та питому швидкість росту клітин.

Для визначення швидкості синтезу нуклеїнових кислот культури інкубували з міченими попередниками 1 год. Концентрацію клітин перед внесенням мічених попередників доводили до 12,5 млн. клітин в 1 мл культуральної рідини або свіжого середовища Артарі. Кількість неживих клітин контролювали за тестом із трипановим синім. У 19 мл такої культури вносили 1,5 МБк NaH14CO3. Через 1 год. клітини охолоджували, відмивали від попередників охолодженим культуральним середовищем, а потім руйнували у розчині такого складу: 0,5 %-й тритон Х-100; 0,02 М трис-НСI; рН 7,0; 0,0044 М ЕДТА протягом 30 хв. за кімнатною температурою. Проби підкислювали HClO4 до 5%-й кінцевої концентрації, залишали на 12 год. при 0 °С, потім центрифугували при 3000 g. Супернатант клітин промивали хлороформом, а осад високомолекулярних сполук – сумішшю хлороформ: метанол (1:2). У відмитому від ліпідів та пігментів осаді проводили гідроліз нуклеїнових кислот [Губарь и др., 1986]. Осад після гідролізу розчиняли в 1 н. NaOH та визначали вміст білка за Лоурі [Lowry, 1957]. Концентрацію нуклеїнових кислот встановлювали на спектрофотометрі, як описано [Спирин, 1958].

Гідролізати ДНК нейтралізовували 60% КОН. У гідролізатах нуклеїнових кислот і розчині білка визначали радіоактивність у діоксановому сцинтиляторі (5 г ППО, 250 мг ПОПОП, 100 г нафталіну на 1000 мл діоксану). Зразки оцінювали на - спектрометрі LS 7800 “Beckman”(США) та визначали питому радіоактивність нуклеїнових кислот і білків (імп/хв. на 1 мг РНК, ДНК або білка).

Селен у формі селеніту натрію (Na2SeO3) і хлорне залізо (FeCl3) вносили в культуру клітин через 30-40 хв. після пересіву на свіже культуральне середовище у вигляді водного розчину до кінцевої концентрації 0,1; 0,5 і 2,5 мг/л та 1, 5 і 10 мг/л, відповідно. Через 12 діб у культурах визначали вміст селену, заліза та інших мікроелементів на атомно-абсорбційному спектрофотометрі С-115 М “Selma“ (Суми, Україна).

Для електрофоретичного поділу білків використовували метод ступеневого електрофорезу за Леммлі [Остерман, 1981] із додецилсульфатом натрію в 12,5% ПААГ. Всі експерименти повторювали 3-5 разів, результати обробляли статистично з використанням параметричних і непараметричних методів аналізу [Гублер, 1978].

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Стійкість Chlorella vulgaris до різних концентрацій сірчанокислої міді. Виявлено, що внесення сірчанокислої міді до кінцевих концентрацій 50 і 75 мг/л у культуру Chlorella vulgaris супроводжувалося інгібуванням росту культури. Концентрація 10 мг/л не впливала на динаміку росту порівняно з контролем, і клітини культури зв’язували до (0,059±0,001) мкг/млн. клітин. При внесенні 50 і 75 мг/л сірчанокислої міді клітини культури Chlorella vulgaris акумулювали в 10 разів більше іонів міді порівняно з внесенням 10 мг/л. У культуральній рідині цей показник дорівнював (2,46±0,06) мкг/10 мл середовища при внесенні 10 мг/л і (7,92±0,06), (8,67±0,03) при внесенні 50 і 75 мг/л, відповідно. Накопичення іонів міді до (0,62±0,01) мкг/млн. клітин (при 50 мг/л) супроводжувалося інгібуванням росту культури, а подальше збільшення вмісту міді в середовищі (до 75 мг/л) не призводило до додаткового накопичення іонів міді. Ймовірно, для Chlorella vulgaris існує деякий ліміт біоакумуляції даного металу. Значних змін при цьому в культуральній рідині також не було. Можна припустити, що виявлена стійкість Chlorella vulgaris до дії іонів міді обумовлена наявністю у цих водоростей клітинної оболонки і абсорбцією на ній частини іонів металу.

Стійкість Dunaliella viridis Teod. до різних концентрацій сірчанокислої міді. Показано, що в тривалому експерименті при послідовних багатократних внесеннях сірчанокислої міді в культуральне середовище Dunaliella viridis здатна адаптуватися до високих концентрацій іонів міді (рис. 1).

При концентрації сірчанокислої міді 10, 50 і 75 мг/л спостерігали відставання росту культури від контрольного варіанта на 25, 17 і 40% відповідно, через добу від початку експерименту і на 24, 41 и 48% через 7 діб, тобто пряма залежність між концентрацією сірчанокислої міді в середовищі і ступенем пригнічення росту була відсутньою (рис. 1 а).

При внесенні в культуру мікро водоростей іонів міді в концентрації 100 мг/л поділ клітин припинявся, і через 3-4 доби культура гинула. Різниця біологічного ефекту, який спричинює сірчанокисла мідь при повторних послідовних впливах порівняно з первинним впливом (рис. 1), свідчить про існування системи адаптації у досліджуваних мікроводоростей до концентрацій сірчанокислої міді 10, 50 та 75 мг/л.

Відомо, що зняття стрес-фактора (перенесення біосистеми в нормальні умови) у випадку функціонування механізмів адаптації повинно приводити до швидкого відновлення системи до вихідного стану. Виявлено, що перенесення мікроводоростей в стандартні умови спричиняло до стимуляції росту культури з подальшим наближенням до рівня контролю, що також свідчить про наявність у них здатності до адаптації (рис. 2).

Такий характер реакції відповіді підтверджує припущення про те, що клітини мікроводоростей здатні адаптуватися до високих концентрацій сірчанокислої міді в середовищі по-різному, залежно від концентрації останньої.

Аналіз динаміки вмісту іонів міді в клітинах D. viridis показав, що найбільша кількість іонів міді в клітинах виявлена через добу після першого внесення сірчанокислої міді в середовище (1,0±0,1);(20,7±1,8);(19,4±1,0); та другого внесення - (3,3±0,1);(11,6±1,5);(20,1±1,6) для концентрацій 10, 50 і 75 мг/л відповідно. У процесі культивування з першої до другої доби відмічали зменшення вмісту іонів міді в клітинах після двох послідовних внесень сірчанокислої міді. Для різних її концентрацій швидкість зменшення кількості іонів міді в клітинах була різною. Так, після першого внесення солі міді в концентрації 10 мг/л на 7-му добу вміст іонів міді в клітинах зменшувався до (0,5±0,3*); для 50 мг/л - до (2,4±0,1*), а для 75 мг/л – до (6,8±0,8*) або в 2; 8,6 і 2,8 раза.

Після третього внесення спостерігали збільшення кількості іонів міді в клітинах на 7-му добу для концентрацій 10 і 75 мг/л, і це може бути наслідком зміни швидкості екскреції іонів міді в середовище. Для підтвердження цього припущення в наступній серії експериментів визначали динаміку вмісту іонів міді в культуральному середовищі.

Можливі механізми адаптації Dunaliella viridis до високих концентрацій іонів міді в середовищі. Роль системи екскреції іонів міді в культуральну рідину. Виявилося, що після першого внесення в культуру сірчанокислої міді в концентрації 10 мг/л її кількість у культуральній рідині не змінилася через 1 і 3 доби і значно збільшувалася через 7 діб (рис. 3а). Внесення в культури сірчанокислої міді в концентраціях 50 і 75 мг/л супроводжувалося збільшенням кількості іонів міді в культуральній рідині через 3 і особливо 7 діб. Після другого й третього внесення кількість іонів міді в культуральній рідині не змінювалася з 1-ї по 7-му добу культивування при концентрації 10 мг/л і збільшувалася на 7-му добу у випадку 50 і 75 мг/л (рис. 3б,в). Можна припускати, що це обумовлено визволенням іонів міді з клітин мікроводоростей.

З одержаних результатів можна зробити висновок, що D. viridis здатна адаптуватися до високих концентрацій сірчанокислої міді. У клітинах функціонує дозо-залежний механізм екскреції, який, імовірно, відіграє важливу роль в адаптації цих мікроводоростей до сірчанокислої міді. Разом із тим, у D. viridis функціонує механізм біоакумуляції, при цьому слід відзначити, що й акумулятивна спроможність даної водорості на порядок вища, ніж у Chlorella vulgaris за однакових умов культивування.

Фактори, які впливають на токсичність сірчанокислої міді у Dunaliella viridis. Встановлено, що токсичний ефект сірчанокислої міді, який виявляється у пригніченні росту культури, залежить від способу внесення токсичних елементів у культуру. Виявлено, що культуральна рідина, яка отримана з культур різного віку, після внесення 50 мг/л сірчанокислої міді, призводила до різного ефекту пригнічення швидкості росту культури. Так, кількість клітин на 4-ту добу культивування у 2-х добової культури збільшувалася на 86%, у 6-ти добової на 20%, а у 4-х і 8-ми добової не змінювалася порівняно із вихідним рівнем.

Виявилося, що при внесенні сірчанокислої міді разом із свіжим середовищем Артарі токсичність була менш вираженою. Так, культура D. viridis 2-х і 4-х добового віку продовжувала рости, і на 4-у добу кількість клітин збільшувалася в 3,6 раза порівняно з вихідною або на 260 %. Однак швидкість росту культури в цьому експерименті відставала від контрольного варіанта (ріст без сірчанокислої міді) в 2,9 раза. Клітини 6-ти добового віку, які культивувалися на свіжому середовищі Артарі з 50 мг/л сірчанокислої міді, практично не росли, їхня кількість до 4-ї доби збільшувалася тільки на 50%.

Токсичність сірчанокислої міді за різних способів внесення іонів міді в культуру визначається динамікою зв’язування іонів міді клітинами та їхньою екскрецією в культуральну рідину при подальшому культивуванні. Різниця в чутливості до дії сірчанокислої міді, ймовірно, може визначатися гетерогенністю клітин у культурі.

Індукція резистентності до сірчанокислої міді у Dunaliella viridis. Досліджена можливість індукції резистентності клітин D. viridis до сірчанокислої міді в хронічному експерименті. Показано, що в процесі тривалого культивування клітин водоростей з 10 або 20 мг/л сірчанокислої міді формується резистентний до іонів міді штам клітин (мідєрезистентний). Формування індукованої резистентності клітин знаходиться в прямій залежності від кількості пересадок культури та в зворотній залежності від концентрації сірчанокислої міді в середовищі. Індукована резистентність можливо супроводжується формуванням стійкості мембран клітин водоростей до дії іонів міді (рис. 4).

З урахуванням цих особливостей була запропонована гіпотеза про селективно-метаболічну систему формування резистентності клітин водоростей до іонів міді. Суть її полягає в тому, що в популяції клітин водоростей присутні відносно стійкі до іонів міді клітини, які мають селективну перевагу, і їхня кількість поступово збільшується. Крім того, в цих клітинах індукуються метаболічні зміни, що формують резистентність до іонів міді. Ці зміни можуть бути пов’язані з індукцією стрес-білків, посиленням системи депонування або екскреції іонів міді.

Функціональна гетерогенність клітин Dunaliella viridis та чутливість до дії сірчанокислої міді. Досліджували морфологічну гетерогенність клітин у культурі за зміною площини подовжнього перетину клітин у процесі культивування з 4-ї по 10-ту добу росту. Виявлено, щкультура D. viridis представлена гетерогенними за площиною подовжнього перетину клітинами від 13 до 63 мкм2 з найбільшою кількістю клітин розміром 37 мкм2. Якщо на початку культивування спостерігалося за розміром 6-7 відносно незалежних класів клітин, о в процесі росту, й особливо до 10 –ї доби, цей показник змінювався практично лінійно, тобто мало місце Гаусов розподіл клітин за площиною. Можна припустити, що клітини, які розрізняються між собою за розмірами, можуть відрізнятися і за функціональною активністю, і що різниця в реакції відповіді клітин водоростей на токсикант на різних етапах культивування може пояснюватися їхньою функціональною гетерогенністю. Для перевірки цього припущення клітини розділяли диференційним центрифугуванням на дві фракції – “важку” та “легку” фракції й оцінювали їхню функціональну активність за такими показниками як інтенсивність синтезу РНК, загальних білків та ДНК. Виявлено, що швидкість синтезу РНК, ДНК та білка в клітинах “важкої” фракції значно вища через 6 годин порівняно з клітинами “легкої” фракції. До 24 та 48 години показники вирівнювалися (рис. 5). Отже до складу “легкої” фракції входили клітини з вихідною низькою метаболічною активністю, однак для них характерна висока швидкість зростання функціональної активності.

До складу “важкої” фракції входили клітини з високою вихідною метаболічною активністю, яка незначно порівняно з клітинами “легкої” фракції збільшувалася до свого максимуму за конкретних умов культивування. До складу двох фракцій входили клітини, які знаходились на різних етапах свого біогенезу та мали різну метаболічну активність.

Можна припустити, що клітини, які розрізнюються за функціональною активністю, по-різному відповідають на дію факторів середовища. Встановлено, щклітини "легкої" фракції зв’язували значно менше іонів міді, ніж клітини "важкої" фракції. Різниця між фракціями була найбільшою за концентрації 5 мг/л сірчанокислої міді (0,84±0,10 і 5,68±0,14*) та зменшувалася за концентрації 10 і 50 мг/л у середовищі (3,64±0,71 і 7,39±0,13*); (33,46±4,96 і 41,70±2,28*) відповідно.

Одержані результати свідчать про наявність різниці між клітинами "важкої" та "легкої" фракції у формуванні адаптивної реакції на присутність іонів сірчанокислої міді у культуральному середовищі.

Виявлено, що клітини "легкої" фракції не тільки зв’язують меншу кількість іонів міді, але й набагато швидше від неї звільняються, ніж клітини "важкої" фракції. Так, при концентрації сірчанокислої міді 5 мг/л на 7-у добу культивування в клітинах "важкої" фракції залишалось 60% міді порівняно з першою добою,

а в клітинах "легкої" фракції – лише 9,5 %, тобто в 6,4 раза менше, а при концентрації 10 мг/л - менше у 8,7 разів.

Характеристика мідєрезистентного штаму Dunaliella viridis. Мідє-резистентний штам водоростей Dunaliella viridis культивували на середовищі Артарі з 20 мг/л сірчанокислої міді протягом чотирьох років. Для перевірки стійкості цих клітин до іонів міді їх переводили на середовище, яке містило іони міді в летальній концентрації 100 мг/л для вихідної культури клітин D. viridis. Було виявлено, що пересів мідєрезистентного штаму D. viridis на середовище з такою концентрацією сірчанокислої міді не призводив до їхньої загибелі, а навпаки, ріст культури продовжувався. Так, якщо в контрольній культурі на 21 добу росту концентрація клітин складала 18 млн./мл, то в культурах, які інкубувалися на середовищі з 20 і 100 мг/л сірчанокислої міді, концентрація була 14 та 16 млн./мл, тобто практично була такою ж. Ці результати підтверджують висновок, що одержаний штам є мідє-резистентним.

Для оцінки біохімічних характеристик мідєрезистентного штаму D.viridis оцінювали вміст у досліджуваних клітинах нуклеїнових кислот і білків (табл. 1).

Таблиця 1. Вміст нуклеїнових кислот і білків у клітинах мідєрезистентного та мідєчутливого штаму D.viridis

Характеристика штаму | ДНК, мкг на млн. клітин | РНК, мкг на млн. клітин | Білок, мкг на млн. клітин

Мідєчутливий штам | 0,042 0,016 | 0,64 0.09 | 2,39 0,23

Мідєрезистентний на 20 мг/л | 0,029 0,003 | 0,45 0,06 | 1,33 0,05

Мідєрезистентний на 100 мг/л | 0,032 0,002 | 0,45 0,02 | 1,83 0,13

Було виявлено, що за вмістом ДНК і РНК клітини D.viridis, які тривалий час культивували з 20 та 100 мг/л сірчанокислої міді, характеризувалися дещо меншим вмістом ДНК і РНК порівняно з контрольною культурою. В клітинах мідє-резистентного штаму вміщувалося і менше білка в розрахунку на 1 млн. клітин, ніж у контролі (табл. 1).

У наступній серії експериментів проведено дослідження складу водорозчинних білків клітин контрольної та мідєрезистентної культури. Виявлено, що у резистентної до іонів міді культури змінювався склад певних фракцій білків цитозолю. Так, в контрольній культурі D.viridis був присутній білок з молекулярною масою близько 50 кДа, який не виявлявся в резистентних культурах, що вирощувалися з 20 і 100 мг/л сірчанокислої міді. Цей білок не виявлявся і в культурі водоростей навіть після одноразового внесення сірчанокислої міді. Поряд із цим, у клітинах, які культивувалися з сірчанокислою міддю, були присутні дві нові фракції білків (рис. 6).

У мідєрезистентних клітинах порівняно з контрольною культурою не виявлялося й білка з молекулярною масою приблизно 35 кДа. Навпаки, в них порівняно з контрольною культурою збільшувався вміст білка з молекулярною масою 25 кДа. Отже, індукція мідє-резистентності в клітинах D.viridis супроводжувалась зменшенням вмісту білків та зміною спектра білків клітини. У мідє-резистентних клітинах був дещо зменшений вміст ДНК та РНК.

Особливості біоакумуляції іонів селену та заліза мідєчутливим та мідє-резистентним штамами Dunaliella viridis. Збільшення вмісту селеніту натрію в культуральному середовищі до 0,5 мг/л призводило до накопичення селену в клітинах до 8 мг на 1 кг сухої біомаси водоростей. Подальше підвищення концентрації іонів селену в культуральному середовищі D.viridis в 5 разів супроводжувалося збільшенням вмісту селену в клітинах майже в 5 разів порівняно з його концентрацією 0,5 мг/л (табл. 2). Отже, для клітин D. viridis характерна наявність певної концентрації, з якої селен починає накопичуватися клітинами, і в подальшому існує пряма кореляція між збільшенням вмісту селену в середовищі та його накопиченням у клітинах, можливо, до прояву ефекту цитотоксичності.

Можна припускати, що на характер біоакумуляції селену, може впливати присутність інших мікроелементів у клітинах водоростей. У зв’язку з цим становить інтерес дослідження здатності накопичувати селен клітинами мідєрезистентного штаму D. viridis.

Виявилося, що для мідєрезистентного штаму не спостерігалося лінійної залежності між вмістом селену в клітинах та культуральному середовищі, що було характерно для контрольної культури (табл. 2). Більше того, мідєрезистентний штам накопичував значно менше селену, ніж мідєчутливий. Необхідно звернути увагу на те, що збільшення вмісту селеніту натрію в культуральному середовищі мідє-резистентного штаму до 0,5 і особливо до 2,5 мг/л супроводжувалося зменшенням вмісту в клітинах D.viridis іонів міді і більшою мірою заліза.

Таблиця 2. Вміст мікроелементів у мг/кг сухої маси в клітинах водоростей після внесення селеніту натрію (Na2SeO3) до культурального середовища мідєчутливого й мідєрезистентного штаму Dunaliella viridis

Концентрація селеніту натрію, мг/л | Мідєчутлива культура, вміст мг/кг сухої маси | Мідєрезистентна культура, вміст мг/кг сухої маси

Fe | Cu | Zn | Se | J | Fe | Cu | Zn | Se | J

0,1 | 0 | 23 | 0 | 0 | 40 | 624 | 524 | 170 | 2 | 73

0,5 | 0 | 437 | 0 | 8 | 48 | 111 | 414 | 282 | 10 | 50

2,5 | 0 | 278 | 70 | 35 | 91 | 0 | 129 | 101 | 11 | 36

Вміст іонів заліза в клітинах водоростей є важливим показником з точки зору використання біомаси цих клітин як протианемічного засобу. Внесення хлорного заліза до культурального середовища контрольної культури до кінцевої концентрації 1 мг/л супроводжувалося накопиченням у клітинах D.viridis іонів заліза до 1538 мг на кг сухої біомаси. Збільшення вмісту заліза в культуральному середовищі в 5 разів призводило до підвищення його кількості в клітинах у 5,5 раза і подальше збільшення в середовищі ще в 2 рази, супроводжувалося зростанням вмісту в клітинах у 2,2 раза (табл.3). Отже, підвищення кількості іонів заліза в культуральному середовищі контрольної культури супроводжувалося лінійним збільшенням їх у клітинах D.viridis.

Таблиця 3. Вміст мікроелементів у мг/кг сухої маси в клітинах водоростей після внесення хлорного заліза (FeCL3) до культурального середовища мідєчутливого й мідєрезистентного штаму Dunaliella viridis

Концентрація хлорного заліза, мг/л | Мідєчутлива культура, вміст мг/кг сухої маси | Мідєрезистентна культура, вміст мг/кг сухої маси

Fe | Cu | Zn | Se | J | Fe | Cu | Zn | Se | J

1 | 1538 | 88 | 343 | 0 | 75 | 417 | 2307 | 293 | 0 | 39

5 | 8548 | 57 | 549 | 0 | 62 | 8960 | 455 | 216 | 0 | 25

10 | 19063 | 126 | 277 | 0 | 56 | 22853 | 546 | 240 | 0 | 95

Оцінка вмісту хлорного заліза в клітинах резистентної культури показала, що внесення іонів заліза до культурального середовища D.viridis до кінцевої концентрації 1 мг/л призводило до накопичення в клітинах заліза до 417 мг на кг сухої біомаси. Збільшення вмісту заліза в культуральному середовищі в 5 разів, супроводжувалося зростанням його кількості в клітинах в 21,5 раза, а подальше підвищення в середовищі ще в 2 рази призводило до збільшення вмісту іонів заліза в клітинах тільки в 2,5 (табл. 3). Отже при збільшенні кількості хлорного заліза в культуральному середовищі резистентної культури не спостерігалося лінійного росту вмісту іонів заліза в клітинах, що було характерно для контрольної культури. При цьому важливо відзначити той факт, що зростання вмісту іонів заліза в культуральному середовищі мідєрезистентного штаму супроводжувалося зменшенням вмісту іонів міді та значним накопиченням іонів цинку в клітинах D.viridis (табл. 3).

Одержані результати вказують на наявність взаємовпливу мікроелементів в їх біоакумуляції клітинами водоростей D.viridis, і це треба враховувати при одержанні біомаси, збагаченої мікроелементами.

ВИСНОВКИ

1. Клітини мікроводоростей Dunaliella viridis Teod. здатні адаптуватися до високих концентрацій сірчанокислої міді, що забезпечується за рахунок накопичення та тривалого зв’язування частини іонів металів, а також за рахунок функціонування дозо-залежної системи екскреції іонів металів у середовище. Одержано штам мікроводоростей Dunaliella viridis, стійкий до високих концентрацій іонів міді (токсичних для вихідної культури), і показана можливість отримання біомаси водоростей Dunaliella viridis, збагаченої мікроелементами (залізо, селен, мідь), яка може бути використана як перспективна харчова добавка при лікуванні мікроелементозів.

2. Виявлені розбіжності між Dunaliella viridis і Chlorella vulgaris у стійкості до іонів міді і їхньою здатністю накопичувати іони міді. Мікроводорості Dunaliella viridis мають здатність накопичувати більшу кількість іонів міді порівняно з мікроводоростями Chlorella vulgaris.

3. Показано, що переведення культури Dunaliella viridis, адаптованої до росту на середовищі з іонами міді, на середовище без них супроводжувалося швидким вивільненням іонів міді із клітин до культурального середовища, тобто накопичення іонів міді є оборотним процесом.

4. Одержано новий штам Dunaliella viridis, який є стійким до високих концентрацій сірчанокислої міді. Клітини цього штаму відрізнялися від контрольного штаму з кількісного та якісного складу білків. У мідєрезистентного штаму зменшувався вміст тотальних білків, але збільшувався вміст білків з молекулярною масою близько 25 кДа, зменшувався вміст нуклеїнових кислот.

5. Токсичність сірчанокислої міді для культури клітин Dunaliella viridis залежала від функціонального стану культури (вік культури, інтенсивність проліферації) та способу внесення розчину сірчанокислої міді в культуру і визначалася інтенсивністю накопичення сірчанокислої міді в клітинах.

6. Культура клітин водоростей Dunaliella viridis є гетерогенною (морфологічно та функціонально). Культура Dunaliella viridis представлена клітинами, які відрізнялися між собою інтенсивністю синтезу РНК, ДНК, білків та здатністю накопичувати іони міді.

7. Запропонована селективно-метаболічна гіпотеза індукованої резистентності клітин водоростей, суть якої полягає в тому, що в популяції клітин Dunaliella viridis присутні відносно стійкі клітини, які мають селективну перевагу.

8. Клітини Dunaliella viridis мають високу біоакумуляційну здатність не тільки до іонів міді, але й до іонів заліза, селену та інших мікроелементів. Чутливі та резистентні до іонів міді клітини мали різну біоакумуляційну здатність до іонів інших металів, що дозволяє отримувати біомасу водоростей з різним мікроелементним складом.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Божков А.И., Голтвянский А.В. Индукция резистентности к сернокислой меди у Dunaliella viridis Teod. // Альгология.-1998.- Т.8.-№2.-С.162-169.

2. Божков А.И., Голтвянский А.В. Функциональная гетерогенность Dunaliella viridis Teod. (Chlorophyta) и чувствительность к действию сернокислой меди //Альгология.-2000.-Т.10.-№1.-С.22-31.

3. Голтвянский А.В. Способность Chlorella vulgaris к биоаккумуляции при сублетальных концентрациях сернокислой меди // Биологический вестник. – 2000. – Т.4. – N1-2. – с. 68-71.

4. Божков А.І., Бойко М.І., Голтвянський А.В. Науковий проект "Використання комплексу високовольтних імпульсних дій у регулюванні проліфераціі клітинних культур". Свідоцтво про Державну реєстрацію прав автора на твір ПА № 807. Зареєстровано в Державному агентстві України з авторських і суміжних прав 20 листопада 1997 р.-8 с.

5. Голтвянский А.В. Биоаккумуляция ионов металлов клетками Dunaliella viridis Teod. (CHLOROPHYTA) // Актуальные проблемы современной альгологии:Тез. докладов II Международной конференции.- Киев: Институт ботаники, 26-28 мая 1999. Альгология.-1999.-Т.9.-№2.-С.33.

6. Голтвянский А.В. Механизмы формирования устойчивости клеток Dunaliella viridis к избытку сернокислой меди //РАСТЕНИЕ, МИКРООРГАНИЗМЫ И СРЕДА. Материалы межвузовской конференции молодых ученых. Санкт-Петербург, 2000.-С.21.

7. Божков А.И., Длубовская В.Л., Линник М.А., Голтвянский А.В. Временная характеристика индуцированных эпигенетических изменений в онтогенезе //Биологические механизмы старения: Тез. докладов IV Международного симпозиума.- Харьков: НИИ биологии, 24-27 мая 2000.-С.15.

АНОТАЦІЯ

Голтвянський А.В. Біоакумуляція іонів металів клітинами зелених водоростей та одержання біомаси, багатої на мікроелементи.-Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія - Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна Національної академії наук України, Київ, 2002.

Дисертація присвячена дослідженню можливих механізмів стійкості мікроводоростей і біоакумуляції іонів металів клітинами мікроводоростей Dunaliella viridis з метою одержання біомаси водоростей, збагаченої на такі важливі мікроелементи, як мідь, залізо, селен. Показано, що клітини Dunaliella viridis здатні адаптуватися до високих концентрацій іонів міді. Одержано штам резистентний до високих концентрацій сірчанокислої міді. Показано, що стійкість клітин водоростей Dunaliella viridis до дії іонів міді ґрунтується на їхній здатності специфічно зв’язувати частину іонів і на функціонуванні механізму екскреції іонів міді у середовище.