НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І

КРІОМЕДИЦИНИ

ГЕРАЩЕНКО ГАННА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК: 615.361.451.014.41

ФУНКЦІОНАЛЬНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ОРГАННОЇ КУЛЬТУРИ

НАДНИРКОВИХ ЗАЛОЗ ПРИ КРІОКОНСЕРВУВАННІ ТА КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦІЇ

03.00.19 - кріобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології та кріомедицини Національної Академії наук України, Харків.

Науковий керівник: доктор біологічних наук Бондаренко Тетяна Петрівна, Інститут проблем кріобіології та кріомедицини Національної Академії наук України, завідувач відділу кріобіохімії та фармакології нейрогуморальних систем, Харків

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Юрченко Тетяна Миколаївна, Інститут проблем кріобіології та кріомедицини Національної Академії наук України, завідувач відділу кріоморфології, Харків

доктор біологічних наук, професор Гладкова Алла Іванівна, Інститут проблем ендокринних патологій Національної Академії медичних наук України, завідувач лабораторії репродуктивої ендокринології, Харків

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, відділ експериментальних клітинних систем, низькотемпературний банк клітинних культур, Київ

Захист відбудеться “ 21 ” травня 2002 року о 13.30 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології та кріомедицини НАН України за адресою: м. Харків, вул. Переяславська, 23, актовий зал Інституту проблем кріобіології та кріомедицини.

Поштова адреса: 61015, Харків-15, вул. Переяславська, 23, Інститут проблем кріобіології та кріомедицини.

З дисертацією можна ознайомитися у науковій бібліотеці Інституту проблем кріобіології та кріомедицини за адресою: Харків-15, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розісланий “ 10 ” квітня 2002р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01

д.мед.н., професор А.М. Гольцев

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

У медичній практиці, особливо останнім часом, провідне місце займає метод трансплантації ендокринних тканин: щитовидної, паращитовидної, підшлункової залоз, а також надниркових залоз, сім’яників у вигляді фрагментів чи органних і клітинних культур [Грищенко В.И. 1994, Бондаренко Т.П. 1999, Турчин И.С. 1996]. Широке використання глюкокортикоїдів для лікування найрізноманітніших патологій, що призводить до розвитку вторинної надниркової недостатності, особливо гостро порушує питання про пошук нових методів лікування як основної патології, так і супутніх ускладнень. Розвиток технології культивування різних клітин і тканин [Гаврилюк Б.К. 1983, Fujieda K. 1981, Hornsby P.J. 1984] сприяв впровадженню в медичну практику альтернативного методу - трансплантації органних культур ендокринних тканин, серед яких органні ксенокультури займають належне місце [ Кім Джон Сан 1986, Лучицький Є.В. 2000, Тронько Н.Д. 2000].

Актуальність теми. У більшості описаних способів трансплантацій органних культур провідне місце займають нативні культури. Це ускладнює широке впровадження даного методу, оскільки культури необхідно використовувати відразу ж після закінчення їхнього росту. Вирішити дану проблему можливо за умов створення низькотемпературних банків трансплантаційного матеріалу.

На сьогоднішній день розроблений спосіб кріоконсервування органної культури надниркових залоз [Бондаренко Т.П., Легач Е.И. 1999], що знайшов своє застосування в медичній практиці. Однак дотепер залишається недостатньо дослідженим питання про те, чи впливає тривалість їхнього збереження в низькотемпературному банку на функціональні характеристики ендокринного матеріалу. Залишається також відкритим питання про терміни життя трансплантату кріоконсервованої органної культури, хоча відомо, що нативний трансплантат функціонує від 6 до 18 місяців [Січінава Р.М. 2000, Турчин І.С. 1996].

Останнім часом з'явилися дані про те, що секреція глюкокортикоїдів відбувається, на відміну від інших ендокринних тканин, не за принципом нагромадження певної кількості гормонів з наступною секрецією, а здійснюється за допомогою двох незалежних механізмів: розрізняють базальну і стимульовану секрецію, які здійснюються по своїх автономних шляхах. Ряд дослідників указують на існування 2-ох каналів транспорту цих гормонів [Arola J. 1993, Mgbonyebi et al O.P 1994, 1998].

Для з'ясування функціональних характеристик органних культур надниркових залоз, включаючи етапи росту культури, її обробку кріопротекторами, заморожування, низькотемпературне зберігання і таке інше, дуже важливим моментом є реєстрація рівнів як біосинтезу, так і секреції гормонів. Наявні методи дослідження кількості гормонів є дуже суперечливими і не завжди відтворюваними [Герег Ш. 1985, Рєзников А.Г. 1980, Kowal J., Feidler R. 1968]. Дотепер залишається незрозумілим, як фактори середовища, включаючи температуру, впливають на процес екстракції гормонів з біологічного матеріалу, що порушує питання про конкретизацію певних етапів існуючих методів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в рамках науково-дослідної теми Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України №73 "Біохімічні і фармакологічні аспекти кріоконсервування ендокринних тканин і еритроцитів" (шифр - 2.2.6.73, № 02-13-73) і теми №3 "Дослідження механізмів функціонування кріоконсервованих органних культур ендокринних тканин"(шифр - 2.2.6.03, № 0101U003478).

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи є аналіз функціонального стану кріоконсервованої органної культури надниркових залоз новонароджених поросят (КОКНЗНП) in vitro і у вигляді ксенотрансплантату в залежності від термінів низькотемпературного зберігання й умов її обробки стимуляторами або інгібіторами секреції.

Для здійснення даної мети передбачалося вирішити ряд задач:

1. Досліджувати функціональні характеристики КОКНЗНП у залежності від термінів зберігання в низькотемпературному банку на основі дослідження рівня споживання культурами для стероїдогенезу екзогенного холестерину, їхніх морфологічних характеристик, а також визначення базальної і стимульованої секреції гормонів адаптованим методом, що забезпечує максимальну екстрактивність гормонів за результатами оцінки факторів середовища, включаючи температуру на всіх етапах визначення глюкокортикоїдів.

2. Вивчити вплив стимулятора стероїдогенезу (екстракту гіпофіза, що містить АКТГ) у залежності від термінів його введення в середовище культивування на функціональні характеристики органної культури та її чутливість до низьких температур, а також вплив модифікаторів гормональної секреції (хлориду кадмію й екстракту гіпофіза) на стан кріоконсервованої культури in vitro та після ксенотрансплантації.

3. Оцінити стан адреналектомованих тварин після ксенотрансплантації їм кріоконсервованих культур з різною функціональною активністю на основі оцінки біохімічних і фізіологічних параметрів тварин, а також провести гістологічний і біохімічний аналізи трансплантатів.

Об'єкт дослідження – Вплив кріоконсервування і термінів низькотемпературного зберігання на морфофункціональні характеристики органної культури надниркових залоз новонароджених поросят.

Предмет дослідження – Кріоконсервована органна культура надниркових залоз новонародженоих поросят in vitro і при ксенотрансплантації.

Методи дослідження. У роботі використовувався метод органного культивування надниркових залоз, метод заморожування культури у присутності 5% димексиду, флуориметричний метод визначення 11-ОКС, спектрофотометричний метод визначення холестерину, колориметричний метод визначення білка для дослідження біохімічних параметрів, методи світлової мікроскопії для дослідження морфологічних характеристик нативної, кріоконсервованої ОКНЗНП, трансплантатів культури і надниркової залози щурів.

Наукова новизна одержаних результатів. Представлено порівняльний аналіз зв'язку між станом адреналектомованих щурів після трансплантації їм кріоконсервованих органних культур наднирків новонародженого поросяти, що відрізняються рівнем базальної і стимульованої секреції. Уперше представлений гістологічний аналіз трансплантатів, що відрізняються за рівнем секретуючої здатності. Установлено, що трансплантовані культури розсисаються змішаним клітинно-ферментативним шляхом та шляхом організації. Навколо стимульованих екстрактом гіпофізу органних культур розвивається менше за силою демаркаційне запалення, ніж навколо нестимульованих. Установлено, що культура, оброблена стимулятором під час культивування, є більш чутливою до процесу кріоконсервування.

Практичне значення одержаних результатів. Органна культура надниркових залоз новонароджених поросят зберігає свої функціональні характеристики після 1-го року низькотемпературного зберігання. Термін життя кріоконсервованого ксенотрансплантату залежить від його функціонального стану до трансплантації. До 45-ої доби після трансплантації він характеризується наявністю секретуючих клітин, що мають здатність до стероїдогенезу і забезпечують підтримку рівня глюкокортикоїдів у адреналектомованих тварин на 80-87% в порівнянні з контрольними тваринами, що ще раз свідчить про придатність використання матеріалу в клінічних цілях. На основі оцінки факторів середовища, включаючи температуру, модифіковано флуориметричний метод визначення 11-ОКС, що дозволяє скоротити час і втрати глюкокортикоїдів при визначенні.

Особистий внесок здобувача. Винесені на захист положення і результати отримані дисертантом особисто. Роботи, що мають відношення до теми дисертації, опубліковані у співавторстві з Бондаренко Т.П. та іншими, відображають результати зі спільного планування і проведення експериментів, обговорення результатів і підготовки матеріалів до друку.

Автор самостійно провів аналіз отриманих результатів і зробив висновки в роботі.

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертаційної роботи доповідалися й обговорювалися на наукових конференціях молодих учених ІПКіК сумісно з кафедрою ЮНЕСКО у 2000 і 2001 роках, м. Харків; науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження акад. І.М.Буланкіна, 2001 рік, м. Харків; на конференції молодих учених: Медицина 3-го тисячоліття, 2001 рік, м. Харків; на 2-ому з'їзді трансплантологів України, 2001 рік, Київ; на Всеукраїнській науковій конференції "Успіхи і перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини", 2001 рік, Харків; на науково-практичній конференції, присвяченій 150-річчю з дня народження академіка В.Я. Данилевського: "Патогенетичні аспекти фармакотерапії ендокринних захворювань", 2002 рік, Харків; на 35-му щорічному з'їзді Суспільства кріобіологів, 1998 рік, Пітсбург, США.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 3 статті у фахових виданнях, 5 тез доповідей, видані методичні рекомендації.

Структура дисертації. Матеріали викладені на 180 стор. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень та їхнього обговорення, заключення, висновків, списку використаних джерел, що нараховує 291, з яких 138 - вітчизняних джерел і 153 – іноземних. Робота ілюстрована 26 рисунками, 8 таблицями, 29 мікрофотографіями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

В експериментах використовували органну культуру надниркових залоз, яку одержували з надниркових залоз новонароджених поросят (300 шт.), що доставляються з Агрокомплексу "Слобожанський" Харківської області, Чугуївського району, с. Граково, а також самці білих щурів вагою 150-170 г (210 шт.) у якості реципієнтів для трансплантації культури. Поросят забивали гільотинуванням з використанням легкого ефірного наркозу. Екстирпацію ендокринних органів здійснювали з дотриманням суворих правил асептики й антисептики. З тканин надниркової залози одержували органну культуру [Тронько Н.Д. 1988], вирощувану в середовищі на основі середовища 199 з 10% інактивованою телячою ембріональною сироваткою, антибіотиками: пеніцилін - 100 од/мл і канаміцин - 150 од/мл. Термін культивування - 5 діб.

Рівень глюкокортикоїдів визначали флуориметричним методом [Рєзников А.Г. 1980] у нашій модифікації [Бондаренко Т.П., Геращенко А.В. 2001], і розраховували на білок, що визначався за методом Бредфорда [Bradford M.M. 1976], або масу тканини. Інтенсивність флуоресценції вимірювали на флуориметрі Hitachi-MPF-2A при довжині хвилі збудження 470 нм і довжині хвилі випущення 525 нм. Як стимулятор стероїдогенезу використовували синтетичний аналог адренокортикотропного гормону (АКТГ) синактен (0.2 Од/мл) і 10 % екстракт гіпофіза (ЕГ), одержувані за методикою [Легач Е.И. 1998] у дозі 10 і 50 мкл на 1 мл ОКНЗНП і 1 мл середовища. У ряді окремих експериментів використовували інгібітор стимульованої секреції – хлорид кадмію (CdCl2) у концентрації 10-2 М. Здатність до стероїдогенезу визначали за здатністю культури утилізувати екзогенний холестерин, обумовлений спектрофотометрично дігітоніновим методом (Кейтс М. 1975). Заморожування здійснювали у присутності 5 % димексиду за методом [Бондаренко Т.П., Легач Е.И. 1999] у поліетиленових ампулах по 10 мл. Після низькотемпературного зберігання при -196С (1-360 днів) робили відігрівання на водяній бані при +40С до зникнення твердої фази, потім відігріту ОКНЗНП відмивали від димексиду середовищем 199.

Двосторонню адреналектомію щурам здійснювали під ефірним наркозом за методикою (Кудряшов Б.А. 1984). Після адреналектомії тварини знаходилися в приміщенні при температурі 25-27C, а раціон уключав їжу, збіднену солями калію, і воду у вигляді 1 % розчину хлористого натрію. Через 30 діб після операції тваринам здійснювалася ксенотрансплантація (КсТц) кріоконсервованої ОКНЗНП (КОКНЗНП). Терміни КсТц з'ясовані експериментально за розвитком гіпокортицизму у А/Е тварин (40 шт).

У першій серії експериментів експериментальні тварини були розбиті на групи (100 шт): ложнооперовані (Л/О) тварини, Л/О тварини з КсТц КОКНЗНП без впливів, з інкубацією з 10 мкл ЕГ і 50 мкл ЕГ, адреналектомовані (А/Э) , А/Е тварини з КсТц КОКНЗНП без впливів, з інкубацією з 10 мкл ЕГ і 50 мкл ЕГ.

В другій серії експериментів трансплантували рекультивовану протягом 1 доби КОКНЗНП. Експериментальні тварини були розбиті на групи (70 шт): Л/О щури, А/Е щури, А/Е щури з КсТц рекультивованої КОКНЗНП без впливів, А/Е щури з КсТц рекультивованої КОКНЗНП, інкубованої з 10 мкл ЕГ, А/Е щури з КсТц рекультивованої КОКНЗНП, інкубованої з CdCl2 (10-2 М).

Тварин забивали через 30 діб після КсТц у першій серії експериментів і 45-ої доби в другій серії експериментів. Трансплантат брали на гістологічний і біохімічний аналізи. Аналізували зміст глюкокортикоїдів у плазмі крові експериментальних тварин, співвідношення мас внутрішніх органів до маси тіла тварини. У сім’яниках визначали рівень 11-ОКС. Надниркові залози Л/О щурів брали для визначення в них 11-ОКС та на гістологічний аналіз.

Матеріал для гістологічних досліджень фіксували 10% нейтральним формаліном і піддавали стандартній методиці заливання в парафін (Киселі Д. 1962). Зрізи офарблювали гематоксилін-еозіном (Киселі Д. 1962; Лилли Р. 1969), дослідження проводили під світловим мікроскопом зі збільшенням 1040 і 1090 (Шрейбер В. 1987). Мікрофотозйомку - за допомогою мікрофотонасадки МФНЕ-1У4.2.

Статистичну обробку результатів здійснювали за методом Стьюдента-Фішера за допомогою пакета програм Ехсеl і SigmaPlot.

Результати досліджень та їхнє обговорення

На сьогоднішній день існує багато різновидів флуориметричного методу визначення глюкокортикоїдів, які відрізняються способом екстракції, що відбивається на кількості екстрагованого гормону і відтворюваності методу. При цій процедурі може відбуватися до 30-60 % утрати гормонів. Для оптимізації флуориметричного методу визначення гормонів нами були проведені дослідження з вивчення впливу температури, часу й умов центрифугування на екстракцію гормонів.

Проведені дослідження дозволили нам зробити висновок про те, що кількість гормону, що екстрагується, і відтворюваність флуориметричного методу визначення глюкокортикоїдів залежать від температури, концентрації гормонів і часу контакту останніх з реагентами. Підвищення температури до 37С, концентрація гормонів шляхом вакуумного випарювання і термостатування з флуоресцентним реагентом (3 хв 60С, 3 хв 22 С) забезпечують відразу розвиток максимуму флуоресценції за 6 хв у порівнянні з 1.5 годинами за стандартною методикою і дозволяють знизити втрати глюкокортикоїдів, підвищити відтворюваність. Усі наступні експериментальні дані, представлені в нашій роботі з визначення гормонів, були проведені на основі використання експериментальних умов, виявлених і описаних у цьому розділі роботи.

Заморожування ОКНЗНП у присутності 5 % дімексиду дозволяє зберегти структурну цілісність адренокортикоцитів (Бондаренко Т.П., Легач Е.И.1999). У своїй роботі ми використовували даний метод заморожування. Ми вважали за доцільне з'ясувати, чи відбуваються зміни функціональних характеристик ендокринного матеріалу при його тривалому зберіганні при -196С. У зв'язку з цим проведені дослідження з визначення після відігрівання секретуючої здатності КОКНЗНП, що зберігалася в різні терміни. Інкубація проводилася протягом 30 хв 37С при відсутності і присутності стимуляторів стероїдогенезу (n=10). Як стимулятори використовували синактен - синтетичний аналог адренокортикотропного гормону (АКТГ) й екстракт гіпофіза (ЕГ), що містить природний гормон.

Отримані результати представлені в табл.1. Видно, що зберігання ендокринного матеріалу протягом 1 року не супроводжується зміною досліджуваних параметрів, що дозволило нам надалі використовувати КОКНЗНП для трансплантації А/Е тваринам. З даних табл.1. випливає, що базальна секреція гормонів у заморожених зразках знаходиться на рівні 85 % від контролю (Р<0.05), а стимульована секреція зберігається на рівні контрольних зразків. Остання обставина є дуже важливою для випадків трансплантації зразків тваринам, оскільки трансплантант повинний підкорятися життєдіяльності організму. Відсутність розходжень у закономірностях відповіді базальної і стимульованої секреції гормонів нативним і кріоконсервованим матеріалом дозволяє припустити, що рецептори, відповідальні за взаємодію з АКТГ, не ушкоджуються. А відсутність видової специфічності АКТГ (Теппермен Дж., Теппермен Х. 1989) означає, що адренокортикоцити повинні реагувати на АКТГ будь-якого виду тварин.

Про стероїдогенез судили за рівнем споживання екзогенного холестерину. Зменшення холестерину і секреція гормонів знаходяться в еквімолярному відношенні 1:1 [Розен В.Б. 1984, Теппермен Дж. 1989]. Тому, за зміною рівня холестерину можна побічно судити про стероїдогенез. Була оцінена сумарна, вільна і зв'язана фракції холестерину.

Зміни спостерігалися тільки в сумарній і вільній фракції, і ці зміни збігалися, що свідчило про те, що вільна фракція холестерину дійсно є“стероїдогенною”. Утилізація холестерину клітинами КОКНЗНП свідчила про те, що ми маємо справу дійсно з матеріалом, що функціонує, причому, хоча

Таблиця 1

Рівень секреції глюкокортикоїдів КОКНЗНП залежно від

строків зберігання (-196С)

Умови експерименту | Вміст глюкокортикоїдів

нмоль/л мг тканини | % від контр. | % від ОКНЗНП без стимулятора

Нативна ОКНЗНП | Контроль (Без стимулятора) | 31.06 ± 1.13 | 100 | 100

+0.2 ЕД/мл синактена | 44.10 ± 1.23 | 142 | 142

+ екстракт гіпофіза | 40.38 ± 1.19 | 130 | 130

КОКНЗНП

1 доба зберігання

(-196С) | Без стимулятора | 26.40 ± 1.23 | 85 | 100

+0.2 ЕД/мл синактена | 37.22 ± 1.29 | 120 | 141

+ екстракт гіпофіза | 33.79 ± 1.18 | 109 | 128

КОКНЗНП

3 міс. Зберігання

(-196С) | Без стимулятора | 26.38 ± 1.25 | 85 | 100

+0.2 ЕД/мл синактена | 36.93 ± 1.19 | 119 | 140

+ екстракт гіпофіза | 33.76 ± 1.21 | 109 | 128

КОКНЗНП

1 рік зберігання

(-196С) | Без стимулятора | 26.36 ± 1.29 | 85 | 100

+0.2 ЕД/мл синактена | 35.70 ± 1.17 | 115 | 138

+ екстракт гіпофіза | 33.40 ± 1.20 | 108 | 126

Примітки. - відмінності є достовірними порівняно з контролем (Р0.05).

швидкість цього процесу КОКНЗНП на початкових етапах була нижчою, ніж у нативних, до 90 хв інкубації достовірних розходжень у цих величинах між нативним і кріоконсервованим матеріалом не спостерігалося. Таким чином, КОКНЗНП зберігала свої функціональні характеристики, пов'язані зі стероїдогенезом. Утилізація екзогенного холестерину КОКНЗНП виявилась передумовою для постановки експериментів щодо рекультивування даних зразків після відігрівання. Експериментальні дані (рис. 1) свідчать, що при рекультивуванні клітини КОКНЗНП зберігають здатність до базальної і стимульованої секреції.

У першу добу рекультивування рівні секреції стимульованої і не стимульованої культури вірогідно не відрізнялися, однак на 2-гу добу стимульована ЕГ КОКНЗНП характеризувалась значним збільшенням секреції (у 1.96 рази вище порівняно з 1-ою добою (Р<0.05).

Можливо, це пов'язано з розвитком репаративних процесів у мембранах адренокор- тикоцитів після дії низьких температур [Бондаренко Т.П. і ін. 1998]. Аналіз рівня 11-ОКС у гомогенатах культур показав, що при рекультивуванні, до 3-ої доби, у стимульованій культурі вірогідно підвищується зміст гормонів, тоді як у нестимульованій культурі рівень 11-ОКС вірогідно не змінюється, що також зв'язано з функціональними характеристиками мембран адренокортикоцитів.

Значне збільшення вмісту білка в середовищі культивування й у гомогенатах КОКНЗНП при рекультивуванні свідчать про посилення біосинтетичних процесів [Албертс Б. та ін. 1994], що узгоджується з даними щодо секреції глюкокортикоїдів КОКНЗНП (Рис.1).

Гістологічний аналіз КОКНЗНП відразу після відігрівання і при рекультивуванні дозволив зробити висновок про те, що в культурі при рекультивуванні розвиваються процеси відновлення. Частина клітинних елементів експлантата, що виявляла ознаки дистрофії відразу після кріоконсервування, виявляє здатність до нормалізації морфологічних ознак. Відзначається збільшення обсягу клітин і розміру ядер. У пучковій зоні чітко розрізняються світлі й темні клітини. Камбіальні клітини між клубочковою і пучковою зонами також відновлюють свій обсяг, а їхні ядра мають помітну хроматинову гранулярність і ядерця.

Гістологічні препарати рекультивованої КОКНЗНП із ЕГ, окрім нормалізації відзначених параметрів, характеризувалися повсюдно індукованим переходом темних клітин пучкової зони у світлі, цитоплазма яких мала велику кількість світлих вакуолів. Відзначалася також активізація клітин підкапсулярних та міжзональних ділянок.

Підсумовуючи ці дані, можна зробити висновок, що низькотемпературне зберігання КОКНЗНП не призводить до істотних змін функціональних характеристик, а зміни в гістологічній картині після низькотемпературного впливу, пов'язані зі зменшенням обсягу клітин, є оборотними. І ці відновлення в більшій мірі виявляються у випадку дії АКТГ, що на рівні організму відповідальний за синтез і секрецію гормонів адренокортикальною тканиною. Це надає право говорити про принципову можливість використання КОКНЗНП для корекції гормонального статусу в організмі з гіпофункцією надниркової залози.

Моделлю для дослідження функціонування кріоконсервованого ксенотрансплантату з різною секреторною активністю були А/Е самці білих щурів. Терміни КсТц були виявлені експериментальним шляхом на основі вивчення розвитку надниркової недостатності у щурів після адреналектомії. До 30-ої доби гинуло 57.5 % прооперованих тварин, причому максимум приходився на 2-ий - 3-ій тиждень після операції. Відомо, що щури [Schwabedal P.E et al.,1983] мають здатність формувати додаткову надниркову тканину в жировій капсулі нирки у випадку гіпофункції залоз. Як видно, тварини, що вижили після адреналектомії, саме і характеризувалися наявністю таких залоз. Гістологічні дослідження тканин цих тварин підтвердили це припущення.

А/Е тваринам на 30-у добу після операції були зроблені КсТц. У 1-ій серії експериментів трансплантували ендокринний матеріал відразу після відігрівання і 1-ї години інкубації з різними концентраціями ЕГ (10 і 50 мкл) або без нього. Трансплантований матеріал тестувався на його здатність секретувати гормони і відповідати на стимулятори стероїдогенезу. Було відзначено, що секреція 11-ОКС КОКНЗНП, обробленої ЕГ 10 мкл, була вірогідно вищою за нестимульовану КОКНЗНП, тоді як різниці в секреції між КОКНЗНП, обробленої ЕГ 50 мкл і нестимульованої КОКНЗНП, не спостерігалося. Це, імовірно, свідчить про високу концентрацію стимулятора в останньому випадку, коли він виступає в ролі інгібітору стимульованої секреції [Комиссаренко В.П. 1974].

Через 30 діб після КсТц тварин забивали. З даних, представлених у табл.2, видно, що А/Е щури характеризувалися зниженням рівня глюкокортикоїдів, 52.02.6 % у порівнянні з Л/О тваринами (Р<0.05).

При аналізі співвідношень мас внутрішніх органів до маси тіла відзначені розходження між Н/ПРО, Л/О и А/Е тваринами тільки у співвідношенні мас селезінки і сім’яників. В А/Е щурів вірогідно збільшене співвідношення селезінки до маси тіла по відношенню з двома іншими групами щурів. Найбільший інтерес представляють дані про те, що в А/Е тварин збільшувалася маса сім’яників, у яких рівень вироблення глюкокортикоїдів зростав у 2.75 рази (Р<0.05), тобто сім’яники, імовірно, приймали на себе частково компенсаторну роль вироблення глюкокортикоїдів [Алешин Б.В. 1987].

Аналіз співвідношень мас внутрішніх органів до маси тіла в експериментальних тварин із КсТц показує (табл. 3), що в А/Е щурів з різними варіантами КсТц маються розходження співвідношень селезінки і сім’яників стосовно Л/О тварин. У Л/О щурів із КсТц крім відмінностей у цих параметрах, вірогідно знижений зміст 11-ОКС у наднирковій залозі, причому в різному ступені.

Після КсТц КОКНЗНП без і з уведенням різних концентрацій ЕГ, до 30-м доби рівень глюкокортикоїдів у плазмі А/Е щурів вірогідно зростав (табл. 3), що є

Таблиця 2

Фізіологічні параметри неоперованих (Н/О), хибнооперованих (Х/О) та адреналектомованих (А/Е) щурів

Група тварин | Маса тварин, г | 11-ОКС в плазмі у % від Х/О | % селезінки | % над-нирк. залоз та 11-ОКС, мкг/мг білка | % печін-ки | % серця | % сім'яників та рівень 11-ОКС (мкг/мг білка) | % нирок

Н/О | 26012 | 98.42.5 | 0.2050.010 | 0.0090.0004

0.8100.019 | 2.8330.141 | 0.3290.016 | 0.6180.031

0.0040.0002 | 0.3470.017

Х/О | 25212 | 1003.2 | 0.2020.010 | 0.0100.0005

0.8010.013 | 2.8500.104 | 0.3270.014 | 0.6090.030

0.0040.0002 | 0.3240.016

А/Е | 23511 | 52.34.6* | 0.2640.012* | - | 2.9700.014 | 0.3240.016 | 0.6380.031*

0.0110.0005* | 0.3190.015

Примітка. * - відмінності достовірні по відношенню до Х/О (Р<0.05)

підтвердженням того, що кріоконсервована ОКНЗНП виконувала функцію вилучених наднирків. Максимальний рівень гормонів у крові А/Е щурів із КсТц спостерігався при трансплантації культури, не обробленої стимулятором стероїдогенезу, коли культура знаходилася в стані спокою (87.23.8 % від Л/О щурів). Очевидно, потрапивши в організм реципієнта, вона відразу починала функціонувати. У випадку трансплантації активованої культури, обробленої 10 мкл ЕГ, культура, що активно працювала, швидко виснажувалася, не встигаючи відновлюватися. У цьому випадку в крові тварин був зареєстрований мінімальний рівень глюкокортикоїдів (69.53.5 % від Л/О, Р<0.05). При використанні як трансплантат матеріалу, обробленого 50 мкл ЕГ, у крові тварин відзначалося проміжне значення рівня гормонів (80.33.2 % від Л/О, Р<0.05).

Адреналектомовані тварини характеризуються підвищеним вмістом у крові АКТГ [ Sarria R. Et et al. 1995 ]. Клітини, оброблені до трансплантації АКТГ, в організмі реципієнта піддаються ще одній атаці стимулятора.

Сучасні досягнення в галузі механізмів секреції глюкокортикоїдів говорять про те, що базальна й АКТГ-залежна секреції здійснюються по різних механізмах. Вважають, що маються 2 різних транспортних канали [ Mgboniebi O.P. et al. 1994, 1998 ].

Таблиця 3

Фізіологічні параметри хибнооперованих (Х/О) та

адреналектомованих (А/Е) щурів з ксенотрансплантацією (КсТц)

Група тварин | Маса тварин,

в г | 11-ОКС в

плазмі (% від Х/О) | % селезі-нки | % печін-ки | % серця | 11-ОКС в наднирк залозах (мкг/мг білка) | % сім'я-ників | % нирок

Х/О з КсТц | 255 12 | 1617.5*

** | 0.2360.011 * ** | 2.8850.144 | 0.3200.160 | 0.2451 0.0157 * | 0.4320.021 * | 0.3520.017

Х/О з КсТц з

10 мкл ЕГ | 258 13 | 1055.3*

** | 0.3800.019 ** | 3,0600.151 | 0,3040.014 | 0.3726 0.0169 * | 0.5700.280 * | 0.3420.017

Х/О з КсТц з

50мкл ЕГ | 25012 | 97.34.8

** | 0.2360.113 * ** | 2.8850.143 | 0.3200.016 | 0.4751 0.0137 * | 0.4320.021 * | 0.3520.017

А/Е з КсТц | 254 12 | 85.23.8 *

** | 0.2040.010 ** | 3.2200.160 | 0.3130.015 | - | 0.5000.025 * | 0.3130.014

А/Е з КсТц з

10 мкл ЕГ | 24012 | 69.53.5 *

** | 0.2400.012 * | 3.2300.161 | 0.3060.015 | - | 0.5480.027 | 0.3380.016

А/Е з КсТц з

50 мкл ЕГ | 24411 | 83.34.2 *

** | 0.2530.012* | 2.9280.146 | 0.3550.172 | - | 0.5920.028 | 0.3310.015

Примітка. * - відмінності достовірні по відношенню до Х/О тварин (P<0.05)

** - відмінності достовірні по відношенню до А/Е тварин (P<0.05)

Дуже імовірно, що ксенотрансплантат, підданий дії АКТГ перед трансплантацією, потрапивши в організм із підвищеним рівнем АКТГ, виявляється в ситуації, коли всі клітинні рецептори, відповідальні за АКТГ-стимульовану секрецію, зайнятий і трансплантат може здійснювати тільки базальну секрецію. Трансплантат, не підданий обробці АКТГ, в організмі реципієнта здатний здійснювати базальну і стимульовану АКТГ секрецію. Однак, коли в руслі крові підвищується рівень гормонів за рахунок базальної секреції і компенсаторної функції сім’яників, що супроводжується падінням рівня в крові АКТГ, у трансплантаті відновляється і стимульований шлях секреції гормонів.

У Х/О щурів після КсТц відзначалося зростання рівня гормонів у крові тварин у 1.6 рази, що також свідчить про функціонування ксено- трансплантату. Зміст гормонів у гомогенатах надниркових залоз цих тварин після забою свідчив про розвиток у них гіпофункції, що також підтверджувалося й гістологічними дослідженнями. Так, рівень 11-ОКС у гомогенатах надниркових залоз складав 0.245-0.475 мкг/мг тканини, що у всіх випадках є вірогідно нижчим від Л/О щурів, у яких цей показник складав 0.8100.019 мкг/мг тканини.

Гістологічний аналіз трансплантатів в А/Е тварин на 30-у добу виявив наявність у ньому функціонуючих ендокринних клітин. Однак трансплантат піддається лізису переважно клітинно-ферментативним шляхом і в меншому ступені - за рахунок організації. Відзначалася поява великої кількості макрофагів, нейтрофілів, базофілів. Біохімічний аналіз шматочків тканини трансплантату виявив у ньому наявність 11-ОКС (0.0370.002 мкг/мг тканини).

У наступній серії експериментів проводили КсТц рекультивованої КОКНЗНП, що була піддана обробці не тільки стимулятором (АКТГ), але й інгібітором стимульованої секреції (хлоридом кадмію). На рис.2 представлений аналіз рівня 11-ОКС у плазмі експериментальних тварин. Видно, що до 45-ої доби в А/Е щурів ксенотрансплантат забезпечує у всіх групах тварин стійке підвищення рівня гормонів у порівнянні з А/Е щурами. Рівень гормонів у крові А/Е тварин складав 51.473.2% у порівнянні з Х/О. При КсТц рекультивованої КОКНЗНП без обробки модифікаторами до 45-ої доби після трансплантації рівень 11-ОКС у крові тварин був 69.44.8%. Трансплантація ендокринного матеріалу, обробленого 10 мкл ЕГ, супроводжувалося досягненням 80.54.8% рівня 11-ОКС контрольних тварин. При трансплантації культури, обробленої 10–2 M розчином CdCl2, спостерігався максимальний вміст 11-ОКС у крові експериментальних тварин, що складав 87.53.25% рівня 11-ОКС у крові Х/О тварин.

Гістологічне дослідження трансплантатів (45 діб) показало, що залишки культури представлені скупченням великих полігональних дитинкторіальних клітин з ознаками активного функціонування. Клітини культури, що збереглася, мають іноді контакти з макрофагами, де культура піддається колікваційному некрозу. Гістологічний аналіз трансплантату, підданого перед підсадженням обробці ЕГ, виявив життєздатні елементи культури, які задовільно працюють по морфологічних характеристиках клітини. Навколо трансплантату накопичувались лімфоцити, була відсутня макрофагальна інфільтрація. Грануляційна сполучна тканина не вростала ні в живу, ні в загиблу частину трансплантату.

На місці трансплантату, обробленого кадмієм, розвивався гнійно-альтернативний пододерматит.

Трансплантат частково лізирувався, частково відривався. І хоча в даному варіанті трансплантації в крові А/Е щурів спостерігався найвищий рівень 11-ОКС, він, як видно, до 45-ої доби був обумовлен не інтенсивною роботою самого трансплантату, а, швидше за все, був обумовлений формуванням додаткової над- ниркової тканини і синтезом глюкокортикоїдів у сім’яниках.

При зіставленні даних із КсТц усіх варіантів експериментів звертає на себе увагу той факт, що життєздатність ксенотрансплантату залежить від його функціональних можливостей на момент трансплантації, чим і визначається різний рівень компенсації гормональної недостатності.

У зв'язку з цим ми проаналізували можливість регуляції функціональної здатності культур стимуляторами стероїдогенезу на етапах її культивування. 2-га – 5-та доби культивування ОКНЗНП є "стадією активного росту" з максимумом секреції гормонів клітинами культури на 5-у добу [ Легач Е.И. і ін. 1999, Тронько Н.Д. і ін. 1985]. Саме в ці тимчасові відрізки культивування ми вводили ЕГ у середовище культивування. Аналіз вмісту 11-ОКС і білка в середовищі культивування показав, що культура неоднаково реагує на стимулятор у процесі росту, що відбивається як на базальній, так і на стимульованій секреції, а також на нагромадженні її білкової маси. У результаті введення ЕГ у різні дні культивування до 5-ої доби дозрівають культури з різними функціональними можливостями, що по-різному переносять процес кріоконсервування. Так, вміст 11-ОКС у середовищі інкубації культури після відігрівання свідчить про те, що максимальну базальну і стимульовану секреції має культура, вирощена без додаткової стимуляції. Найменшу секретуючу здатність після розморожування мали культури, у середовище культивування яких стимулятор додавався на 2-у і 5-у добу культивування.

Основним висновком результатів цих експериментів є те, що результат процесів низькотемпературного впливу на ендокринний матеріал і, насамперед, його функціональні характеристики (базальна і стимульована секреція) значною мірою визначається вихідними функціональними характеристиками нативної ОКНЗНП, і цими ж параметрами обумовлена компенсаторна функція кріоконсервованого ксенотрансплантату в організмі реципієнта.

ВИСНОВКИ

1. Широке впровадження методу ксенотрансплантації органних культур надниркової залози новонародженого поросяти є можливим на основі створення запасів кріоконсервованого матеріалу. Низькотемпературне зберігання протягом 1-го року органної культури надниркової залози, замороженої за двоетапною програмою незалежно від термінів зберігання в цей період забезпечує, за даними гістологічних досліджень, збереження морфологічної структури і функціональних характеристик - стероїдогенезу екзогенного холестерину, базальної і стимульованої секреції глюкокортикоїдів, а також здатність до рекультивування після відігрівання.

2. Екстрактивність з біологічного матеріалу глюкокортикоїдів і відтворюваність флуориметричного методу їхнього визначення залежать від температури, концентрації гормонів і часу контакту останніх з реагентами. Підвищення температури до 37С, концентрація гормонів шляхом вакуумного випарювання і використання термостатування забезпечує розвиток максимальної флуоресценції за 6 хв у порівнянні з 1,5 годинами за стандартною методикою, що дозволяє скоротити втрату гормонів на 20% і поліпшити відтворюваність існуючого методу.

3. Уведення стимулятора стероїдогенезу АКТГ у різний термін культивування знижує кріостійкість ендокринного матеріалу, що відбивається у зниженні базальної та стимульованої секреції глюкокортикоїдів. Найбільш стійкою до низькотемпературного збереження є культура, вирощена за відсутності АКТГ. Додавання стимулятора стероїдогенезу на 4-у добу культивування сприяє досягненню максимуму секретуючої активності, характерної для 5-ої доби культивування за відсутності стимулятора.

4. Ксенотрансплантація кріоконсервованої органної культури новонароджених поросят адреналектомованим тваринам незалежно від умов підготовки розмороженого матеріалу до трансплантації сприяє нормалізації гормонального статусу експериментальних тварин. Рівень 11-ОКС у крові досягає 77-85 % рівня контрольних тварин у порівнянні з 25 % в адреналектомованих тварин до ксенотрансплантації. В усіх випадках до 30-ої – 45-ої доби після підсадження в гістологічних препаратах трансплантатів реєструвалася наявність життєздатних секреторних клітин культури.

5. Компенсаторна функція кріоконсервованої органної культури надниркової залози в організмі адреналектомованих тварин визначається умовами підготовки матеріалу для трансплантації. До 30-ої доби після трансплантації більшу компенсаторну функцію мають культури, трансплантовані після відігрівання. Однак, до 45-ої доби максимальний рівень 11-ОКС у крові адреналектомованих тварин відзначений у випадку підсадження матеріалу, у якому був інгібований хлоридом кадмію стимульований шлях секреції. Проміжний ефект був отриманий при трансплантації рекультивованої кріоконсервованої органної культури, обробленої стимулятором стероїдогенезу перед трансплантацією.

6. Трансплантати, виділені з організму адреналектомованих щурів до 45-ої доби, зберігають секретуючі клітини, у яких рівень 11-ОКС складає 0.0370.002 мкг/мг тканини. Функціональна активність трансплантата визначає компенсаторну функцію сім’яників по виробленню глюкокортикоїдів: чим вище функціональна активність трансплантату, тим є нижчою компенсаторна функція сім’яників.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

АНОТАЦІЇ

Геращенко Г.В. Функціональні характеристики органної культури надниркових залоз при кріоконсервуванні та ксенотрансплантації. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія, Інститут проблем кріобіології і кріомедицины НАН України, Харків, 2002.

У роботі досліджувались функціональні характеристики органної культури надниркової залози новонароджених поросят при її кріконсервуванні, тривалому зберіганні (-196С) і ксенотрансплантації адреналектомованим щурам в залежності від її вихідних параметрів – введення стимуляторів або інгібіторів секреції на етапах культивування, після відігріву і перед трансплантацією. Кріоконсервований матеріал зберігає незалежно від строків його зберігання (1-360 днів) здатність до стероїдогенезу, базальної та стимульованої секреції і рекультивування.

Кріоконсервований ксенотрансплантат виявляє компенсаторний ефект на гормональний статус тварин (підвищення рівня гормонів у крові), величина якого залежить від його вихідних параметрів. Гістологічні та біохімічні дослідження свідчать про роботу ксенотрансплантату на 30-у - 45-у добу після трансплантації.

Ключові слова: кріоконсервування, органні культури надниркових залоз, ксенотрансплантація, стероїдогенез, секреція глюкокортикоїдів.

Геращенко А.В. Функциональные характеристики органной культуры надпочечников при криоконсервировании и ксенотрансплантации. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология, Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2002.

В работе исследована взаимосвязь между исходными морфо-функциональными характеристиками органной культуры надпочечников новорожденных поросят и ее чувствительностью к криоконсервированию, длительному хранению (-196С) и функционированием после ксенотрансплантации в организме адреналэктомированных животных. Проведенные исследования позволяют сделать заключение о том, что независимо от сроков хранения при -196С (1-360 дней) криоконсервированная органная культура надпочечников новорожденных поросят после отогрева сохраняет секрецию гормонов на уровне 85% от нативного материала. Как и нативный материал, криоконсервированные органные культуры сохраняют ту же зависимость в ответе на природный и синтетический аналог АКТГ. Клетки культуры после криоконсервирования способны к реагированию на стимуляторы и ингибиторы стероидогенеза и