національна академія наук україни

інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного

жерносєкова ірина Володимирівна

УДК 576.8.095.58+579.873.71+577.15

мінливість продуцентА літичних ферментів

Streptomyces recifensis var. lyticus

та його селекція

03.00.07 - мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Науково-дослідному інституті біології Дніпропет-ровського національного університету.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Вінніков Альберт Іванович,

Дніпропетровський національний університет,

завідувач кафедри мікробіології та вірусології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Заха-ро-ва Ірина Яківна,

Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д. К. Забо-лотного НАН України,

науковий кон-сультант відділу біохімії мікроорганізмів

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Колтукова Наталія Володимирівна,

Інститут епідеміології та інфекційних хвороб
ім. Л.В. Громашевського

АМН України, старший науковий співробітник відділу загальної мікробіології

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка.

Захист відбудеться “20” березня 2002 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 при Інституті мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, б. 154, ІМВ ім. Д.К. Заболотного.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного.

Автореферат розісланий ”20” лютого 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Ферментні препарати знайшли широке застосування в різних галузях народного господарства. В останні десятиріччя інтенсивно вивчаються літичні ферменти, можливість їх виготовлення та практичного застосування. За кордоном випускається ряд препаратів, які відрізняються специфічністю та направленістю своєї дії. Літичні ферменти ефективно використовуються в науково-дослідних роботах, при вирішенні ряду біотехноло-гічних процесів, а також перспективні в якості хіміопрепаратів в медичній та ветеринарній практиці.

Розширення асортименту випускаємих препаратів буде сприяти їх широкому застосуванню при вирішенні багатьох питань теоретичного та практичного характеру. В зв'язку з цим актуальними залишаються дослідження, присвячені пошуку нових продуцентів, вивченню складу літичних комплексів та їх механізму дії, розробці умов ферментації та виготовлення нових препаратів з заданими властивостями.

Співробітниками НДІ біології та кафедри мікробіології і вірусології Дніпропетровського університету вивчаються літичні ферменти стрептоміцетів. Відібрано перспективний продуцент з широким спектром бактеріолітичної дії. На основі біосинтезу Streptomyces recifensis var. lyticus розроблено засіб виготовлення нового препарату літичних ферментів.

Для впровадження в виробництво нових препаратів актуальними є дослідження, присвячені селекції продуцента, оптимізації ферментаційних середовищ та умов культивування, пошуку засобів збереження високої активності селекціонованих штамів.

Мета та задачі дослідження. Мета даної роботи складалась з дослідження мінливості S. recifensis var. lyticus та підвищення його літичної активності на основі відбору рифампіциностійких мутантів.

В задачі досліджень входило вирішення таких питань:

–

–

–

–

–

–

Об’єкт дослідження. Штами S. recifensis var. lyticus 2435 та П-29 – продуценти літичних ферментів.

Предмет дослідження. Відбір високоактивного рифампіциностійкого мутанту, стабілізація біосинтетичної активності.

Методи дослідження. Мікробіологічні – для проведення селекції; біохімічні – для оцінки ферментативних активностей та характеристики ферментних комплексів; математичні – для оптимізації ферментативних середовищ; статистичні – для аналізу та достовірної оцінки отриманих результатів.

Наукова новизна роботи. Отримано нові дані про можливість застосування рифампіцину в селекції продуцентів екстрацелюлярних ферментів. Вперше показано, що рифампіцин, внесений в оптимальних концентраціях в агаризоване середовище вирощування, здатний стабілізувати літичну активність селекціонованих штамів.

Відібрано новий рифампіциностійкий штам 2Р-15. Встановлено, що висока його активність обумовлена збільшенням показника середньої літичної активності клонів, значним накопиченням в популяції плюс-варіантів та рифампіциностійких мутантів, зниженням коефіцієнту мінливості. Одержано дані про зниження його чутливості до інгибуючої дії глюкози.

Ферментний комплекс штаму 2Р-15 втратив дріжджелітичну активність. На основі даних іонообмінної хроматографії встановлено, що в пулі його екстрацелюлярних білків зросла частка літичних протеаз, виявлено більшу їх кількість та зростання питомої активності.

Практичне значення роботи полягає в тому, що в результаті трьохступінчатої селекції відібрано мутантний штам 2Р-15, перспективний для промислового виробництва нового препарату літичних ферментів. Його літична активність порівняно з батьківським штамом відносно клітин Staphylococcus aureus збільшилась в 2,5 рази та Micrococcus lysodeikticus – в 5 разів.

Встановлено можливість підвищення ефективності відбору перспективних клонів по зонам деградації субстрату при використанні модифікованого нами індикаторного середовища. Отримано нові варіанти ферментаційного середовища на основі оптимізації кількісного вмісту компонентів, які забезпечили високу літичну активність рифампіциностійких мутантів.

Встановлено можливість збільшення лізуючої активності ферментних препаратів при сумісному їх використанні з поверхнево-активною речовиною – етонієм.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Представлені в дисертації результати досліджень відповідають основному плану науково-дослідних робіт НДІ біології та кафедри мікробіології та вірусології ДНУ. Робота виконана згідно держбюджетних тем № 64-94 “Дослідження регуляції біосинтезу літичних ферментів, нового лізоензимного препарату та сфери можливого його застосування” та № 01-11-97 “Дослідження особливостей метаболічних процесів у мікроорганізмів та розробка технічних умов виробництва нових біологічно активних препаратів”, які координуються планами науково-дослідних тем Міністерства освіти України.

Особистий внесок здобувача. Особиста участь дисертанта полягала у визначенні методичних підходів та проведенні експериментальних досліджень, статистичній обробці даних, узагальненні одержаних результатів та в співставленні їх з літературними матеріалами. Дослідження складу ферментного комплексу основних морфологічних варіантів батьківського штаму та селекціонованого – 2Р-15 здійснено за участю к.б.н. Соколової І.Є. (ДНУ, кафедра мікробіології та вірусології). Оптимізацію ферментаційного середовища на основі методу математичного планування експерименту було проведено за консультативною допомогою к.б.н. Кілочок Т.П. (НДІ біології ДНУ).

Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на з’їздах Українського мікробіологічного (Київ, 1994; Чернігів, 2000) та біохімічного товариства (Київ, 1994; 1997), на конференціях молодих вчених (Москва, 1989), на Міжнародних конференціях "Мікроорганізми та їх метаболіти в народному господарстві" (Кишинів, 1996), "Наука та освіта" (Дніпропетровськ, 1998), "Alliance Francaise" (Дніпропетровськ, 1998).

Публікації. Основні результати дисертації опубліковано у 8 роботах, в тому числі в 4-х журнальних статтях.

Структура та об'єм дисертації. Робота складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, трьох розділів результатів власних досліджень, заключення, висновків та списку цитованої літератури, який включає 240 найменувань, з яких 92 іноземних. Роботу викладено на 150 сторінках машинописного тексту, ілюстровано 19 рисунками та 22 таблицями.

Основний зміст роботи

Огляд літератури

Огляд літератури складається з двох розділів, які висвітлюють принципи традиційних методів селекції продуцентів біологічно активних речовин, в основі яких лежить індукований мутагенез та ступінчатий відбір більш активних мутантів, а також розвиток нових напрямків в селекції – використання протопластів та отримання рекомбінантних штамів на основі їх злиття.

Критично розглянуті пошуки шляхів підвищення ефективності селекції продуцентів антибіотиків, амінокислот, ферментів. Значну увагу приділено використанню при селекції продуцентів ферментів модифікованого методу відбору найбільш активних мутантів та розробці селективних методів, які дозволяють вести спрямований відбір мутантів зі зміненими механізмами регуляції.

На основі аналізу літератури, при селекції продуцента літичних ферментів S. recifensis var. lyticus були використані протопластування та селективний відбір регуляторних мутантів за допомогою рифампіцину. Перспективні клони виявляли на індикаторному середовищі по розміру зон деградації субстрату. Вибрані методи та прийоми дозволили значно скоротити обсяг досліджень.

Матеріали та методи досліджень

Об'єктами досліджень були штами S. recifensis var. lyticus 2435 (Шинкаренко, 1979), П-29 (Кулікова та ін., 1994), рифампіциностійкі варіанти, відібрані в процесі роботи. Спорові культури вирощували при 28 оС на протязі 10 – діб на агаризованому середовищі Гаузе 1.

Ростові показники та літичну активність різних культур визначали при глибинному вирощуванні (220 об/хв) при 28 оС: батьківського штаму 2435 – на раніше розробленому середовищі (Кілочок, 1988), штамів П-29, рифампіциностійких мутантів та селекціонованого штаму 2Р-15 – на двох нових варіантах середовища того ж складу, додатково оптимізованих нами на основі симплексного методу математичного планування експерименту (Горський, Бродський, 1965). Проби культуральної рідини відбирали в динаміці росту, або через 72 години. Про активність досліджуємих штамів судили по рівню бактеріолітичної активності.

При дослідженні впливу глюкози на біосинтез літичних ферментів стерильні її розчини вносили перед висівом штамів П-29 та 2Р-15 в ферментаційне середовище (ФС-2) до кінцевої концентрації від 1 до 5%. Зміну літичних активностей досліджуємих культур відносно клітин S.та M. lysodeikticus виражали у відсотках від контролю (%).

Літичну активність визначали турбодиметричним методом (Isono et al., 1972). Реакційну суміш, яка містить 1 мл ферментного розчину та 1 мл клітин тест-культури (вихідна оптична щільність при 590 нм в 0,5 см кварцевій кюветі складала 0,5 – ,6) інкубували при 55 оС на протязі 30 хвилин. За одиницю активності приймали таку кількість ферменту, яка знижувала оптичну щільність суспензії на 0,001 за 1 хвилину при розчині ферменту здатному сприяти лізису клітин на 25 – %. В якості субстрату (тест-культури) бактеріолітичних ферментів використовували відмиті клітини S. та M.. Питому активність виражали в од/мг білка.

Протеолітичну активність визначали методом Ансона в модифікації Авіженіса та Савіцкайте (1969), використовуючи в якості субстрату казеїн.

При виділенні ферментних комплексів з метою дослідження компонентного складу, супернатант охолодженої культуральної рідини змішували з охолодженим ацетоном в об’ємному співвідношенні 1:1,5. Створений осад за 1,5 години відділяли на рефрижераторній центрифузі при 3,5 тис. об/хв при температурі – 20 оС. Осад суспензували в невеликому об'ємі 0,02 М Na-ацетатного буферу (рН – 5,6). Іонообмінну хроматографію ацетонових препаратів штамів 2435 та 2Р-15 проводили на КМ-сефадексі С-50 (Pharmacia, Швеція). На колонку (1,2 х см), заповнену іонообмінником та урівноважену 0,02 М ацетатним буфером, наносили 1-3 мл (20-50 мг білка) розчинів досліджуємих препаратів. Елюцію білків з колонки проводили спочатку ацетатним буфером з вихідною молярністю, а потім з зростаючою молярністю від 0,02 до 1 М. Профіль елюції білка контролювали при екстинції Е 280 нм. В отриманих фракціях визначали кількість білка методом Бредфорда (1976).

Дослідження природної мінливості S. recifensis var. lyticus 2435 проводили по схемі, заснованій на врахуванні змін морфолого-культуральних властивостей варіантів колоній та визначенні їх активностей (Кузнецов, 1972). Літичну активність різних типів колоній оцінювали по розмірам зон деградації клітин стафілокока, внесених в голодне середовище Гаузе 1, та виражали у відсотках від контролю.

В селекції продуцента літичних ферментів з метою відбору регуляторних мутантів використовували рифампіцин, який вносили в середовище Гаузе 1 в концентрації від 6 до 20 мкг/мл. При вивченні мінливості по рівню літичної активності кожного досліджуємого штаму, а також мутантів, стійких до різних концентрацій рифампіцину, колонії 1-го морфологічного типу відсівали уколом на індикаторне середовище, чутливість якого було збільшено за рахунок використання двох шарів: нижній – повноцінне середовище Гаузе 1, верхній – 1ний агар з субстратом. У відібраних варіантів визначали літичну активність в умовах глибинної ферментації.

Вплив рифампіцину на стабілізацію високої активності вивчали на двох відібраних мутантах 1Р-92 та 1Р-232, культури яких послідовно пересівали на середовище Гаузе 1 без антибіотика та з внесенням його в різних концентраціях (5,0; 7,5; 10 мкг/мл). Літичну активність субкультур визначали в од/мл та виражали її у відсотках від активності вихідних культур досліджуємих штамів.

Статистичну обробку експериментальних даних при малих вибірках проводили за Кокуніним (1975) з використанням коефіцієнту Ст’юдента. При великих вибірках використовували більш економічні засоби обчислень , , m – засіб сум (Плохінський, 1970).

Спонтанна мінливість продуцентА літичних

ферментів S. recifensis var. lyticus 2435

Популяційну мінливість батьківського штаму 2435 вивчали за морфологічними ознаками колоній та їх активністю, що має практичне значення для селекції. Встановлено, що популяція зрілих культур при моноспорових розсівах на різних середовищах представлена двома близькими морфологічними типами колоній: до 1-го типу віднесено колонії круглі, випуклі з рівними краями та валиком по периферії, сіруватим міцелієм; до 2-го – колонії з бугристою поверхнею, хвилястими краями та білісуватим забарвленням повітряного міцелію. Серед них зустрічаються і атипічні колонії, які віднесено до 3-го типу.

Саму високу морфологічну мінливість штаму 2435 виявлено на модифікованому середовищі Чапека, саму низьку – при пересівах на середовищах Гаузе 1 з крохмалем або глюкозою. На цих середовищах в популяції збільшується кількість варіантів 1-го типу з 83,3 до 94,0а кількість атипічних колоній зменшується з 8,9 до 0,2% (Табл.1).

Таблиця 1

Мінливість штаму 2435 та його морфологічних варіантів при

вирощуванні на різних живильних середовищах

Досліджуєма

культура | Середовище

вирощування | Склад популяції (%)

1-й тип | 2-й тип | 3-й тип

Чапека модифіковане | 83,3 | 7,8 | 8,9

Вихідний штам | Гаузе 1 з глюкозою | 92,6 | 7,0 | 0,4

Гаузе 1 з крохмалем | 94,0 | 5,8 | 0,2

1-й морфологічний тип | те саме | 96,1 | 3,7 | 0,2

2-й морфологічний тип– | – | 32,5 | 65,0 | 2,5

3-й морфологічний тип– | – | 0 | 0 | 100

Активність варіантів 1-го та 2-го морфологічних типів визначали по розміру зон лізису клітин стафілокока, внесених в індикаторне середовище, і виражали її в відсотках від контролю. Встановлено, що більшу активність мають варіанти 1-го типу. У варіантів 2-го типу показник середньої літичної активності знижено з 82,3 до 65,7%, межі мінливості зміщено в сторону менших значень, а коефіцієнт варіацій значно збільшено (Табл. ). Отримані дані були підтверджені при виборочній перевірці активності культур різних морфологічних типів в умовах глибинного вирощування.

Таблиця 2

Показники мінливості стафілолітичної активності

у варіантів основних морфологічних типів штаму 2435

Морфоло-

гічний тип | Активність,

% від контролю, m | Коефіцієнт варіації,

% | Межі

мінливості,

2 | Частота, %

плюс-

варіанти | мінус-

варіанти

1-ий | 82,32,4 | 23,1 | 42,5 – 121,9 | 0 | 5,02,2

2-ий | 65,72,5 | 38,3 | 15,3 – 116,1 | 0 | 16,03,7

При визначенні активності літичних ферментів 1-го та 2-го варіантів відносно різних тест-культур нами було встановлено схожий спектр їх дії, тоді як активність 2-го типу було знижено в різній мірі, особливо відносно різних видів та штамів спорових бактерій. Отримані дані дозволили припустити, що у варіантів 2-го типу не тільки знижено літичну активність, а зміни можуть стосуватися складу їх ферментних комплексів.

Ацетонові препарати, виділенні з культуральної рідини 1-го та 2-го морфологічних варіантів, було досліджено з використанням методу іонообмінної хроматографії на КМ-сефадексі С-50. Встановлено, що варіант 1-го типу синтезує такий же комплекс стафілолітичних ферментів, як і батьківський штам 2435: на хроматограмі нами виявлено дві глікозидази, які не мають зв’язку з протеолітичною активністю, та в зоні градієнтної елюції білків – п’ять піків стафілолітичної активності, що відповідає розміщенню п'яти ендопептидаз, описаних раніше Соколовою (1985). В препараті 2-го морфологічного типу глікозидази відсутні, серед білків, які не сорбуються на катіонообміннику, виявлено ферменти з низькою стафілолітичною активністю. В зоні ендопептидаз замість п’яти – знайдено лише три піки стафілолітичної активності. Отримані дані вказують на те, що менша активність варіантів 2-го типу обумовлена тим, що вони синтезують неповний набір індивідуальних ферментів та їх питома активність нижча.

Проведені нами дослідження свідчать про те, що зниження літичної активності штаму 2435 відносно S. та інших тест-культур відбувається тому, що з їх популяцій витісняються варіанти 1-го типу за рахунок зростання менш активних варіантів 2-го типу. На основі отриманих даних відбір найбільш активних колоній 1-го морфологічного типу по розміру зон деградації субстрату, виявлених на індикаторному середовищі, ефективно використовували при стабілізації активності батьківського штаму 2435, а також на всіх етапах його селекції.

Селекція продуцентА літичних ферментів

S. recifensis var. lyticus

При селекції продуцента літичних ферментів у якості вихідного штаму було використано штам П-29, відібраний раніше із числа найбільш активних регенерантів. Штам виявив значну нестабільність – його стафілолітична активність при лабораторному вирощуванні знизилась з 3500 од/мл до 250 –  од/мл. В експериментах вивчали принципову можливість та ефек-тивність застосування рифампіцину для відбору високоактивних регулятор-них мутантів серед антибіотикостійких клонів. Літичну активність природних варіантів та рифампіциностійких мутантів визначали по розміру зон лізису субстрату і виражали її в відсотках від контролю. З цією метою колонії 1-го морфологічного типу відсівали на модифіковане індикатор-не середовище, зони вимірювали через три доби вирощування при 28С.

Встановлено, що майже у 90варіантів штаму П-29 літична активність коливається в досить вузьких межах – від 70 до 130В популяції виявлено 11,9неактивних варіантів, що знижує показник середньої активності. Летальний ефект рифампіцину залежить від його концентрації в живильному середовищі: при її збільшенні від 6 до 14 мкг/мл виживаємість спор знижується з 6,1 до 0,02У мутантів, стійких до 10 –  мкг/мл антибіотика, розширюються межі мінливості, коефіцієнти варіацій зростають до 27,6 – ,9 проти 19,7в контрольному розсіві. Серед мутантів, стійких до 14 мкг/мл рифампіцину, виявлено зростання мінус-варіантів до 21,5та плюс-варіантів – до 10проти 2,4в контролі (табл. 3).

На першому ступені використання рифампіцину із великої кількості клонів було відібрано 30, у більшості з них в умовах глибинної ферментації активність перевищувала вихідний штам П-29 на 20-100проте рівень активності навіть найкращих варіантів досягав лише 500 – од/мл. Враховуючи дані літератури можна припустити, що низька активність штаму П-29 та відібраних мутантів пов'язана з суттєвими змінами їх геному, які виникають часто в результаті протопластування та регенерації.

Таблиця 3

Показники популяційної мінливості колоній по рівню літичної

активності штаму П-29 та його рифампіциностійких мутантів

Варіанти | Концентра-ція рифам-пі-цину, мкг/мл | Виживає-мість спор, % | Число варіан-тів (n) | Літична ак-тивність, % від К
( m) | Коефіцієнт варіацій (СV) | Межі мінливості (2) | Частота, %

плюс-варіанти | мінус-варіанти

Природні (контроль) | 0 | 100 | 84 | 86,41,8 | 19,7 | 52,4–120,4 | 2,41,7 | 11,93,5

Рифампі-циностійкі | 6–8 | 6,1–4,7 | 98 | 89,51,7 | 19,4 | 54,7–124,2 | 2,01,4 | 14,33,5

10–12 | 1,7–0,9 | 70 | 80,32,7 | 27,9 | 35,5–125,1 | 2,81,4 | 17,14,5

14 | 0,02 | 70 | 83,92,8 | 27,6 | 37,5–130,3 | 10,03,6 | 21,54,9

Відомо, що у мікроорганізмів біосинтез метаболітів тісно пов'язаний з енергетичним обміном. В попередніх дослідах нами було встановлено, що підвищення концентрації глюкози від 0,2 до 1,4збільшує активність штамів в 4 – ,8 разів. При оптимізації середовища вміст глюкози в ньому було збільшено до 0,66проти 0,07в вихідному середовищі. На новому варіанті ферментаційного середовища (ФС-2) активність штаму П-29 досягла рівня 2000 – од/мл, а у більшості відібраних рифампіциностійких мутантів – 3000 – од/мл, що перевищує контроль на 50 – 

На слідуючому ступені селекції в якості вихідних було використано штами 1Р-92 та 1Р-232, відібрані з клонів, стійких до 10 та 14 мкг/мл рифампіцину. При порівняльних дослідженнях мінливості варіантів моноспорового розсіву по літичній активності та впливу рифампіцину встановлено, що в їх популяціях, на відміну від штаму П-29, неактивні варіанти відсутні, показники середньої активності зросли до 1051,9 та 113,31,2 проти 86,41,8межі мінливості природних варіантів змістилися в сторону більших величин (рис.1).

При близькій літичній активності вплив рифампіцину на їх спори відрізняється. Так, для штаму 1Р-92 концентрації антибіотика 12 та 16 мкг/мл вже токсичні, на що вказує зниження показників середньої активності у рифампіциностійких мутантів до 95,62,0 – 85,04,1 проти 1051,9встановленого для природних варіантів, а також значне зростання частоти виникнення мінус-варіантів.

Слід відзначити, що в популяції штаму 1Р-232, порівняно зі штамом 1Р-92, на 1-2 порядки більше резистентних спор, рівень їх стійкості вищий. Відносно спор цього штаму не виявлено негативного впливу навіть більших концентрацій (16 – мкг/мл) антибіотика. Більш того, середні показники їх літичної активності зросли, межі мінливості змістилися в сторону більшої активності. Серед стійких мутантів виявлено від 5,1 до 7,7плюс-варіантів, мінус-варіанти ще відсутні. Отримані дані свідчать про велике значення вибору вихідних штамів на кожному ступені селекції.

Враховуючи, що штам 1Р-92 було відібрано значно раніше, ніж штам 1Р-232, подальшу селекцію вели в першій лінії. На другому ступені використання рифампіцину також відбирали найбільш перспективні колонії по розміру зон деградації субстрату. Із 21 варіантів літична активність у шести з них перевищувала активність штаму 1Р-92 на 20–50Активність селекціонованого в цій лінії штаму 2Р-15 відносно клітин S.та M. зросла в 2,5 та 5 разів порівняно з батьківським штамом. Встановлено, що висока активність штаму 2Р-15 обумовлена збільшенням показника середньої літичної активності природних варіантів (від 86,41,8 у вихідного штаму до 118,21,4значним накопиченням в популяції плюс-варіантів – 45,44,3 проти 2,41,7в контролі (рис. ). Крім того, в його популяції значно зросла кількість антибіотикостійких спор та знизилась частка варіантів 2-го морфологічного типу (з 7,0 до 1,5

Отримані результати свідчать не тільки про принципову можливість використання рифампіцину в селекції продуцентів екстрацелюлярних ферментів, а й про високу його ефективність.

Виходячи з того, що для забезпечення високого рівня біосинтетичної активності любого нового штаму важливе значення має збалансованість живильних речовин, нами було прове дено оптимізацію вихідного ферментаційного середовища. Оптимізацію проводили на основі методу математичного планування експерименту, який дозволяє випробувати всі компоненти середовища на декількох рівнях (Горський, Бродський, 1965). Оптимізацію проводили в два етапи: спочатку по основним джерелам живлення (С,N.P), а потім по мікро- та макроелементному складу. Вплив різних компонентів та їх концентрацій визначали по рівню стафілолітичної активності.

Вже на першому етапі на п’яти варіантах середовища (4+1) при вирощуванні двох рифампіциностійких мутантів (1Р-40 та 1Р-116) їх стафілолітична активність зросла в 4,6–9 разів (табл. 4 – дані наведено для одного штаму). В подальших дослідженнях, згідно методу симплекса, оптимізацію проводили шляхом заміни найгіршого варіанту новим складом. Нам необхідно було провести лише одну ступінь оптимізації, щоб досягти максимальної активності досліджуємих штамів.

Таблиця 4

Вплив зміни концентрацій основних джерел живлення (N, C, Р) у вихідному ферментаційному середовищі (ФС-1) на стафілолітичну активність рифампіциностійкого мутанту

Штам | Номер

варіанту середовища | Літична активність од/мл | Коефіцієнт різниці | Ступінь оптимізації | Літична активність од/мл | Коефіцієнт різниці

1 Р-40 | 1 | 208042,0 | 7,4–––

2 | 180057,7 | 6,4–––

3 | 173076,8 | 6,1 | III | 2210103,0 | 7,8

4 | 130028,9 | 4,6 | I | 315086,6 | 11,1

5 | 142095,3 | 5,0 | II | 135028,9 | 4,8

ФС-1 (К) | 28028,9 | 1,0 | ФС-1 (К) | 28028,9 | 1,0

На другому етапі, при оптимізації отриманого варіанту середовища по вмісту мікро- та макроелементів, встановлено, що зміна їх концентрацій, порівняно з основними джерелами живлення (C, N, P), впливає значно менше. Застосування симплексного методу дозволило нам при мінімальних затратах (на двох ступенях було досліджено всього 13 варіантів середовища) оптимізувати співвідношення десяти компонентів. Новий варіант ферментаційного середовища (ФС-2) використовували при оцінці літичної активності відібраних мутантів. На цьому середовищі їх активність досягала 2500 – од/мл.

Аналогічним чином було отримано ще один варіант середовища (ФС-3) для селекціонованого штаму 2Р-15. Нові варіанти відрізняються від вихідного середовища перш за все значним (в 10 та 15 разів) підвищенням вмісту глюкози та деяким збільшенням концентрації ряду інших компонентів.

Як відомо, селекція високоактивного штаму невід'ємно пов'язана з проблемою збереження цієї ознаки в процесі культивування. Згідно нових підходів в рішенні цієї задачі можуть бути використані антимутагени, регулятори експресії процесів метаболізму та деякі антибіотики при введенні їх в агаризоване середовище (Даніленко, Родіонова, 1988).

З метою збереження високої активності відібраних рифампіциностійких мутантів нами було опробувано введення рифампіцину в різних концентраціях в агаризоване середовище вирощування двох штамів – 1Р-92 та 1Р-232. Їх культури послідовно пересівали на середовище Гаузе 1 без антибіотика та з зростаючими його концентраціями від 5 мкг/мл до 12,5 мкг/мл. Стафілолітичну активність субкультур в різних лініях визначали в од/мл та виражали в відсотках від активності вихідних культур. Встановлено, що концентрації антибіотика від 7,5 до 12,5 мкг/мл стабілізують активність, а у ряда субкультур – навіть збільшують її на 15 – 

В другій серії досліджень використано природний варіант штаму 1Р-92 (ПВ-12). Було отримано по 7 субкультур в чотирьох лініях. В кожній лінії використовували одну концентрацію антибіотика: 5,0; 7,5 та 10 мкг/мл, конт-рольна лінія – без антибіотика. Встановлено, що в контрольній лінії уже у 3-ї субкультури літична активність знижується, а у 7-ї – вона складає 56,1від вихідної. Позитивні результати було отримано при введенні в середовище вирощування антибіотика в концентрації 7,5 мкг/мл. В цій лінії у перших 4-х субкультур не тільки стабілізується, а навіть підвищується (на 7,3-20,7літична активність. Концентрація 10 мкг/мл для досліджуємого варіанту токсична – уже у 2-ої субкультури активність різко знижується. В той же час, при першому висіві культури на середовище з 10 мкг/мл антибіотика її літична активність зросла на 28,8(рис. ).

Нами встановлено, що для штамів 1Р-232 та 2Р-15, які походять від більш стійких клонів (14 мкг/мл проти 10 мкг/мл для штама 1Р-92), для стабілізації оптимальною являється концентрація 10 мкг/мл. Отримані результати було використано для довгого збереження активності селекціонованого штаму 2Р-15, культури якого вирощували на середовищі Гаузе 1 з оптимальною для нього концентрацією (10 мкг/мл) рифампіцину та зберігали їх в рефрижераторі при – 20С.

Отримані дані свідчать, що рифампіцин може бути ефективно використаним не тільки в селекції продуцентів ферментів, а й для стабілізації високої активності у селекціонованих штамів.

Таким чином, на основі проведених досліджень в результаті трьохступінчатої селекції нами відібрано мутантний штам 2Р-15, перспективний для промислового виробництва нового лізоензимного препарату.

Практичне значення мають також отримані дані про можливість підвищення лізуючої активності ферментних препаратів, особливо при роботі з важколізуємими мікроорганізмами та густими їх суспензіями. В плані пошуку нових речовин, здатних збільшувати ферментативний лізис клітин стафілокока, нашу увагу привернув етоній.

Було проведено порівняльне дослідження ряда зразків ферментного препарату Г10х, отриманих в дослідно-промислових умовах, після зберігання протягом 2-4-х років при кімнатній температурі. Встановлено, що їх стафілолітична активність в присутності оптимальної концентрації етонію (2,5 мгв реакційній системі зростає в 2,6-4,5 разів і перевищує, як правило, вихідну активність. Етоній збільшує літичну активність в 1,6 разів і свіжевиготовлених лабораторних зразків ацетонового препарату (табл. ).

Таблиця 5

Вплив етонію на рівень стафілолітичної активності ряду зразків

препарату Г10х, одержаних в дослідно-промислових та лабораторних умовах

Партія

препа-рату |

Номер зразка | Літична активність, од/г |

Коефіцієнт

різниці

вихідна | після збереження

без етонію (К) | з етонієм

I | 1 | 100000 | 57000 | 147000 | 2,6

2 | 100000 | 58000 | 240000 | 4,1

3 | 50000 | 37000 | 100000 | 2,7

II | 1 | 130000 | 40000 | 173000 | 4,3

2 | 50000 | 11000 | 49000 | 4,5

III | лабораторний | 4100*– | 6600* | 1,6

* Літична активність визначена в од/мг білка

Встановлено також можливість використання розчинів етонію для попередньої обробки густих (10них) суспензій стафілокока – чутливість їх клітин значно зростає до лізуючої дії досліджуємого ферментного препарату. Підібрані умови при яких активність лізису 10них суспензій стафілокока досягає 90за 30 хвилин при 37С.

Можливо припустити також, що етоній при сумісному його використанні з препаратами літичних ферментів буде збільшувати їх хіміотерапевтичну активність як при стафілококових, так і змішаних інфекціях.

Дослідження деяких біологічних особливостей

мутантів, відібраних в ході селекції

В результаті трьох ступенів селекції стафілолітична активність продуцента S. recifensis var. lyticus 2435 зросла від 2200 – до 5800 –  од/мл. В ході селекції для відібраного регенеранта П-29, рифампіциностійких мутантів та селекціонованого штаму 2Р-15 виникла необхідність поступового збільшення вмісту глюкози в ферментаційному середовищі, що вказує на певні зміни у них енергетичного обміну. В зв'язку з цим було проведено порівняльні дослідження чутливості синтезу бактеріолітичних ферментів до інгибуючої дії глюкози у штамів П-29 та 2Р-15. Раніше було встановлено, що батьківський штам 2435 відрізняється дуже високою чутливістю до катаболітної репресії, оптимальна для нього концентрація глюкози в середовищі 0,07(Кілочок, 1988).

Досліджуємі штами П-29 та 2Р-15 значно відрізняються між собою по стафілолітичній та глікозидазній активності. Так, на середовищі ФС-2 з вмістом 0,66глюкози активність штаму П-29 відносно S.та M.досягала 1800 та 3500 од/мл, штаму 2Р-15 – відповідно 3800 та 6500 од/мл (рис. а,б). При дослідженні впливу зростаючих (від 1 до 5концентрацій глюкози на рівень літичної активності відносно тих же тест-культур було встановлено, що у штаму П-29 синтез стафілолізинів хоч трохи і знижується при 2глюкози, але залишається на тому ж рівні при подальшому збільшенні її концентрації. Що стосується глікозидаз, то їх інгибування також, як і у батьківського штаму 2435, зростає при збільшенні вмісту глюкози в ферментаційному середовищі (рис. 4в). Значно більше виражені ці зміни у штаму 2Р-15: слабе пригнічення синтезу стафілолізинів порівняно з контролем спостерігається також при 2глюкози, тоді як глікозидаз – тільки при 4При зростанні концентрації глюкози збільшення її інгибуючої дії не спостерігається ні відносно стафілолізинів, ні відносно глікозидаз (рис. 4г). Отримані дані свідчать про те, що у відібраного нами штаму 2Р-15 чутливість до інгибуючої дії глюкози значно знизилась. Його висока біосинтетична активність виявляється на середовищах з більшим вмістом глюкози (оптимальна її концентрація 1,1

З метою одержання більш повної характеристики селекціонованого штаму 2Р-15 були проведені дослідження закономірностей його росту та біосинтезу екстрацелюлярних ферментів порівняно з батьківським (2435) та вихідним (П-29) штамами (рис. 5). Встановлено, що на ферментаційних середовищах з оптимальними концентраціями глюкози досліджуємі штами мають схожу динаміку росту та біосинтезу різних груп ферментів. Штам 2Р-15 відрізняється самою високою швидкістю росту протягом всієї log-фази, включаючи період її затримки, та самим високим рівнем накопичення біомаси. Максимуми бактеріолітичних активностей у його культур зміщені, порівняно з батьківським штамом2435, на 12 годин. Слід відмітити, що хоч селекція проводилась нами під контролем стафілолітичної активності у відібраного штаму 2Р-15 зросла активність не тільки відносно S.(ендопептидази), а і M. (глікозидази), нелітичних протеаз та стимулятора росту.

Слід відмітити, що в ході селекції уже у штаму П-29 після регенерації протопластів було значно знижено, а потім втрачено дріжджелітичну активність. У штаму 2Р-15 дріжджелітична активність також відсутня. При дослідженні бактеріолітичного комплексу штаму 2Р-15 виявлені як кількісні, так і якісні зміни його складу порівняно з батьківським штамом 2435. Фракціонування ферментного комплексу штаму 2Р-15, осадженого з культуральної рідини ацетоном, проводили на катіонообміннику КМ-серадекс С-50 (рис. ). Звертає на себе увагу, що протеолітичні ферменти з казеінолітичною активністю розподілені по всьому профілю елюції білка. В зоні градієнтної елюції виявлено 11 піків стафілолітичної активності. Вони мають різний рівень активності, а також в тій чи іншій мірі – казеінолітичну. Слід відмітити, що фракції I-V мутантного штаму 2Р-15 виявлені при тих же значеннях градієнту елюції (0,4 – ,6 М буфера), як і ендопептидази батьківського штаму 2435. Їх питома літична активність в 2,5 – разів вища і характеризується рівнями 10000 – од/мг білка. В загальному пулі екстрацелюлярних білків штаму 2Р-15 зросла частка літичних ферментів з 10 до 23,7

Одержані дані свідчать про те, що у мутантного штаму 2Р-15 висока бактеріолітична активність обумовлена зростанням потреби в глюкозі, зниженням чутливості до інгибуючої її дії, збільшенням кількості літичних протеаз та зростанням їх питомої активності.

Таким чином, на підставі результатів власних досліджень можна зробити висновок, що використані нами рифампіцин для відбору мутантів та попередня оцінка активності різних клонів сприяли зниженню трудоємкості селекції, а відібраний високоактивний мутант 2Р-15 являється перспективним в плані створення на його основі промислового виробництва нового препарату літичних ферментів, який відрізняється широким спектром лізуючої дії та рістстимулюючими та імунотропними властивостями.

Висновки

1. У продуцента Streptomyces recifensis var. lyticus встановлено взаємозв’язок між морфологічною мінливістю та літичною активністю, яка залежить від вмісту в популяції варіантів 1-го морфологічного типу.

2. Показано принципову можливість застосування рифампіцину в селекції продуцента, а також здатність його при внесенні в агаризоване середовище – стабілізувати літичну активність рифампіциностійких мутантів.

3. В результаті трьохступінчатої селекції отримано штам 2Р-15, активність якого, порівняно з батьківським штамом, відносно клітин Staphylococcus aureus та Micrococcus lysodeikticus зросла в 2,5 та 5 разів.

4. Штам 2Р-15 характеризується збільшенням кількості антибіотикостійких спор в популяції (на 2,0–2,5 порядка), показника середньої літичної активності клонів (в 1,4 рази), плюс-варіантів (до 45,4зниженням коефіцієнту мінливості (до 13,5

5. На основі методу математичного планування експерименту проведено оптимізацію ферментаційного середовища. Отримано два нових його варіанта, які забезпечили збільшення літичної активності відбираємих мутантів в 7–10 разів.

6. У селекціонованого штаму 2Р-15 порівняно з батьківським штамом знижено чутливість до інгибуючої дії глюкози в 3–4 рази.

7. Встановлено, що в процесі селекції мутантний штам 2Р-15 втратив дріжджелітичну активність. В пулі його екстрацелюлярних білків збільшилась частка та кількість літичних протеаз (від 5 у батьківського штаму до 11), а також питома їх активність.

Список публікацій по темі дисертації

1. Жерносекова И.В., Кукушкина Н.В., Бабенко Ю.С. Влияние этония на активность лизиса клеток стафилококка ферментным препаратом Streptomyces recifensis var. lyticus 2435 //Антибиотики и химиотерапия. – 1990. – 35, № 11. – С. 10–13.

2. Жерносекова И.В., Килочек Т.П., Бабенко Ю.С., Винников А.И. Увеличение активности литических ферментов у рифампициноустойчивых мутантов Streptomyces recifensis var. lyticus // Мікробіол. журн. – 1999. – 61, №2. – С. 15–24..

3. Жерносекова И.В., Килочек Т.П. Влияние глюкозы на биосинтез экстрацеллюлярных ферментов Streptomyces recifensis var. lyticus и его мутантами // Мікробіол. журн. – 2000. – 62, №2. – С. –26.

4. Жерносекова И.В., Соколова И.Е., Килочек Т.П., Черногор Н.П. Характеристика бактериолитического ферментного комплекса рифампициноустойчивого мутанта Streptomyces recifensis var. lyticus 2Р-15 // Бюлетень інституту сільськогосподарської мікробіології. – Чернігів, 2000. – №7. – С. 31–32.

5. Куликова Т.Я., Жерносекова И.В. Селекция продуцента литических ферментов с использованием методов протопластирования и отбора рифампициноустойчивых мутантов // Мікробіол. журн. – 1994. – 56, №2. – С. 76.

6. Килочек Т.П., Жерносекова И.В. Оптимизация питательной среды для биосинтеза комплекса экстрацеллюлярных ферментов Streptomyces recifensis var. lyticus // Микроорганизмы и их метаболиты в народном хозяйстве. Тез.докл. III-ей интерн. конф. – Кишинев, 1996. – С. 18–19.

7. Соколова И.Е., Жерносекова И.В. Состав внеклеточных ферментов у рифампициноустойчивого варианта Streptomyces recifensis var. lyticus // V Міжнародна конф. Франція та Україна. Тези доповідей. – Дніпропетровськ, 1998. – 2, ч. ІІІ. – С. –99.

8. Бабенко Ю.С., Килочек Т.П., Черногор Н.П., Соколова И.Е., Жерносекова И.В. Лизорецифин – новый биопрепарат с антимикробным, ростстимулирующим действием и перспективы его практического использования // Микроорганизмы и их метаболиты в народном хозяйстве. Тез. докл. III-ей интерн. конф. – Кишинев, 1996. – С. –72.

Жерносєкова І.В. Мінливість продуцента літичних ферментів Streptomyces recifensis var. lyticus та його селекція – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології та вірусології НАН України, Київ, 2002.

Дисертацію присвячено дослідженню мінливості продуцента літичних ферментів та підвищенню його активності на основі відбору рифампіциностійких мутантів. Попереднє визначення активності по зонам деградації субстрату надало можливість скоротити кількість відбираємих варіантів. У більшості з них в умовах глибинної ферментації літична активність перевищувала вихідні штами на 20 – На основі використання регенеранта П-29 та рифампіцину на двох ступенях селекції відібрано штам 2Р-15, літична активність якого досягла відносно S. 5800 –  од/мл та M. – 8000 –  од/мл, що перевищує активність батьківського штаму відповідно в 2,5 та 5 разів. Показано принципову можливість використання рифампіцину для стабілізації активності відібраних мутантів шляхом внесення його в оптимальних концентраціях в агаризоване середовище вирощування.

У мутантного штаму 2Р-15 чутливість до інгибуючої дії глюкози значно знижено, він потребує збільшення вмісту глюкози в середовищі. В складі бактеріолітичного комплексу виявлено кількісні та якісні зміни: в пулі екстрацелюлярних білків зросла частка літичних протеаз, їх кількість та питома активність. Високоактивний штам 2Р-15 являється перспективним для виготовлення нового препарату літичних ферментів.

Ключові слова: стрептоміцет, літичні ферменти, ступінчата селекція, рифампіцин, мутантний штам 2Р-15.

Жерносекова И.В. Изменчивость продуцента литических ферментов Streptomyces recifensis var. lyticus и его селекция - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев, 2002.

Диссертация посвящена изучению S. recifensis var. lyticus, продуцента комплекса