Національна академія наук України

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна

ГОРІДЬКО Тетяна Миколаївна

УДК 577.115 +577.115.3:612.17+612.35

ДІЯ НАСИЧЕНИХ N-АЦИЛЕТАНОЛАМІНІВ НА ЛІПІДИ ТКАНИН ПЕЧІНКИ ТА СЕРЦЯ ЩУРІВ ЗА УМОВ ІШЕМІЧНОГО УШКОДЖЕННЯ

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України

Науковий керівник – доктор біологічних наук, член-кор. НАН та АМН України ГУЛА Надія Максимівна, зав. відділу Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, проф. МАТИШЕВСЬКА Ольга Павлівна, проф. кафедри біохімії Київського національного університету

імені Тараса Шевченка;

доктор медичних наук, проф. МХІТАРЯН Лаура Сократівна, керівник відділу біохімії Інституту кардіології ім. М. Д. Стражеска АМН України

Провідна установа – Національний медичний університет ім. О. О. Богомольця МОЗ України, кафедра біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії, м. Київ

Захист відбудеться “ 1 ” липня 2002 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України за адресою 01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

Автореферат розіслано: “ 1 ” червня 2002 року

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

загальна характеристика роботи

Актуальність теми. N-ацилетаноламіни (NAE) належать до нового класу біорегуляторів з широким спектром біологічної та фармакологічної дії. З 50-х років відомо про їх антизапальну, антитоксичну та деякі інші фармакологічні властивості [Kuehl F.A. et al., 1957; Ganley O.H. et al, 1958; Ganley O.H., 1959]. Показано, що NAE здатні підвищувати щільність мембран [Ambrosini A. et al., 1993], інгібувати збільшення неспецифічної проникності внутрішніх мембран мітохондрій для іонів Са2+, що викликане Са2+- рилізінг агентами, гальмувати розвиток мембранного потенціалу [Epps D.E. et al., 1982]. Відомо про вплив деяких NAE на пероксидне окиснення ліпідів [Parinandi N.L. et al., 1988]. N_ацилетаноламіни є мінорними ліпідними компонентами мембран клітин, які в значних кількостях накопичуються в умовах ішемії та за інших патологічних станів [Epps D.E. et al., 1979; Epps D.E. et al., 1980; Schmid P.C. et al, 1995; Hansen H.S. et al., 1999; Berdyshev E.V. et al., 2000]. Таке зростання кількості є фізіологічно важливим і, можливо, складає основу механізму захисту клітин від пошкоджень. Останнім часом зявилася велика кількість робіт стосовно біологічної ролі поліненасичених NAE [Devane W.A., 1992; Makie K. et al., 1992; Fride E. et al., 1993; Cravatt B.F. et al., 1995; Безуглов В.В. и др., 1998; Watanabe K. et al.,1999; Di Marso V. et al., 2000; Sugiura T. et al., 2000; Berdyshev E.V. et al., 2001]. В той же час, саме насичені NАЕ (такі, як N-пальмітоїл- (NPE) та N-стеароїлетаноламін (NSE)) знайдені в значних кількостях в інфарктному серці, що, можливо, призводить до безпосереднього впливу цих сполук на фізико-хімічні властивості плазматичних мембран, спрямованого на збереження цілісності їх структури та функціональної активності.

Відомо, що ішемія лежить в основі розвитку цілого ряду патологічних станів і обумовлена недостатнім постачанням органу кровю. Ушкодження мембран є одним з важливих факторів поглиблення ішемічного ураження, а роль процесів пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) у патогенезі ішемічного та реперфузійного ушкоджень органів сьогодні не викликає сумнівів. Це переконливо доведено даними про накопичення продуктів ПОЛ за ішемії та реперфузії ішемізованих органів, а також роботами про позитивний ефект антиоксидантів. Тому пошук та застосування препаратів, які запобігають необоротним структурним перебудовам мембран і можуть істотно підвищити резистентність органів та тканин до ішемії та реперфузії є актуальним. З огляду на відомі властивості NAE, а також те, що саме насичені N-ацилетаноламіни у великих кількостях накопичуються у разі ішемічного ушкодження, було доцільним дослідити дію екзогенних NАЕ на зміни складу та кількості ліпідів печінки та серця щурів за умов експериментального ішемічного пошкодження.

Зв'язок роботи з науковими планами, програмами, темами. Робота проводилась в рамках наукової тематики відділу біохімії ліпідів Інституту біохімії ім.О.В. Палладіна НАН України (тема 2.10.6 за проблемою 2.28.4 “Біохімія тварин і людини”, держ. рег. № 0194U013504 “Вивчення функціональної ролі та механізму дії природних біологічно активних ліпідів N_ацилетаноламінів”, затвердженою Президією НАН України). Робота була підтримана грантами ДКНТ України 01.03.00/001-95 та ISSF № K15100.

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було вивчення особливостей біологічної дії насичених N_ацилетаноламінів на зміни ліпідного складу печінки та серця щурів в умовах ішемічного, гіпоксичного та реперфузійного пошкоджень органів. Відповідно до поставленої мети були визначені наступні задачі: 1) Дослідити вплив N-пальмітоїлетаноламіну на кількісний склад фосфоліпідів та жирних кислот серця щурів при експериментальній коронарній недостатності та порушенні ритму серцевої діяльності, викликаної введенням вазопресину; 2) Вивчити дію екзогенних NPE та NSE на процеси пероксидного окиснення ліпідів за умов гострої гіпоксії; 3) Вивчити вплив NPE на процеси пероксидного окиснення ліпідів, склад фосфоліпідів та жирних кислот печінки щурів в умовах ішемічного та реперфузійного ушкоджень донорського органу; 4) Зясувати особливості механізму дії N-пальмітоїлетаноламіну за умов ішемічного, гіпоксичного та реперфузійного пошкоджень органів.

Обєкт дослідження – насичені N-ацилетаноламіни, дію яких досліджували на щурах з експериментальною коронарною недостатністю та на ізольованих органих в умовах ішемічного та реперфузійного ушкоджень донорського органу.

Предмет дослідження – специфічна дія насичених N-ацилетаноламінів на ліпідний склад печінки та серця щурів в умовах ішемічного ушкодження.

Методи дослідження – мікротонкошарової та газорідинної хроматографії; хемілюмінесценцентний; спектрофотометричний; фізіологічні; статистичної обробки даних.

Наукова новизна отриманих результатів. Показано мембранопротекторні властивості N-пальмітоїлетаноламіну, в основі яких лежить його здатність модифікувати ліпідний склад гіпоксичних тканин;

Вперше вивчено особливості дії N-пальмітоїлетаноламіну на ліпідний склад серця щурів в умовах експериментальної, спричиненої вазопресином, коронарної недостатності та розвиток аритмій і показано кардіопротекторний та антиаритмічний ефекти NPE;

Встановлено, що N-пальмітоїлетаноламін в умовах вазопресинової ішемії міокарду запобігає падінню рівня фосфатидилхоліну та надмірному утворенню лізофосфатидилхоліну в тканинах міокарду, тим самим зменшуючи розвиток деструктивних процесів і сприяючи покращенню функціональних показників роботи серця;

Виявлено антиоксидантну дію N-пальмітоїл- та N-стеароїлетаноламіну в процесі Fe 2+- ініційованого вільнорадикального окиснення ліпідів у мітохондріях печінки щурів за умов гострої гіпоксії, а також за ішемії та реперфузії донорського органу;

Виявлено можливість застосування NPE в розчинах – консервантах для зменшення деструктивних змін та підвищення життєздатності ізольованих органів.

Практичне значення отриманих результатів. Результати досліджень, що наведені в дисертаційній роботі, мають наукове значення і певну практичну цінність. Отримані дані про мембранопротекторну та антиаритмічну дію N_пальмітоїлетаноламіну в умовах ішемії та гіпоксії можуть бути використані при розробці схем антиішемічного захисту міокарду та інших органів, а також стати біохімічною основою для розробки нових підходів та засобів захисту клітин донорського органу з метою його подальшого трансплантування.

Особистий внесок здобувача. Головна ідея роботи та напрямок досліджень були запропоновані науковим керівником. Наведені в рукописі результати експериметальної частини роботи, відбір та обробка літературних даних виконано автором особисто. Аналіз та обговорення результатів проведено спільно з науковим керівником. Застосування вазопресинової моделі ішемії міокарду та ізольованої перфузії печінки щурів проводили за безпосередньої участі співробітників Інституту геронтології АМН України та Інституту хірургії та трансплантології АМН України, з якими здобувач має спільні публікації.

Апробація результатів роботи. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на I-у зїзді трансплантологів України (Запоріжжя, 1995р.), I-у зїзді Європейської Асоціації по клінічній фармакології та терапії (Париж, 1995р.), 12-у щорічному засіданні та I-й коференції Хірургічної Академії (Мюнстер, 1996р.), VII-у Українському біохімічному зїзді (Київ, 1997р.), Міжгалузевій конференції молодих вчених -2000 (Київ, 2000р.). Результати дисертаційної роботи обговорювались на наукових семінарах відділу біохімії ліпідів Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України.

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи надруковано 5 статей та 5 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 131 сторінці друкованого тексту. Робота складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини, результатів та обговорення, висновків, списку використаних джерел, що містить 204 посилання на роботи вітчизняних та зарубіжних авторів. Робота ілюстрована 19 рисунками та 24 таблицями.

огляд літератури

В огляді літератури представлені наукові дослідження відносно вивчення метаболізму та біологічних властивостей N_ацилетаноламінів - нового класу біорегуляторів з широким спектром біологічної та фармакологічної дії. Показано значне збільшення кількості NAE в умовах ішемії та за інших патологічних станів. Виникло припущення, що утворення цих сполук є фізіологічно важливим і, можливо, складає основу механізму захисту клітин від пошкоджень. Показана пошкоджуюча дія ішемії на тканини. Наведені дані про роль процесів пероксидного окиснення ліпідів у патогенезі ішемічного та реперфузійного ушкоджень.

Матеріали та методи досліджень

Дослідження проводили на щурах-самцях вагою 250-300 г. У роботі були використані: вазопресинова модель ішемії міокарду [Фролькіс,1983], модель гіпоксичної гіпоксії за модифікованим методом [Бахметєва-Джайя-Анжуса,1951], модель ізольованої перфузії печінки щура [Kamada,1988]. Для реперфузії печінки була використана модифікована стандартна модель ізольованої перфузії згідно методу [Reckendorfer і Burgmann,1992] у модифікації [Шагідуліна,2000].

Для вивчення впливу N-пальмітоїлетаноламіну на розвиток експериментальної ішемії серця щурів, що викликана вазопресином тварин піддавали наркозу введенням нембуталу із розрахунку 4 мг на 100г маси тіла. Потім оголювали v. jugularis і через спеціальну канюлю вводили досліджувані препарати. Протягом усього експерименту реєстрували електрокардіограму на шестиканальному електрокардіографі Елкар (Росія) у другому відведенні. Аналіз ЕКГ проводили згідно загальноприйнятим методам. Через 10 хв після введення вазопресину тварин препарували, швидко забирали шлуночки серця, які негайно вміщували у скраплений азот для збереження та подальших досліджень. Щурі були поділені на групи: 1 - інтактний контроль; 2 - контрольні тварини, яким вводили 0,5 мл 9,6% етилового спирту на фізіологічному розчині; 3 - тварини, яким вводили 0,5 мл 9,6% етилового спирту на фізіологічному розчині, а через 10 хв - 1 мкг вазопресину (Sigma, CША); 4 - тварини, яким вводили NPE (1 мкМ) в 0,5 мл 9,6 % етилового спирту на фізіологічному розчині; 5 - тварини, яким вводили NPE (1 мкМ) в 0,5 мл 9,6 % етилового спирту на фізіологічному розчині, а через 10 хв - вазопресин.

Дослідження впливу N-пальмітоїлетаноламіну на процеси пероксидного окиснення ліпідів у мітохондріях печінки щурів в умовах гіпоксичної гіпоксії проводили на щурах, яких тримали у герметично закритій камері загальним обємом 3 л при кімнатній температурі протягом 25 хвилин. Для виключення фактору гіперкапнії в експериментальній камері була поставлена ємкість з КОН. Потім щурів забирали, декапітували, видаляли печінку для отримання мітохондрій та дослідження дії різних NAE в експериментах in vitro. Щурі були поділені на 4 групи: 1- інтактний контроль, 2 - гіпоксичний контроль, 3 - гіпоксія + інкубація з NPE, 4 - гіпоксія + інкубація з NSE. Кінетику Fe2+ ініційованого вільнорадикального окиснення ліпідів у мітохондріях печінки щурів за умов гострої гіпоксії оцінювали за зміною параметрів хемілюмінесценції, а також за концентрацією сполук, що реагують з тіобарбітуровою кислотою.

Вивчення впливу N-пальмітоїлетаноламіну на процеси пероксидного окиснення ліпідів, склад фосфоліпідів та жирних кислот печінки щурів за ішемії та реперфузії проводили у два етапи. Для наркозу використовували тіопентал натрію (30-50 мг/кг ваги). Перфузію печінки проводили in situ згідно методу [Kamada, 1988] охолодженим розчином - консервантом “Євроколлінз” (в ммоль/л: бікарбонат-10; хлорид-15; фосфат-57,5; натрій- 10; калій-115. 500 мл дистильованої води; перед використанням додається 50 мл 40% глюкози в якості енергетичного субстрату) (Euroсollins, ЕС), розчином ЕС з доданим NPE (EC+NPE). Для першого етапу - дослідження впливу NPE за ішемії та перфузії донорського органу: через 5 хв перфузію припиняли, а печінку забирали та вміщували у спеціальний контейнер, де зберігали протягом 22 годин при 40 С у розчинах ЕС або ЕС+NPE. Через 2, 4, 6 та 22 год забирали проби тканини та занурювали їх у скраплений азот для збереження та проведення подальших досліджень. Одержані зразки печінки були розподілені таким чином: I - інтактна (контроль); II та III - печінку тварин протягом 5 хв перфузували охолодженими розчинами ЕС або ЕС + NPE (кінцева концентрація 10-5 М); IV та V - печінка щурів, яку протягом 6 годин зберігали у розчинах ЕС або ЕС+NPE; VI та VII - печінку тварин 22 години зберігали відповідно у розчинах ЕС або ЕС+NPE. Для другого етапу - дослідження впливу NPE за реперфузії ішемізованого органу: після 5-ти хвилинної перфузії охолодженими розчинами ЕС печінку забирали, вміщували у спеціальний контейнер, де зберігали при 40 С протягом 6 годин у консерваційному середовищі ЕС. Потім печінку реперфузували протягом 2-х годин оксигенованим розчином Кребса-Хензеляйта (Krebs-Henseleit bicarbonate buffer, KHB) (мМ: NaCl -120; KCl -4,7; NaHCO3 - 25; KH2PO4 - 1,25; CaCl2 - 1,25; MgSO4 - 1,4; глюкоза - 6) при 370С. Для реперфузії печінки була використана модифікована стандартна модель ізольованої перфузії згідно методу [Reckendorfer і Burgmann,1992] у модифікації [Шагідуліна,2000]. По закінченні реперфузії печінку негайно занурювали у скраплений азот. Одержані зразки печінки були розподілені таким чином: I - інтактна (контроль); II та III - печінку тварин 6 годин зберігали відповідно у розчинах ЕС або EC + NРE (кінцева концентрація 10-5 М) при 40С , яку потім реперфузували розчином KHB.

Екстракцію ліпідів проводили за методом [Bligh і Dyer, 1959]. Для зменшення адсорбції аніонних фосфоліпідів на білки та для більш повного виділення цих сполук використовували водну фазу з іонами кальцію згідно рекомендації [Palmer, 1971]. Розділення фосфоліпідів проводили двовимірною мікротонкошаровою хроматографією за методом [Svetashev i Vaskovsky, 1972]. Для цього брали скляні пластини розміром 66 см та наносили на них 1 мл колоїдного розчину сілікагелю КСК-2 (Росія). Для ідентифікування розділених на хроматографічних пластинах фосфоліпідних класів використовували - стандарти фосфоліпідів з відомим значенням Rf та якісні реакції на функціональні групи фосфоліпідів [Кейтс, 1975; Васьковский, 1975]. Вміст фосфоліпідів виражали за кількістю в них неорганічного фосфору, який визначали за допомогою молібдатного реагенту [Васьковский, 1975]. Для розділення діацильних та плазмалогенних форм фосфоліпідів проводили хроматографічні процедури [Васьковский, 1975]. Кількісне визначення фосфору діацильних та плазмалогенних форм фосфоліпідів проводили використовуючи реакцію з молібдатним реактивом [Васьковский, 1975].

Метилові ефіри жирних кислот з ліпідного екстракту одержували за модифікованим методом [Carreau і Dubaco,1978]. Кількісний аналіз метилових ефірів жирних кислот проводили за допомогою газорідинної хроматографії на хроматографі Carlo Erba (Італія) з полумяно-іонізаційним детектором на скляній колонці (2,5 м 3 мм), яку було заповнено 10% фазою SР 2300 (Silar 5CР) на Chromosorb W/HP при програмованій температурі 140-250 0С (2 0 С/хв). Для калібрування колонки та ідентифікації жирних кислот застосовували стандарти метилових ефірів жирних кислот (Serva, ФРН). Вимірюючи площу піків, розраховували відсотковий вміст жирних кислот в екстракті.

Вміст холестеролу визначали на хроматографі Chrom-5 (Чехія) з дуальною системою на колонці із неіржавіючої сталі 0,5 м, яку було заповнено Chimalite W (80-100 mesh) з нанесеною 1,5% рідкою фазою OV-1 (“Shimadzu”, Japan), при температурі інжектора і детектора 250 0С і 270 0С відповідно та запрограмованій температурі 180-250 0С (100 С/хв). Внутрішнім стандартом для кількісного визначення холестеролу слугував -ситостерин.

Мітохондрії печінки щурів отримували згідно рекомендаціям [Мэдди, 1979].

Вивчення вільнорадикального окиснення ліпідів у мітохондріальній фракції печінки щурів проводили хемілюмінесцентним методом у присутності 50 мкМ Fe2+ при 37 0С [Parinandi, 1988; Владимиров, 1972]. Вимірювання проводили на хемілюмінометрі ПХЛ-01 (Росія) з фотоелектронним помножувачем ФЕП-83, який був додатково оснащений ЕОМ АХЛГ-01. Прилад був прокалібрований в абсолютних одиницях - квант/с4 згідно рекомендаціям, що наведені у роботі [Владимиров, 1989]. Хемілюмінісценцію записували безперервно у режимі “слідкування”. Відношення сигналу до шуму було 30:1 та більше.

Визначення інтенсивності процесів пероксидного окиснення ліпідів проводили за накопиченням ТБК- активних продуктів (малонового діальдегіду – МДА) за методом [Владимирова та Арчакова,1972].

Білок визначали за методом [Lowry, 1951]. Статистичний аналіз проводили, користуючись t - критерієм Стьюдента; вірогідними вважали дані у разі p<0,05.

Результати та обговорення

Вивчення впливу N-пальмітоїлетаноламіну на розвиток експериментальної ішемії серця щурів, що викликана вазопресином.

У звязку з тим, що насичені N-ацилетаноламіни у великих кількостях накопичуються при ішемії, були проведені дослідження дії екзогенного N-пальмітоїлетаноламіну на склад та кількість ліпідів серця та печінки щурів за умов ішемічного ушкодження.

Отримані дані свідчать, що в умовах експериментально викликаної вазопресином ішемії міокарду відбуваються зміни кількості фосфоліпідних класів тканин серця щурів. Виражені ознаки цих змін стосуються кількісного вмісту фосфатидилхоліну та лізофосфатидилхоліну, який збільшується майже в 2,5 рази (LPC) (рис.1). Відомо, що значне накопичення лізофосфоліпідів є однією з характерних ознак ішемічного пошкодження. Крім того, на думку багатьох дослідників, значне утворення LPC є головною причиною розвитку аритмій. Нами встановлено, що введення щурам 1мкг вазопресину викликає значні зміни ритмічної діяльності серця. Розвиваються брадикардія, атріовентрикулярний блок та зявляються чисельні екстрасистоли. Попереднє введення 1мкМ N-пальмітоїлетаноламіну зменшує вираженість змін кількості ліпідів серця щурів, спричинених вазопресином (Рис.1). Так, NPE запобігає падінню рівня РС, гальмує накопичення його похідного - LPC, сприяючи нормалізації величини їх співвідношення. Беручи до уваги те, що надмірне накопичення лізофосфоліпідів є однією з характерних ознак ішемічного пошкодження, можна припустити, що NPE гальмує розвиток деструктивних процесів в тканині ураженого органу. Це добре узгоджується з результатами інших дослідників про можливу захисну роль NAE при ішемічному ураженні міокарду. Крім того, нами показано, що інєкція 1мкМ N_пальмітоїлетаноламіну перед введенням вазопресину, гальмує розвиток брадикардії, запобігає змінам амплітуди зубця Т та появі екстрасистол. Отже, NPE, зменшуючи утворення лізофосфатидилхоліну, сприяє покращенню функціональних показників роботи серця.

Таким чином, в дослідах in vivo, ми отримали докази протекторної дії N_пальмітоїлетаноламіну, який в умовах вазопресинової ішемії міокарду запобігає падінню рівня фосфатидилхоліну та надмірному утворенню лізофосфатидилхоліну в тканині міокарду, тим самим зменшуючи розвиток деструктивних процесів і сприяючи покращенню функціональних показників роботи серця.

Для зясування дії N-пальмітоїлетаноламіну на тканини інших органів при ішемічних ушкодженнях в дослідах in vitro були проведені дослідження його впливу на склад фосфоліпідів та жирних кислот, а також на процеси пероксидного окиснення ліпідів печінки щурів за ішемії та реперфузії донорського органу.

Вивчення впливу N-пальмітоїлетаноламіну на склад фосфоліпідів та жирних кислот, а також на процеси пероксидного окиснення ліпідів, печінки щурів за ішемії та реперфузії.

Для вивчення дії NPE на ішемізовані тканини in vitro була використана інша модель ішемічного ураження органів - ішемія та реперфузія донорського органу. Нами було знайдено, що при різних термінах ішемії печінки щурів рівень лізофосфатидилхоліну весь час зростає і досягає максимального значення при реперфузії (Рис.2).

NPE попереджає збільшення кількості LPC при перфузії та дещо призупиняє накопичення лізофосфоліпідів при ішемії та реперфузії. Вважаючи, що значне акумулювання LPC відображає механізм ішемічного ушкодження, можна припустити, що N_пальмітоїлетаноламін, проявляючи властивості антиоксиданта, здатний зменшувати деструктивні процеси в пошкоджених тканинах шляхом зниження рівня лізофосфатидилхоліну. Додавання NPE до розчину ЕС сприяє зростанню вмісту фосфатидилінозитолу, що також є проявом його захисного впливу на уражені тканини.

Крім того, нами знайдено, що додавання до стандартного розчину-консерванту NРЕ у концентрації 10-5 М запобігає, протягом усього експерименту, зростанню вмісту ейкозатриєнової, арахідонової кислот, сприяє зростанню докозагексаєнової кислоти, стабілізує вміст лінолевої кислоти (Рис.3).

Виявлені кількісні зміни індивідуальних жирних кислот обумовлюють нормалізацію до початкових значень основних показників жирнокислотного складу аноксичної печінки щурів і можуть також бути проявом захисного впливу NPE в умовах ішемії та реперфузії донорського органу (Рис.4).

Введення до розчину-консерванту N-пальмітоїлетаноламіну також попереджає протягом усього експерименту зміни рівня загального холестеролу та величини відношення холестерол / фосфоліпіди (Рис.5).

Ці результати узгоджуються з отриманими нами даними про розподіл ненасичених та насичених жирних кислот і свідчать про помірні під впливом NPE зміни рідинності мембран гепатоцитів за умов ішемії та реперфузії донорського органу.

Роботами багатьох дослідників показано звязок між формуванням продуктів пероксидного окиснення ліпідів та деградацією фосфоліпідів за ішемії та реперфузії мозку, серця та інших органів. Дійсно, при дослідженні нами ПОЛ при ішемії та реперфузії донорського органу було знайдено, що за 5-хв перфузії охолодженим розчином “Євроколлінз” (ЕС) має місце вірогідне зростання рівня ТБК-активних продуктів, яке утримується протягом 4-6 годин ішемії. На 22 годині ішемії та при реперфузії цей показник вірогідно збільшується в 2-2,5 рази. Додавання до розчину ЕС N-пальмітоїлетаноламіну запобігає накопиченню МДА під час перфузії, але майже не впливає на цей показник за ішемії та реперфузії (рис.6).

Отже, ми показали, що додавання N–пальмітоїлетаноламіну до стандартного розчину - консерванту гальмує накопичення ТБК-активних продуктів, зменшує рівень лізофосфатидилхоліну, арахідонової та ейкозатриєнової кислот, стабілізує вміст лінолевої кислоти та підвищує рівень фосфатидилінозитолу в донорському органі. Ці ефекти сприяють уповільненню змін рідинності мембран і, ймовірно, лежать в основі протекторної дії N-пальмітоїлетаноламіну, попереджуючи у деякій мірі деструктивні процеси, що спричинені ішемією.

Виявлений нами протекторний вплив NPE на тканину печінки щурів в умовах перфузії та ішемії добре узгоджується з даними морфологічного аналізу, що був проведений співробітниками Інституту хірургії та трансплантології АМН України. Так, аналіз морфологічних змін печінки показав, що, починаючи з 6-ї години ішемії, особливо на 22-й годині, додавання NРE до розчину “Євроколлінз” значно гальмує розвиток дистрофічних процесів у тканині печінки. Було виявлено певну стабілізацію структури органа, що виявлялась в ущільненні оболонок та цитоплазми клітин, збереженні структури печінкових балок при зменшенні їх обєму.

Враховуючи те, що репарація клітин від ішемічного та гіпоксичного ушкоджень залежить від збереження функціонування мітохондрій (цілісності мембран), а вагомим фактором у пошкодженні клітин за умов ішемізації органу є активація процесів пероксидного окиснення ліпідів, було вирішено оцінити вплив насичених NAE - N-пальмітоїл- та N-стеароїлетаноламіну - на кінетичні параметри вільнорадикального окиснення ліпідів, ініційованого Fe2+ та накопичення ТБК-активних продуктів у мітохондріях печінки щурів за умов гострої гіпоксії.

Вивчення впливу N-пальмітоїлетаноламіну на процеси пероксидного окиснення ліпідів у мітохондріях печінки щурів в умовах гіпоксичної гіпоксії.

В результаті експериментальних досліджень нами було показано, що в умовах розвитку гострої гіпоксії N-стеароїлетаноламін у концентрації 100-300 мкМ вірогідно пригнічує Fe 2+- індуковане утворення ТБК - активних продуктів у мітохондріях печінки щурів (Табл.1).

Максимальний ефект NSE проявляє на 3-й та 15-й хв експерименту. В той же час, N-пальмітоїлетаноламін у концентрації 150 мкМ вірогідно пригнічує накопичення ТБК-активних продуктів вже на 1-й хв експерименту, а починаючи з 5_ї - запобігає його зростанню (Рис. 7).

Оскільки метод вимірювання субстанцій, що реагують з тіобарбітуровою кислотою не є специфічним тільки для малонового діальдегіду і не було відомо, чи є NAE скевенжером вільних радикалів, чи інгібітором ланцюга реакцій, що спричиняють утворенння ТБК-реагуючих продуктів, був використаний хемілюмінесцентний метод вивчення кінетики вільнорадикального окиснення ліпідів (ВРОЛ).

Використовуючи модель гіпоксичної гіпоксії, ми знайшли, що інкубація з 100 мкМ N-пальмітоїл- або N-стеароїлетаноламіном призводить до вірогідного, по відношенню до гіпоксичного контролю, зниження амплітуди швидкого спалаху на 43-44%, а повільного на 8% (NPE) - 22% (NSE). Крім того, в умовах гострої гіпоксії NPE та NSE спричиняють збільшення на 50-54% величини показника Т, зменшення на 32% величини tg (NSE) (Табл.2). Зауважимо, що спалах Іш - відображує розпад ліпідних перекисів, який відбувається внаслідок їх контакту з іонами двовалентного заліза. Інтенсивність повільного спалаху (Іп) корелює з вмістом ТБК-активних продуктів. Величина tg характеризує швидкість вільнорадикального окиснення ліпідів, а показник Т відображує наявність у мембрані про- та антиоксидантів.

Отже, NPE та NSE в умовах гострої гіпоксії гальмують швидкість вільнорадикального окиснення ліпідів, запобігають утворенню проміжних та кінцевих продуктів пероксидного окиснення ліпідів. Показано, що інгібуючий вплив насичених NAE на ВРОЛ залежить від довжини їх вуглеводневого ланцюга і, можливо, зумовлений їх вбудовуванням у мембрани та модифікацією внаслідок цього фізико-хімічних властивостей мембран. Знайдені нами ефекти N-пальмітоїл- та N-стеароїлетаноламіну можливо лежать в основі їх протекторної дії, запобігаючи пероксидній деструкції біологічних мембран в умовах гострої гіпоксії.

Узагальнюючи результати проведеної роботи, можемо зробити загальний висновок, що в експериментах як in vivo, так і in vitro N_пальмітоїлетаноламін виявляє виражені мембранопротекторні властивості за умов ішемії та гіпоксії, в основі яких лежить його здатність модифікувати ліпідний склад гіпоксичних тканин. Виявлено можливість застосування NPE в розчинах - консервантах, як важливого компоненту для зменшення деструктивних змін та підвищення життєздатності ізольованих органів.

Висновки

Проведений комплекс експериментальних робіт дав змогу оцінити вплив NPE на ліпіди тканин печінки та серця щурів в умовах ішемічного ушкодження. Аналіз одержаних даних показав, що NPE, в умовах ішемії та гіпоксії, виявляє виражену мембранопротекторну дію і може бути застосований при розробці схем антиішемічного захисту міокарду та інших органів, а також стати біохімічною основою для розробки сучасних технологій збереження клітин донорського органу з метою його подальшого трансплантування.

1. Встановлено, що N-пальмітоїлетаноламін в умовах вазопресинової ішемії міокарду запобігає падінню рівня фосфатидилхоліну та надмірному утворенню лізофосфатидилхоліну в тканині міокарду, зменшуючи розвиток деструктивних процесів і сприяючи покращенню функціональних показників роботи серця.

2. Показано, що N-пальмітоїлетаноламін за умов ішемії та реперфузії донорської печінки щурів гальмує накопичення ТБК-активних продуктів, зменшує рівень лізофосфатидилхоліну, арахідонової та ейкозатриєнової кислот, стабілізує вміст лінолевої кислоти, запобігає змінам співвідношень насичені / ненасичені жирні кислоти та холестерол / фосфоліпіди, підвищує рівень фосфатидилінозитолу. Ці ефекти уповільнюють зміни рідинності мембран і, ймовірно, лежать в основі протекторної дії N-пальмітоїлетаноламіну, попереджуючи у деякій мірі деструктивні процеси, що спричинені ішемією та реперфузією.

3. Виявлено, що N-пальмітоїл- та N-стеароїлетаноламін пригнічують процеси Fe2+-індукованого вільнорадикального окиснення ліпідів мітохондріальних мембран в умовах гострої гіпоксії. За даними хемілюмінесцентного аналізу особливо виражений ефект був для N-стеароїлетаноламіну.

4. Встановлено, що N-пальмітоїлетаноламін виявляє виражені мембранопротекторні властивості за умов ішемії та гіпоксії, в основі яких лежить його здатність модифікувати ліпідний склад гіпоксичних тканин при активації процесів пероксидного окиснення ліпідів.

5. Кардіопротекторний та антиаритмічний ефекти N_пальмітоїлетаноламіну, який гальмує розвиток брадикардії та появу екстрасистол, свідчать про можливість його використання при ішемії серця.

6. Виявлено можливість застосування NPE в розчинах - консервантах для зменшення деструктивних змін та підвищення життєздатності ізольованих органів.

Список робіт за темою дисертації

·

·

·

·

·

·

·

·

·

·

Анотація

Горідько Т.М. Дія насичених N-ацилетаноламінів на ліпіди тканин печінки та серця щурів за умов ішемічного ушкодження. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2002.

Дисертацію присвячено вивченню дії насичених N-ацилетаноламінів на ліпідний склад печінки та серця щурів за умов ішемічного ушкодження.

Одержані дані вперше доводять, що в умовах вазопресинової ішемії міокарду N-пальмітоїлетаноламін запобігає падінню рівня фосфатидилхоліну та надмірному утворенню лізофосфатидилхоліну в тканині міокарду, сприяє покращенню функціональних показників роботи серця (гальмує розвиток брадикардії та появу екстрасистол, що були спричинені вазопресином). Показано, що в умовах гострої гіпоксії N-пальмітоїлетаноламін та N-стеароїлетаноламін вірогідно пригнічують Fe 2+- індуковане утворення ТБК - активних продуктів, гальмують швидкість вільнорадикального окиснення ліпідів у мітохондріях печінки щурів. За ішемії та реперфузії донорської печінки щурів N_пальмітоїлетаноламін зменшує накопичення ТБК-активних продуктів, гальмує надмірне утворення лізофосфатидилхоліну, запобігає змінам складу фосфоліпідів та жирних кислот, зменшує розвиток деструктивних процесів в тканинах досліджуваних органів.

Аналіз одержаних даних показав, що в експериментах як in vivo, так і in vitro N_пальмітоїлетаноламін в умовах ішемії та гіпоксії виявляє виражені мембранопротекторні властивості. В основі цих властивостей лежить його здатність модифікувати ліпідний склад гіпоксичних тканин при активації процесів пероксидного окиснення ліпідів. Виявлено можливість застосування N-пальмітоїлетаноламіну при розробці схем антиішемічного захисту міокарду та інших органів, а також в розчинах - консервантах для зменшення деструктивних змін та підвищення життєздатності ізольованих органів.

Ключові слова: N-ацилетаноламіни, N-пальмітоїлетаноламін, N_стеароїлетаноламін, фосфоліпіди, жирні кислоти, пероксидне окиснення ліпідів, серце, печінка, вазопресин, ішемія.

АННОТАЦИЯ

Горидько Т.Н. Действие насыщенных N-ацилетаноламинов на липиды тканей печени и сердца крыс при ишемическом повреждении. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Институт биохимии им. А.В.Палладина НАН Украины, Киев, 2002.

Диссертация посвящена изучению действия насыщенных N-ацилетаноламинов на липидный состав печени и сердца крыс в условиях ишемического повреждения.

Полученные данные впервые доказывают, что в условиях вазопрессиновой ишемии миокарда N-пальмитоилэтаноламин предотвращает снижение содержания фосфатидилхолина и чрезмерное образование лизофосфатидилхолина в миокарде, оказывает содействие улучшению функциональных показателей работы сердца (тормозит развитие брадикардии и появление экстрасистол, вызванных вазопрессином). В условиях острой гипоксии N-пальмитоилэтаноламин (NPE) и N-стеароилэтаноламин (NSE) достоверно тормозят Fe 2+ - индуцированное образование ТБК - активных продуктов, снижают скорость свободнорадикального окисления липидов в митохондриях печени крыс. Найденные при гипоксии эффекты NPE и NSE, возможно, являются основой протекторного действия N-ацилэтаноламинов. Также найдено, что добавление N-пальмитоилэтаноламина к стандартному раствору-консерванту в условиях ишемии и реперфузии донорского органа тормозит накопление ТБК-активних продуктов, уменьшает уровень лизофосфатидилхолина, арахидоновой и эйкозатриеновой кислот, стабилизирует содержание линолевой кислоты, повышает уровень фосфатидилинозитола, предотвращает изменения величины соотношения холестерол/фосфолипиды, а также соотношения насыщенные / ненасыщенные жирные кислоты. Эти эффекты замедляют развитие изменений текучести мембран и, вероятно, лежат в основе протекторного действия N-пальмитоилэтаноламина при указанных условиях.

Проведенный комплекс экспериментальных работ дал возможность оценить влияние NPE на липиды тканей печени и сердца крыс в условиях ишемического повреждения. Анализ полученных данных показал, что в экспериментах как in vivo, так и in vitro N_пальмитоилэтаноламин в условиях ишемии и гипоксии проявляет выраженные мембранопротекторные свойства. В основе этих свойств лежит его способность предотращать изменения липидного состава гипоксических тканей при активации процессов перекисного окисления липидов. Выявлена возможность применения N-пальмитоилэтаноламина при разработке схем антиишемической защиты миокарда и других органов, а также в консервирующих растворах для уменьшения деструктивных изменений и повышения жизнеспособности изолированных органов.

Ключевые слова: N-ацилэтаноламины, N-пальмитоилэтаноламин, N_стеароилэтаноламин, фосфолипиды, жирные кислоты, пероксидное окисление липидов, сердце, печень, вазопрессин, ишемия.

SUMMARY

Goridko T.M. The action of saturated N-acylethanolamines on lipids of rat liver and heart tissues at ischemic damage – Manuscript.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.04 – Biochemistry. O. V. Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2002.

The thesis is dedicated to the investigation of saturated N-acylethanolamines effects on lipid content in rat liver and heart under ischemic damage.

The data obtained proved for the first time that N-palmitoylethanolamine (NPE) under ischemia stimulated by vasopressin prevented the reduction of phosphatidylcholine level and the excessive formation of lysophosphatodylcholine (LPC) in the myocardium. It also promoted the improvement of heart work functional indexes. NPE prevented the development of bradycardia and the arising of extrasystoles caused by vasopressin.

It was shown that N-palmitoyl- and N-stearoylethanolamine reliably inhibited the Fe2+-induced formation of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and reduced the rate of free radical oxidation of lipids in the liver mitochondria of rats with acute hypoxia.

Under ischemia and reperfusion of a donor organ NPE reduced the accumulation of TBARS, LPC, arachidonic and eicosatrienic acids, stabilised the linoleic acid content, increased phosphatidylinositol level, prevented the changes of cholesterol / phospholipids ratio and saturated / unsaturated fatty acids ratio. These effects prevented fast changes of membrane fluidity and, probably, created the base of the protective action of NPE under experimental ischemia.

The present work indicated that both in vivo and in vitro experiments NPE showed expressed membrane protective properties under ischemia and hypoxia. These results suggested that NPE had the ability to modify the lipid composition of hypoxic tissues under the activation of lipids peroxidation. The protective properties of the NPE were partly based on its antioxidative effect. N-palmitoylethanolamine can be used for the development of schems for myocardium antiischemic protection and for protection of other tissues, and also as a component of preserve solutions in order to decrease the destructive changes and to increase the viability of isolated donor organs.

Key words: N-acylethanolamines, N-palmitoylethanolamine, N-stearoylethanolamine, phospholipids, fatty asids, lipids peroxidation, heart, liver, vasopressin, ischemia.